JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:36 min. • July 8th, 2025
Weź utrwalony odcinek hipokampa szczura zawierający interneuron wypełniony biocytyną, cząsteczką sprzężoną z biotyną.
Następnie dodaj roztwór zawierający białka blokujące i niejonowy detergent, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu i przepuszczalności neuronów.
Inkubuj z pierwotnym przeciwciałem skierowanym przeciwko specyficznym receptorom kannabinoidowym na interneuronach.
Przemyć buforem w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.
Następnie dodaj barwnik fluorescencyjny sprzężony ze streptawidyną i przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem.
Podczas inkubacji streptawidyna silnie wiąże się z biocytyną, umożliwiając wizualizację interneuronu wypełnionego biocytyną, podczas gdy przeciwciało drugorzędowe celuje w przeciwciała pierwotne związane z receptorem na interneuronach.
Przepłukać buforem, usuwając niezwiązane cząsteczki.
Teraz zamontuj sekcję za pomocą wodnego nośnika montażowego. Umieść szkiełko nakrywkowe i zamknij je.
Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zwizualizuj ekspresję interneuronu wypełnionego biocytyną i receptora kannabinoidowego, umożliwiając analizę morfologii interneuronu i rozmieszczenia receptorów.
Zamknij tkanki 10% serum blokującego na godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie należy inkubować skrawki w pierwotnym przeciwciałie CB1R w temperaturze pokojowej przez noc, aby zidentyfikować ekspresję receptora kannabinoidowego typu pierwszego. Następnie umyj skrawki mózgu trzy razy po 10 minut w 0,1 molowym PBS. Streptawidyna i przeciwciało drugorzędowe przeciwko pierwszemu przeciwciału pierwszorzędowemu są dodawane do płytki studzienki i przechowywane przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie inkubuj skrawki w sprzężonym czerwonym barwniku streptawidyny w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc w ciemności, aby odsłonić biocytynę. Następnie umyj skrawki mózgu trzy razy po 10 minut każda w 0,1 molowym PBS. Aby chronić fluorescencję i ułatwić ponowne barwienie w przyszłości, zamontuj sekcje w wodnym podłożu montażowym i uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych przezroczystym lakierem do paznokci.