Barwienie immunofluorescencyjne mózgów Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych

Zacznij od mózgów transgenicznych much Drosophila, zawierających różne typy komórek glejowych zawierających specyficzny dla komórek system rekombinazy.

Napędza ekspresję białka powierzchniowego komórki połączonego z różnymi epitopami antygenowymi na tym samym typie komórek.

Potraktuj tkankę utrwalaczem, aby usieciować białka i zachować architekturę tkanki.

Umyć, aby usunąć nadmiar utrwalacza.

Dodaj białka blokujące, aby zamaskować niespecyficzne miejsca wiązania, aby zmniejszyć barwienie tła.

Inkubuj tkankę z pierwszorzędowym koktajlem przeciwciał, który wiąże się z różnymi epitopami wyrażającymi się na komórkach glejowych.

Przemyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał pierwszorzędowych.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Przemyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.

Zamontuj mózg w przekładce obrazowej i umieść szkiełko nakrywkowe. Przekładka tworzy komorę dla tkanki, zachowując jej trójwymiarową strukturę.

Różne komórki tego samego typu glejowego znakowane różnymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem pozwalają zrozumieć interakcje komórka-komórka.

Przenieś izolowane mózgi za pomocą końcówki pipety P10 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 200 mikrolitrów z roztworem utrwalającym. Nigdy nie dotykaj mózgu za pomocą kleszczy. Inkubować tkanki chronione przed światłem. Unikaj zasysania mózgu podczas przenoszenia roztworu.

Aby usunąć utrwalacz, użyj trzech lub więcej 15-minutowych myć roztworem myjącym. Następnie zablokuj tkanki roztworem blokującym na 30 minut lub dłużej. Następnie zastąp roztwór blokujący przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze płuczącym i inkubuj mózgi przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Aby usunąć przeciwciała pierwszorzędowe, należy użyć trzech 1-godzinnych płukań w roztworze do mycia. Następnie dodaj drugorzędowe przeciwciała sprzężone z fluoroforem w roztworze do płukania i inkubuj mózgi przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Aby całkowicie zmyć niezwiązane przeciwciała, należy użyć trzech 1-godzinnych płukań w roztworze myjącym, a następnie dłuższego płukania PBS.

Następnie zamontuj mózgi. Przygotuj dwa szkiełka nakrywkowe z przekładką obrazową. W przekładce i na dodatkowe szkiełko nakrywkowe nałóż 10 mikrolitrów podłoża montażowego ze środkiem zapobiegającym blaknięciu. Następnie, za pomocą pipety P10, przenieś mózgi do szkiełka nakrywkowego, umieszczając je obok pożywki wraz z odrobiną PBS. Nie pozwól, aby chusteczka wyschła.

Teraz ostrożnie przenieś mózgi do podłoża mocującego za pomocą pipety. Na koniec przenieś je na podłoże w przekładce i ułóż je za pomocą kleszczyków. Następnie usuń samoprzylepną wkładkę z przekładek i przymocuj szkiełko nakrywkowe. Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe niewielkim naciskiem za pomocą kleszczy i natychmiast przystąp do obrazowania.