Ocena wychwytu glukozy w neuronach ruchowych larw Drosophila z podwyższonym metabolizmem glukozy

Umieść zmienne i zmutowane larwy Drosophila w oddzielnych naczyniach zawierających bufor wolny od glukozy.

Wypreparuj larwy, aby usunąć narządy wewnętrzne, odsłaniając ośrodkowy układ nerwowy lub OUN.

Ośrodkowy układ nerwowy obejmuje brzuszny rdzeń nerwowy, w którym znajdują się neurony ruchowe. U zmutowanych larw neurony te wykazują podwyższony metabolizm glukozy.

Neurony ruchowe w obu grupach wyrażają wewnątrzkomórkowe czujniki glukozy zawierające fluorofory dawcy i akceptora.

Umieść larwy pod mikroskopem konfokalnym. Po wzbudzeniu fluorofor dawcy emituje fluorescencję.

Zlokalizuj neurony ruchowe za pomocą tej fluorescencji.

Zastąp bufor roztworem uzupełnionym glukozą.

Glukoza dostaje się do neuronów, wiążąc się z czujnikami i wywołując zmianę konformacyjną, która zbliża do siebie dwa fluorofory.

Po wzbudzeniu akceptor pochłania energię emitowaną przez donor, zwaną transferem energii rezonansu fluorescencji lub FRET, i emituje fluorescencję.

Sygnał FRET koreluje z wychwytem glukozy. Wyższa intensywność sygnału akceptorowego u zmutowanych larw w porównaniu z kontrolą wskazuje na zwiększony metabolizm glukozy.

Przed przystąpieniem do sekcji włącz mikroskop obrazowy i lasery. Następnie zbierz wędrującą larwę w trzecim stadium rozwojowym. Opłucz go wodą podwójnie destylowaną i umieść w kropli buforu HL3 na wcześniej przygotowanym naczyniu wyłożonym elastomerem.

Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, użyj kleszczy, aby przypiąć przednie i tylne końce larwy, grzbietem do góry, ostrożnie rozciągając larwę wzdłuż za pomocą szpilek owadów. Za pomocą nożyczek do tęczówki pod kątem wykonaj nacięcie tuż nad tylną szpilką. Następnie wykonaj pionowe cięcie od nacięcia w kierunku przedniego końca larwy.

Po dodaniu kilku kropel buforu HL3, w razie potrzeby, należy usunąć tchawicę i resztę pływających narządów, nie naruszając przy tym pracy ośrodkowego układu nerwowego. Następnie przypnij klapy, rozciągając ścianę ciała, aby odsłonić ośrodkowy układ nerwowy, zachowując nienaruszony układ nerwowo-mięśniowy.

Do akwizycji obrazu należy użyć pionowego mikroskopu konfokalnego z 40-krotnie zanurzoną soczewką zanurzoną w wodzie. Następnie wybierz laser 405 nm, aby wzbudzić CFP. Następnie zoptymalizuj parametry akwizycji, takie jak szybkość skanowania, średnia, obiektyw, rozmiar otworka powiększenia i rozdzielczość przestrzenna. Dostosuj wzmocnienie tak, aby sygnał znajdował się w optymalnym zakresie dynamiki i używaj tych samych parametrów dla wszystkich genotypów.

Aby zobrazować neurony ruchowe w brzusznym rdzeniu nerwowym, umieść silikonowe naczynie z wypreparowaną próbką pod soczewką i opuść soczewkę tak, aby stykała się z trehalozą sacharozą HL3. Upewnij się, że obiektyw jest całkowicie zanurzony w buforze i w razie potrzeby dodaj więcej bufora.

Następnie, korzystając z kanałów CFP i FRET, ręcznie wybierz wybór optyczny składający się z co najmniej 6 neuronów ruchowych w ognisku, zlokalizowanych wzdłuż linii środkowej brzusznego rdzenia nerwowego. Następnie pobieraj obrazy co 10 sekund lub 10 minut. Te obrazy reprezentują linię bazową.

W celu stymulacji glukozy należy usunąć bufor HL3 zawierający trehalozę i sacharozę za pomocą pipety Pasteura i dodać 5-milimolowy bufor HL3 uzupełniony glukozą bez poruszania brzusznego rdzenia nerwowego. Następnie pobieraj obrazy co 10 sekund przez kolejne 10 minut.

Obrazy te reprezentują fazę stymulacji. Zapisz obrazy jako pliki .czi lub dowolny typ pliku obsługiwany przez oprogramowanie do obrazowania z nazwą pliku zawierającą datę, tło genetyczne, warunki eksperymentalne i używane kanały. Ponownie wykorzystano parametry do zobrazowania wszystkich genotypów.