Name: Drosophila Immunohistochemia poczwarki brzucha (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemii nabłonka brzusznego poczwarki Drosophila. Protokół obejmuje dyssekcję, fiksację i barwienie przeciwciałami w celu wizualizacji ekspresji białek oraz badania morfogenezy nabłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu przyznanego przez National Science Foundation.

1. Dzień 1
Przed rozpoczęciem: 
Zdrową populację much należy utrzymywać zgodnie ze standardowymi protokołami hodowlanymi: osobniki dorosłe należy usunąć z butelek lub fiolek po 3-4 dniach od zniesienia jaj i pozwolić na rozwój w stałej temperaturze, aż wędrujące larwy 3rd stadium rozpoczną pupariację. Przejście ze stadium larwalnego w poczwarkowe jest zaznaczone przez formowanie się przedpoczwarków (przyjmowane jako 0 godzin po formowaniu puparium-APF). Nieruchome poczwarki odróżnia się od starszych poczwarek białym zabarwieniem, a od larw, które nie rozpoczęły jeszcze pupariacji, podłużnym, zaokrąglonym kształtem oraz wystawaniem przetchlinek przednich.
Będziesz potrzebować:
<ul>
<li>Pędzel do zbierania poczwarek</li>
<li>Komora wilgotna do hodowli poczwarek: szalka Petri wyłożona zwilżonym ręcznikiem papierowym i przykryta papierem filtrującym, oznakowana zgodnie z różnymi punktami czasowymi zbioru, genotypem lub płcią poczwarek</li>
<li>1X roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do przemywania poczwarek</li>
</ul>
Zbiór, hodowla i wyznaczanie stadium poczwarek
<ol>
<li>Używając zwilżonego pędzla, delikatnie przenieś poczwarki w 0 godzin APF z butelek/fiolek hodowlanych i umieść je w pokrywie komory wilgotnościowej. </li>
<li>Za pomocą pędzla i 1X PBS delikatnie obmyj poczwarki, aby usunąć zanieczyszczenia z poczahwy</li>
<li>W razie potrzeby posegreguj poczwarki według płci. Do segregacji płci można wykorzystać przymordyt gonad poczwarek. Przymordyty gonad samców stanowią boczna para przezroczystych dysków, łatwo widocznych przez kutykulę poczwarki w około 2/3 długości ciała 5. Przymordyty gonad samic są mniejsze i trudniejsze do zidentyfikowania.</li>
<li>Umieść poczwarki w odpowiednio oznakowanych miejscach w komorze wilgotnościowej i przywróć stałą temperaturę. Hoduj do odpowiedniego punktu czasowego rozwoju.</li>
</ol>
2. Dzień 2: Disekcja, fiksacja i inkubacja z przeciwciałem pierwotnym
Przed rozpoczęciem:
Będą potrzebne:
<ul>
<li>Stereomikroskop sekcyjny</li>
<li>Pincety chirurgiczne</li>
<li>Skalpel chirurgiczny z ostrzami nr 11</li>
<li>Dwie szklane płytki z dziewięcioma wgłębieniami (Corning produkt # 7220-85)<ul>
<li>Wypełnij wgłębienia jednej płytki 1X PBS: służy ona do płukania wypreparowanych poczwarek</li>
<li>Wypełnij wgłębienia drugiej płytki buforem utrwalającym</li></ul></li>
<li>Komora wilgotna do inkubacji przeciwciał. Stosujemy plastikowe szczelne pojemniki śniadaniowe wyłożone zwilżonymi ręcznikami papierowymi.</li>
<li>Bufor utrwalający: 1x PBS, 4% paraformaldehydu, 0,2% kwasu deoksycholowego (do permeabilizacji)</li>
<li>Platforma sekcyjna: czyste szkiełko przedmiotowe z przyklejonym do jednej strony kawałkiem taśmy dwustronnej</li>
<li>1X PBS</li>
<li>Pipeta p100 lub p200</li>
</ul>
Disekcja
<ol>
<li>Używając pęsety, delikatnie wyjmij poczwarki pojedynczo i umieść je na platformie do sekcji, tak aby przedni koniec poczwarki był skierowany w stronę najszerszej krawędzi taśmy. Jeśli poczwarki są zbyt mokre, najpierw osusz je ręcznikiem papierowym.</li>
<li>Zanim poczwarki całkowicie przylgną do taśmy, użyj pędzla, aby je odpowiednio ustawić.</li>
<li>Pozostaw poczwarki do wyschnięcia na powietrzu i przywarcia do taśmy (5-10 minut).</li>
<li>Za pomocą skalpela chirurgicznego przetnij każdą poczwarkę bilateralnie. Najlepiej wykonać to jednym szybkim cięciem od przedniego do tylnego końca poczwarki. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, cięcie przetnie obie pary przetchwyków przednich i tylnych. Sekcjonuj nie więcej niż 10 poczwarek jednocześnie, ponieważ szybkie mycie i oczyszczanie próbek jest niezbędne, aby zapobiec proteolitycznemu uszkodzeniu tkanek.</li>
<li>Używając pędzla, przenieś niewielką ilość 1X PBS na każdą rozciętą poczwarkę, aby odkleić je od taśmy.</li>
</ol>
Czyszczenie, fiksacja i inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
<ol start="6">
<li>Za pomocą pęsety chirurgicznej chwyć połowę przedniej części pojedynczej poczwarki i natychmiast zanurz ją w dołku naczynia do płukania. Platformę do sekcji na stoliku mikroskopu należy zastąpić naczyniem do płukania. Pokrywa poczwarek powinna pozostać na próbce do czasu zakończenia obróbki i przygotowania próbek do montowania.</li>
<li>Trzymając nadal połowę poczwarki, użyj pipetora, aby delikatnie wypłukać tkanki wewnętrzne odwłoka. Zbyt duże ciśnienie podczas płukania może doprowadzić do utraty komórek nabłonkowych.</li>
<li>Bezzwłocznie przenieś oczyszczoną połowę poczwarki do buforu utrwalającego w temperaturze pokojowej i w ten sam sposób opracuj pozostałe połowy poczwarek. Dzięki praktyce sekcja i płukanie 20 połówek poczwarek powinno zająć mniej niż 5 minut.</li>
<li>Inkubuj poczwarki w buforze utrwalającym w temperaturze pokojowej przez 1 (jedną) godzinę.</li>
<li>Płucz utrwalone poczwarki 3x przez pięć minut w 1X PBS.</li>
<li>Próbki można natychmiast poddać obróbce w celu przeprowadzenia immunohistochemii lub przechowywać w 100% etanolu w temperaturze -20°C do 3 miesięcy bez utraty komórek lub reaktywności epitopów.</li>
<li>Aby przechowywać próbki, należy je równoważyć poprzez serię rozcieńczeń PBS:EtOH (3:1, 1:1, 1:3) w temperaturze pokojowej przez 20 minut w każdym rozcieńczeniu przed przeniesieniem do 100% EtOH.</li>
<li>Przed przystąpieniem do immunohistochemii próbki muszą zostać ponownie zrównoważone w PBS poprzez odwrotną serię rozcieńczeń.</li>
<li>Blokuj próbki w 1x PBS (z dodatkiem 2% albuminy surowicy bydlęcej) przez 1 (jedną) godzinę przed dodaniem przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
<li>Inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w 1X PBS przez noc w temperaturze 4°C bez kołysania.</li>
</ol>
3. Dzień 3: Inkubacja z przeciwciałem wtórnym, montowanie i obrazowanie
Przed rozpoczęciem:
Będziesz potrzebować:
<ul>
<li>Dwie pęsety chirurgiczne</li>
<li>Media montażowe (glicerol, Vectashield [Vector Labs] lub Slowfade Gold [Invitrogen])</li>
<li>Przedmioty szkiełka z wgłębieniem (0.8 mm)</li>
<li>Kryszalki (24 x 40 mm)</li>
</ul>
Inkubacja z przeciwciałem wtórnym i montowanie preparatu:
<ol>
<li>Przemyć próbki 3 razy po 10 minut każdorazowo w 1x PBS</li>
<li>Blokować próbki w 1x PBS (uzupełnionym o 2% albuminy surowicy bydlęcej) przez 1 (jedną) godzinę przed dodaniem przeciwciała wtórnego.</li>
<li>Inkubować z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w 1X PBS w temperaturze pokojowej, w ciemności, bez wytrząsania, przez 3 (trzy) godziny.</li>
<li>Przemyć próbki 3 razy po 10 minut każdorazowo w 1x PBS</li>
<li>W razie potrzeby przeprowadzić barwienie kontrastowe poczek (np. barwienie jąder komórkowych DAPI [4',6-diamidino-2-phenylindole] rozcieńczonym w PBS przez 10 minut).</li>
<li>Równowagować próbki (przez minimum 30 minut) w odpowiednim medium przed montowaniem.</li>
<li>Przygotować preparat na szkiełku. Morfologia poczek uniemożliwia montowanie na płasko. Próbki montuje się w zagłębieniu szkiełka z wgłębieniem (szkiełka kroplowego) do obrazowania. Nalać 75-100ul medium montującego do wgłębienia. Na jednym szkiełku można zamontować kilka próbek.</li>
<li>Przed montowaniem należy usunąć z próbek powłokę pocieki. Chwycić poszczególną powłokę pocieki w części przedniej, uważając, aby nie uchwycić wewnętrznej błony pocieki.</li>
<li>Drugą parą pincet delikatnie chwycić wewnętrzną błonę pocieki za głowę i wyjąć ją z powłoki pocieki.</li>
<li>Niezwłocznie przenieść próbkę do wgłębienia i kontynuować obróbkę kolejnych próbek.</li>
<li>Za pomocą sondy lub pincety ułożyć próbki równomiernie we wgłębieniu, powierzchnią boczną skierowaną do góry. Pojawiające się pęcherzyki powietrza można usunąć za pomocą sondy.</li>
<li>Delikatnie nałożyć szkiełko nakrywowe na próbki, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Próbki przygotowane zgodnie z niniejszym protokołem zachowują ogólną morfologię brzucha dorosłego osobnika. Stosy obrazów można rzutować w celu wygenerowania obrazu dwuwymiarowego lub zastosować rendering 3-D, aby zbadać topologię brzucha.
<img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna zarodka Drosophila ukazująca wzorce ekspresji genów; wynik mikroskopowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Produkty genów segmentacyjnych u poczwarki Drosophila. Ekspresję białka Wingless oraz Engrailed (En-gal4:uas-GFP) zwizualizowano 26 godzin po utworzeniu puparium (APF) przy użyciu przeciwciał mysich przeciwko Wg (4D4: Iowa Hybridoma Bank) oraz przeciwciał przeciwko GFP. Powiększenie 10x, strona przednia po lewej, strona grzbietowa u góry. Jądra komórkowe wybarwiono DAPI. 
Wykonano projekcję stosów składających się z około 50 obrazów (ΔZ między przekrojami wynosi 2,5μm).

<ol><li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li>
<li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li>
<li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangements%2C+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li>
<li>Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Techniki przedstawione w tym filmie mogą być wykorzystywane do przygotowania poczek Drosophila z różnych etapów rozwoju. Poczeki przetwarzane w okresie od 24 h APF do 32 h APF są najbardziej podatne na utratę komórek z nabłonka. Stosowanie detergentów (takich jak Triton X-100 i Tween-20) podczas przedłużonych etapów inkubacji zwiększa prawdopodobieństwo utraty komórek, dlatego nie jest zalecane. Zamiast tego, jako detergent w początkowym etapie fixacji stosuje się kwas deoksylocholowy. Wszystkie kolejne etapy wykonuje się w 1X PBS bez detergentu. Ponadto, kołysanie próbek podczas przedłużonych etapów inkubacji zwiększa utratę komórek i należy go unikać.
Próbki można obrazować z wykorzystaniem technik mikroskopii konfokalnej. Jednak poczwarki Drosophila przetworzone zgodnie z opisanym protokołem mogą być również obrazowane przy użyciu systemu mikroskopii z ustrukturyzowanym oświetleniem, co pozwala uzyskać jakość obrazu porównywalną z technikami konfokalnymi.

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop do sekcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta chirurgiczna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpel chirurgiczny z ostrzami nr 11</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane płytki z dziewięcioma wgłębieniami</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowa do hodowli poczek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X bufor fosforanowo-solny (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpel chirurgiczny nr 11</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>taśma dwustronna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do fiksacji: 1x PBS, 4% paraformaldehydu, 0,2% kwasu deoksycholowego (do permeabilizacji)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta p100 lub p200</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe z wgłębieniami (0,8 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemia odwłoka poczwarki drosophila

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Odwłok poczwarki Drosophila jest uznanym modelem badawczym w analizie morfogenezy nabłonkowej oraz rozwoju morfologii wykazujących dymorfizm płciowy 1-3. Podczas poczwarzenia, które trwa około 96 godzin (w 25 °C), proliferujące populacje komórek imaginalnych zastępują larwalny naskórek, tworząc dorosłe segmenty odwłoka. Komórki imaginalne te, powstające podczas embriogenezy, występują w formie bocznych par gniazd histoblastów w każdym segmencie odwłoka larwy. Cztery pary gniazd histoblastów dają początek dorosłej kutykuli grzbietowej (gniazda grzbietowe przednie i tylne), kutykuli brzusznej (gniazda brzuszne) oraz przetchawicznym otworom związanym z każdym segmentem (gniazda spirakularne) 4. Po przejściu w stadium poczwarki komórki diploidalne te (odróżnialne wielkością od większych poliploidalnych komórek naskórka larwalnego – LECs) rozpoczynają stereotypowy proces proliferacji, migracji i zastępowania LECs. Do badania roli szlaków genetycznych zaangażowanych w morfogenezę dorosłego odwłoka można wykorzystać różnorodne narzędzia molekularne i genetyczne. Ostateczne fenotypy osobników dorosłych analizuje się zazwyczaj po wypreparowaniu kutykuli odwłoka dorosłego owada. Jednak badanie leżących u podstaw procesów molekularnych wymaga analiz immunohistochemicznych nabłonka poczwarki, co wiąże się z określonymi trudnościami. Dynamiczna czasowo morfogeneza oraz interakcje dwóch odrębnych populacji nabłonkowych (larwalnej i imaginalnej) tworzą kruchą tkankę podatną na nadmierną utratę komórek podczas dysekcji i późniejszego przetwarzania. Opracowaliśmy metody dysekcji, utrwalania, montowania i obrazowania nabłonka odwłoka poczwarki Drosophila do badań immunohistochemicznych, które pozwalają na uzyskanie spójnych, wysokiej jakości próbek odpowiednich do mikroskopii konfokalnej lub standardowej mikroskopii fluorescencyjnej.

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Odwłok poczwarki *Drosophila* jest uznanym systemem modelowym do badania morfogenezy nabłonkowej oraz rozwoju cech dymorficznych płciowo...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie nabłonka brzusznego muszki *Drosophila* do immunohistochemii. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie obustronnej sekcji poczwarki *Drosophila* i usunięcie organów wewnętrznych w taki sposób, aby do błony poczwarki przytwierdzone pozostały jedynie komórki nabłonka brzusznego, składającego się z proliferujących dysków imaginalnych, osteoblastów oraz komórek nabłonkowych larwalnych.Następnie tkankę utrwalono i inkubowano z przeciwciałami usuniętymi z zewnętrznej osłonki źrenicy, a następnie poddano wizualizacji za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, aby ukazać morfologię ogólną nabłonka jamy brzusznej oraz ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania. Cześć, jestem John Yoder. Moje laboratorium znajduje się na Uniwersytecie Alabamy w Departamencie Nauk Biologicznych.Witajcie, nazywam się we won. Jestem studentem w laboratorium Yoda. Dzisiaj zaprezentujemy naszą metodę sekcji poczwarki Drosophila oraz immunohistochemii odwłoka poczwarki Drosophila.Metodę tę można wykorzystać do badania procesów morfogenezy nabłonka i reorganizacji tkanek. W szczególności stosujemy tę technikę do badania rozwoju dymorfizmu płciowego morfologii odwłoka dorosłej muszki owocówki drosophila. Z fiolki z populacją w temperaturze 25 °C, pozbawionej osobników dorosłych, należy wyłonić niedawno unieruchomione poczwarki, których kutykula nie zaczęła jeszcze ciemnieć; przyjmuje się, że znajdują się one w punkcie zero godzin PF. Za pomocą zwilżonego pędzla delikatnie przenieść te poczwarki i umieścić je na pokrywie komory nawilżającej. Jeśli jest to konieczne, użyć pędzla i PBS, aby delikatnie wypłukać zanieczyszczenia z łupin poczwerek.Posortuj pupy według płci w zerowej godzinie. Pierwotniaki goad u samców PF są łatwo widoczne przez kutykulę źrenicy. U samic pierwotniaki goad są mniejsze i trudniejsze do zidentyfikowania, znajdując się mniej więcej w dwóch trzecich długości ciała.Następnie należy umieścić pupę na zwilżonym papierze filtracyjnym w komorze uwilgotnionej. Należy założyć pokrywkę i przenieść zestaw do środowiska o stałej temperaturze. Po osiągnięciu przez zwierzęta interesującego etapu rozwoju, należy przystąpić do sekcji.Należy pamiętać, że gałki oczne przetwarzane od 24 do 32 godzin po zapłodnieniu (A PF) są najbardziej podatne na utratę komórek nabłonkowych podczas dalszego przetwarzania. W celu przygotowania do sekcji należy nakleić kawałek dwustronnej taśmy wzdłuż jednej krawędzi przezroczystego szkiełka przedmiotowego. Następnie za pomocą pęsety należy delikatnie chwycić każdą gałkę oczną między sferami przednimi i umieścić je na taśmie stroną grzbietową do góry.Ustaw w ten sposób maksymalnie 10 PPE, aby uniknąć zbyt wolnej pracy. PPE całkowicie utwardzą się w ciągu od pięciu do 10 minut, lecz przed tym momentem należy użyć pędzla, aby rozsunąć je równomiernie i ułożyć równolegle. Zbyt długie suszenie na tym etapie obniży ich jakość.Dlatego należy działać szybko. Teraz za pomocą skalpela chirurgicznego przeprowadź dwustronną sekcję każdej poczwarki A. Wykonaj jedno szybkie cięcie od przedniego do tylnego końca poczwarki.Jeśli cięcie zostanie wykonane prawidłowo, przetnie ono zarówno przednie, jak i tylne pary sferyczne, tworząc symetryczne połówki lewą i prawą, co pozwoli poluzować poczwarkę z taśmy. Używając pędzla i pincety chirurgicznej, nanieś niewielką ilość PBS na każdą rozsektowaną poczwarkę. Chwyć jedną połowę poczwarki za koniec przedni i zanurz ją w naczyniu płuczącym wypełnionym PBS na stole mikroskopu sekcyjnego; trzymając nadal poczwarkę, użyj pipetora, aby delikatnie wypłukać tkankę wewnętrzną, wpompowując PBS do jamy brzusznej.Należy unikać stosowania zbyt dużego nacisku, aby nie doprowadzić do utraty komórek z nabłonka. Natychmiast zanurz oczyszczoną tkankę w 400 µL buforu utrwalającego o temperaturze pokojowej, a następnie oczyść wszystkie połówki poczwarki. Wraz z nabyciem wprawy, sekcja i przemywanie 20 połówek PU powinno zająć mniej niż pięć minut.Pozostaw pąki do inkubacji w buforze utrwalającym w temperaturze pokojowej przez godzinę, a następnie przemyj je trzykrotnie w 400 µL PBS przez pięć minut na każde płukanie. Aby przechowywać próbki, najpierw przemyj je dwukrotnie w 100% metanolu, a następnie przenieś je do 100% etanolu w celu przechowywania. Próbki te można przechowywać w 100% etanolu w temperaturze -20 °C do trzech miesięcy bez utraty komórek lub reaktywności epitopów.Aby przetworzyć przechowywane próbki, należy je najpierw rehydratować w PBS poprzez serię stężeń etanolu. Następnie należy przeprowadzić immunohistochemię, blokując próbki w PBS z 2% BSA przez godzinę w temperaturze pokojowej, bez mieszania na wytrząsarce. Mieszanie próbek znacząco zwiększa utratę komórek z nabłonka jamnego.Następnie należy zastąpić roztwór blokujący przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym do odpowiedniego stężenia w PBS. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsius, bez kołysania i w zamkniętej komorze nawilżonej, aby zapobiec odparowaniu następnego dnia. Próbki należy przemyć trzykrotnie w PBS bez kołysania, przez 10 minut podczas każdego przemywania.Następnie blokować próbki przez godzinę bez kołysania w PBS z 2%BSA. Roztwór blokujący zastąpić przeciwciałem wtórnym w PBS o temperaturze pokojowej. Następnie inkubować próbki w ciemności przez trzy godziny bez kołysania.W razie potrzeby po zastosowaniu przeciwciała wtórnego przeprowadź trzy etapy płukania w PBS, trwające po 10 minut każdy. Wykonaj barwienie kontrastowe preparatu; na przykład jądra komórkowe można zabarwić poprzez 10-minutową inkubację w DPI rozcieńczonym w PBS. Następnie zamknij próbki w medium montażowym na co najmniej 30 minut.Aby zamocować próbki, chwyć każdą osłonkę źrenicy od przodu, unikając kontaktu z wewnętrzną błoną źrenicy za pomocą drugiej pary pęsety. Delikatnie chwyć wewnętrzną błonę źrenicy za głowę. Następnie ostrożnie wyciągnij próbkę z osłonki źrenicy.Przenieś próbkę unca na szkiełko z wgłębieniem zawierające od 75 do 100 µL medium montażowego. Na jednym szkiełku można zamocować kilka próbek. Następnie za pomocą sondy i pęsety rozmieść próbki równomiernie we wgłębieniu.Następnie obrócimy je tak, aby ich powierzchnie boczne były skierowane do góry, i usuniemy wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą sondy. Na koniec ostrożnie nałożymy szkiełko nakrywkowe na próbki, dbając o to, aby podczas przygotowania nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Mikroskopia z ustrukturyzowanym oświetleniem będzie porównywalna do technik konfokalnych.Jest to projekcja 50 obrazów konfokalnych z odstępem 2,5 mikrona między przekrojami. Tkanka znajduje się w 26 godzinie PF, a barwienie pokazuje wzorzec ekspresji białka wingless i GFP sterowanego przez grail oraz jądra komórkowe. Strona przednia znajduje się po lewej stronie, a cechy grzbietowe w górnej części ekranu.Film ten demonstruje, w jaki sposób procedura ta pozwala zachować ogólną morfologię próbek. Umożliwia to tym samym trójwymiarową rekonstrukcję stosów obrazów. Kilkadziesiąt uczniów Westa może zostać utrwalonych i umieszczonych w buforze utrwalającym w czasie krótszym niż 30 minut.Ponadto próbki przygotowane zgodnie z tym protokołem nadają się do hybrydyzacji in situ, co czyni go cenną metodą w badaniach ekspresji genów.

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drosophila Immunohistochemia odwłoka poczwarki

Niniejszy protokół demonstruje sposób wykonania immunohistochemii na wypreparowanych larwach Drosophila.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Celem tej techniki jest umożliwienie naukowcom przeprowadzenia sekcji, barwienia immunologicznego i montażu krążków z oczami poczwarek Drosophila melanogaster w każdym wieku.

Wypreparowanie i montaż krążków ocznych poczwarki Drosophila

Przedstawiono protokół barwienia immunologicznego na zarodkach mszyc, w którym omówiono krytyczne warunki zmniejszania barwienia tła i zwiększania przepuszczalności tkanek. Warunki te zostały specjalnie opracowane do skutecznego wykrywania ekspresji białek w tkankach embrionalnych mszyc.

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Zdolność do dokładnego wykrywania transkryptów lub białek w tkankach Drosophila jest kluczowa dla badania ich obfitości i lokalizacji związanej z procesem rozwoju. Oto opis prostej procedury preparowania skrzydeł poczwarki. Skrzydełka te mogą być używane jako próbki w kilku technikach (immunohistochemia, test PCR itp.).

Szybka i skuteczna metoda preparowania skrzydeł poczwarek Drosophila nadająca się do immunodetekcji lub testów PCR

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje przygotowanie i wizualizację utrwalonej tkanki poczwarki Drosophila notum. Może być stosowany zarówno do nienaruszonej, jak i zranionej tkanki, a oryginalna architektura tkanki zostaje zachowana. Procedury preparowania, mocowania i barwienia są opisane w tym artykule.

Preparowanie, naprawianie i wizualizacja poczwarki Drosophila notum

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Poznaj metodę immunohistochemii nabłonka brzusznego poczwarki Drosophila. Protokół obejmuje dyssekcję, fiksację i barwienie przeciwciałami w celu wizualizacji ekspresji białek oraz badania morfogenezy nabłonka.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Przeglądaj więcej filmów