JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:26 min • July 8th, 2025
Zacznij od mózgów transgenicznych much Drosophila, zawierających różne typy komórek glejowych zawierających specyficzny dla komórek system rekombinazy.
Napędza ekspresję białka powierzchniowego komórki połączonego z różnymi epitopami antygenowymi na tym samym typie komórek.
Potraktuj tkankę utrwalaczem, aby usieciować białka i zachować architekturę tkanki.
Umyć, aby usunąć nadmiar utrwalacza.
Dodaj białka blokujące, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania, aby zmniejszyć barwienie tła.
Inkubuj tkankę z pierwszorzędowym koktajlem przeciwciał, który wiąże się z różnymi epitopami wyrażającymi się na komórkach glejowych.
Przemyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał pierwszorzędowych.
Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
Przemyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.
Zamontuj mózg w przekładce obrazowej i umieść szkiełko nakrywkowe. Przekładka tworzy komorę dla tkanki, zachowując jej trójwymiarową strukturę.
Różne komórki tego samego typu glejowego znakowane różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem pozwalają zrozumieć interakcje komórka-komórka.
Przenieś izolowane mózgi za pomocą końcówki pipety P10 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów z roztworem utrwalającym. Nigdy nie dotykaj mózgu za pomocą kleszczy. Inkubować tkanki chronione przed światłem. Unikaj zasysania mózgu podczas przenoszenia roztworu.
Aby usunąć utrwalacz, użyj trzech lub więcej 15-minutowych myć roztworem myjącym. Następnie zablokuj tkanki roztworem blokującym na 30 minut lub dłużej. Następnie zastąp roztwór blokujący przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze płuczącym i inkubuj mózgi przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Aby usunąć przeciwciała pierwszorzędowe, należy użyć trzech 1-godzinnych płukań w roztworze do mycia. Następnie dodaj drugorzędowe przeciwciała sprzężone z fluoroforem w roztworze do płukania i inkubuj mózgi przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Aby całkowicie zmyć niezwiązane przeciwciała, należy użyć trzech 1-godzinnych płukań w roztworze myjącym, a następnie dłuższego płukania PBS.
Następnie zamontuj mózgi. Przygotuj dwa szkiełka nakrywkowe z przekładką obrazową. W przekładce i na dodatkowe szkiełko nakrywkowe nałóż 10 mikrolitrów podłoża montażowego ze środkiem zapobiegającym blaknięciu. Następnie, za pomocą pipety P10, przenieś mózgi do szkiełka nakrywkowego, umieszczając je obok pożywki wraz z odrobiną PBS. Nie pozwól, aby chusteczka wyschła.
Teraz ostrożnie przenieś mózgi do podłoża mocującego za pomocą pipety. Na koniec przenieś je na podłoże w przekładce i ułóż je za pomocą kleszczyków. Następnie usuń samoprzylepną wkładkę z przekładek i przymocuj szkiełko nakrywkowe. Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe niewielkim naciskiem za pomocą kleszczy i natychmiast przystąp do obrazowania.
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół obrazowania komórek glejowych w mózgach transgenicznych Drosophila z wykorzystaniem technik immunofluorescencji. Metoda ta podkreśla znaczenie zachowania architektury tkanki oraz minimalizacji tła w celu dokładnej wizualizacji oddziaływań międzykomórkowych.
Barwienie immunofluorescencyjne mózgów Drosophila o wysokiej rozdzielczości umożliwia precyzyjne obrazowanie pojedynczych komórek subpopulacji glejowych, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć w neurobiologii. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez umożliwienie bezpośredniej wizualizacji oddziaływań międzykomórkowych oraz ekspresji markerów specyficznych dla danej subpopulacji. Metoda ta ma na celu dostarczenie informacji wspierających decyzje dotyczące portfolio w przypadkach, gdy biologia gleju stanowi podstawę ścieżek istotnych dla przebiegu choroby.
Ten schemat immunofluorescencji integruje wczesne etapy odkrywania i walidacji celów, stanowiąc pomost do obrazowania przedklinicznego i screeningu fenotypowego w przypadkach, gdy zaangażowana jest biologia gleju.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026