Name: Zwiększanie wydajności cDNA z pojedynczych ilości mRNA w pojedynczych komórkach w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkryptazy przy użyciu mikrostrumieniowania akustycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Poznaj metodę zwiększania wydajności cDNA z mRNA pojedynczych komórek przy użyciu mikromiksera z akustycznym mikrostrumieniowaniem. Technika ta poprawia mieszanie w standardowych reakcjach odwrotnej transkryptazy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało sfinansowane przez National Health and Medical Research Council of Australia (grant projektowy nr 6288480) oraz Scobie and Clare MacKinnon Trust.

1. Mikromieszanie reakcji RT
<ol>
	<li>Przed przeprowadzeniem reakcji RT z zastosowaniem mikromieszania, doprowadź mikromieszacz do temperatury wymaganej dla reakcji RT.
		<ol>
				<li>Umieść mikromieszacz w inkubatorze ustawionym na 37°C (lub temperaturę zalecaną przez dostawcę zestawu RT) na co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem reakcji RT.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę RT zgodnie z instrukcjami dostawcy odwrotnej transkryptazy (np. MMTV-RT od firmy Promega, Omniscript od firmy Qiagen), z wyjątkiem ilości wejściowego całkowitego RNA, dla której należy zastosować ilości odpowiadające pojedynczej komórce (np. 0,1-1pg/μl) zamiast ilości rzędu ng-μg zalecanych przez dostawców.
		<ol>
				<li>Stosujemy standardowe sterylne, wolne od nukleaz cienkościenne probówki PCR o pojemności 20μL.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Bezpiecznie umieść probówki RT w mikromieszaczu natychmiast po ich przygotowaniu do mieszania. Mikromieszacz powinien pozostać w inkubatorze 37°C przez cały czas trwania reakcji RT.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią częstotliwość i amplitudę mikromieszania. W tym przykładzie stosujemy 150Hz.</li>
	<li>Włącz mikromieszacz i pozostaw go włączonego przez cały czas trwania reakcji RT (60 minut).</li>
	<li>Wyłącz mikromieszacz i wyjmij probówki RT po zakończeniu reakcji RT.</li>
	<li>Umieść probówki RT na lodzie i kontynuuj standardowo dalsze etapy, takie jak ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR lub PCR w czasie rzeczywistym).</li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki: 
Korzyścią z zastosowania mikromieszania w kontekście reakcji RT jest zwiększenie wydajności cDNA w porównaniu do stosowania innych metod mieszania (np. wstrząsania, wortexowania lub trituracji). Można to zaobserwować na przykład podczas następującej analizy cDNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR lub PCR w czasie rzeczywistym). Rysunek 2A ilustruje efekty mikromieszania przez pierwsze 5 minut (kolor niebieski, „micromixed5”) lub przez pełne 60 minut (kolor czerwony, „micromixed60”) w porównaniu z trituracją reakcji RT bezpośrednio przed inkubacją RT (kolor czarny, „trituration”). W tym przypadku objętość poprzedzającej reakcji RT wynosiła 25μL i zawierała 2,5pg całkowitego RNA. Powyżej przedstawiono krzywe qPCR z użyciem starterów zaprojektowanych do wykrywania cDNA reprezentującego mRNA Nurr-1, a poniżej wykreślono średnie ±BŁS liczby cykli potrzebnych do osiągnięcia 50% maksymalnej fluorescencji w 3 powtórzeniach tego samego eksperymentu. Gwiazdka oznacza różnicę statystycznie istotną (jednoczynnikowa analiza ANOVA z wielokrotnym porównaniem Tukey). Należy zauważyć, że mikromieszanie przez pierwsze 5 minut poprzedzającej reakcji RT spowodowało nieistotną poprawę w stosunku do trituracji, podczas gdy mikromieszanie przez pełne 60 minut poprzedzającej reakcji RT spowodowało istotną poprawę w stosunku do trituracji, której skala wynosiła średnio około 15 cykli qPCR.
Korzyści z mikromieszania można zauważyć również w analizie krzywych topnienia uzyskanych produktów qPCR. W eksperymencie przedstawionym na Rysunku 2B, mikromieszanie przez pełne 60 minut poprzedzającej reakcji RT doprowadziło do uzyskania spójnego sygnału qPCR w próbkach powtórzonych (Rysunek 2Ba, 2 czerwone linie), podczas gdy mikromieszanie tylko przez pierwsze 5 minut lub samo trituracje spowodowały uzyskanie niespójnych linii qPCR (Rysunek 2Ba, odpowiednio 2 niebieskie linie i 2 czarne linie). Szare linie to kontrole negatywne („neg.”), w których z reakcji qPCR pominięto cDNA. Po denaturacji produktów qPCR z tego eksperymentu poprzez stopniowe zwiększanie temperatury (tj. analiza krzywej topnienia) okazało się, że odpowiednie produkty PCR (tj. amplikon identyczny z uzyskanym po odwrotnej transkrypcji i amplifikacji qPCR znacznie wyższych stężeń mRNA, dane niepokazane) wystąpiły wyłącznie po reakcjach RT poddanych mikromieszaniu przez 60 minut (Rysunek 2Bb, 2 czerwone linie). Wszystkie pozostałe próbki (tj. mikromieszanie przez 5 min, trituracje i kontrole negatywne) wygenerowały alternatywne produkty amplikonowe (np. dimery starterów).
<img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig1.jpg" alt="Schemat procesu mikromieszania dla mieszania w temperaturze pokojowej (RT); obejmuje konfigurację, rozmieszczenie probówek oraz zastosowanie częstotliwości akustycznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Schemat procedury zastosowania mikromieszania w standardowych laboratoryjnych reakcjach RT. Bardziej szczegółowe opisy zastosowanej zasady fizycznej, mikromieszacza oraz sposobu budowy własnego mikromieszacza znajdują się w literaturze. 13,14
<img src="/files/ftp_upload/3144/3144fig2.jpg" alt="Analiza cyklu fluorescencji qPCR oraz wykres krzywej topnienia dla Nurr-1 z fluorescencją micromixed." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rycina 2.Reprezentatywne dane qPCR ilustrujące korzyści z zastosowania mikromieszania w poprzedzających reakcjach RT obejmujących ilości mRNA odpowiadające pojedynczym komórkom w standardowych laboratoryjnych reakcjach RT. A Przykładowe krzywe qPCR wykazujące obecność cDNA reprezentującego mRNA kodujące gen Nurr-1. Poprzednie reakcje RT zawierały 2,5 pg całkowitego RNA w objętości 25μL i przeprowadzono w inkubatorze w temperaturze 37°C przez 60 minut. Reakcje RT mieszano poprzez tryturację mieszaniny RT przed inkubacją (linie czarne, „trituration”), mikromieszano podczas pierwszych 5 minut reakcji RT (linie niebieskie, „micromixed5”) lub mikromieszano przez pełne 60 minut reakcji RT (linie czerwone, „micromixed60”). Poniżej przedstawiono średnie ± SEM liczby cykli qPCR wymaganych do osiągnięcia 50% maksymalnej fluorescencji dla n=3 powtórzeń tego doświadczenia. Gwiazdka oznacza różnicę istotną (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya). B Kolejny eksperyment qPCR analizujący produkt cDNA Nurr-1, tym razem po reakcjach RT zawierających 25 pg całkowitego RNA w objętości 25μLKrzywe qPCR (a) oraz analiza krzywej topnienia uzyskanych produktów qPCR (b) przedstawiono dla różnych warunków mieszania. Uwzględniono również kontrole negatywne, w których do poprzedzającej reakcji RT nie dodano cDNA (szare linie, „neg.”). Przeprowadzono również reakcje RT z znacznie wyższymi stężeniami mRNA, które dały piki krzywych topnienia (dane nieprzedstawione) identyczne z tymi w (b) dla próbek micromixed60 (ślady czerwone).

<ol><li>Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Funct+Genomic+Proteomic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Brief Funct Genomic Proteomic.</a> 2 (1), 31-31 (2003).</li>
<li>Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).</li>
<li>Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).</li>
<li>Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).</li>
<li>Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).</li>
<li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).</li>
<li>Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).</li>
<li>Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).</li>
<li>Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).</li>
<li>Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).</li>
<li>Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).</li>
<li>Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).</li>
<li>Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).</li>
<li>Riley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ann+Rev+Fluid+Mech%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ann Rev Fluid Mech.</a> 33, 43-43 (2001).</li>
<li>Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda zastosowania mikromieszania w standardowych laboratoryjnych reakcjach RT może oczywiście obejmować mRNA pozyskane dowolną metodą (np. lizę komórek, laserową mikrodysekcję przechwytywaniem). Może ona również obejmować odczynniki do RT dowolnych marek lub typów, dowolną temperaturę (w granicach tolerancji materiałów mikromieszacza) oraz dowolny czas trwania. Na przykład zaobserwowaliśmy zwiększoną wydajność cDNA w reakcjach RT z zastosowaniem losowych heksamerów lub starterów oligo-dT. Metoda ta może b...

<table><tbody><tr><td>Całkowity RNA wyizolowano z błyskawicznie zamrożonych, świeżo przygotowanych skrawków śródmózgowia dorosłych myszy.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure</td><td>Arcturus Bioscience</td><td>KIT0204</td><td>Zestaw jest już dostępny w ofercie firmy Applied Biosystems</td></tr><tr><td>Odczynniki do usuwania i obróbki DNazą wolną od DNA</td><td>Ambion</td><td>AM1906M</td><td></td></tr><tr><td>Losowe primery heksamerowe</td><td>Promega Corp.</td><td>C1181</td><td></td></tr><tr><td>AMV-RT</td><td>Promega Corp.</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>zestaw dNTP</td><td>Promega Corp.</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>RNazina&lt;sup&gt;&lt;/sup&gt; Inhibitor rybonukleazy</td><td>Promega Corp.</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Promega Corp.</td><td>P1193</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&lt;sup&gt;&lt;/sup&gt; Gotowy zestaw do PCR z barwnikiem (Green PCR Master Mix)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Hprt forward (20-mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hprt rewersyjny (20-mer): TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nurr1 rewersyjny (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 1000. </td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corbett Rotor Gene RG-6000</td><td>Corbett Life Science</td><td></td><td>Firma Corbett Life Science została przejęta przez QIAGEN w lipcu 2008 roku</td></tr></tbody></table>

zwiększenie wydajności cdna z ilości mrna odpowiadających pojedynczym komórkom w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkrypcji z wykorzystaniem akustycznego mikrostrumieniowania

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Korelowanie ekspresji genów z zachowaniem komórek najlepiej przeprowadzać na poziomie pojedynczych komórek. Nie jest to jednak łatwe do osiągnięcia, ponieważ niewielka ilość labilnego mRNA obecna w pojedynczej komórce (1-5% z 1-50pg całkowitego RNA, czyli 0,01-2,5pg mRNA na komórkę 1) ulega w większości degradacji, zanim zostanie poddana odwrotnej transkrypcji do stabilnej kopii cDNA. Na przykład, przy użyciu standardowych odczynników i sprzętu laboratoryjnego, na poziomie pojedynczej komórki można jakościowo ocenić jedynie niewielką liczbę genów 2. Jednym ze sposobów zwiększenia wydajności standardowych laboratoryjnych reakcji odwrotnej transkrypcji (RT) (tj. standardowych odczynników w objętościach mikrolitrowych) obejmujących ilości mRNA z pojedynczych komórek byłoby szybsze mieszanie odczynników, aby mRNA mogło zostać przekształcone w cDNA przed jego degradacją. Nie jest to jednak trywialne, ponieważ w skali mikrolitrowej przepływ cieczy jest laminarny, co oznacza, że obecnie dostępne metody mieszania (tj. wstrząsanie, wiroksowanie i trituracja) nie wywołują wystarczającego ruchu chaotycznego, aby skutecznie wymieszać odczynniki. Aby rozwiązać ten problem, należy zastosować techniki mieszania w mikroskali 3,4. Opracowano szereg technologii mieszania opartych na mikrofluidyce, które skutecznie zwiększają wydajność reakcji RT 5-8. Jednak technologie mikrofluidyczne wymagają specjalistycznego sprzętu, który jest stosunkowo drogi i nie jest jeszcze powszechnie dostępny. Pożądane jest rozwiązanie tańsze i wygodniejsze. Głównym celem niniejszego badania jest wykazanie, w jaki sposób zastosowanie nowej techniki „mikromieszania” do standardowych laboratoryjnych reakcji RT obejmujących ilości mRNA z pojedynczych komórek znacząco zwiększa wydajność uzyskiwanego cDNA. Stwierdziliśmy, że wydajność cDNA wzrasta około 10-100-krotnie, co umożliwia: (1) analizę większej liczby genów w pojedynczej komórce; (2) bardziej ilościową analizę ekspresji genów; oraz (3) lepszą detekcję genów o niskiej obfitości w pojedynczych komórkach. Mikromieszanie opiera się na akustycznym mikrostrumieniowaniu 9-12, zjawisku, w którym fale dźwiękowe rozprzestrzeniające się wokół małej przeszkody tworzą średni przepływ w pobliżu tej przeszkody. Opracowaliśmy urządzenie oparte na akustycznym mikrostrumieniowaniu („mikromikser”) z kluczowym uproszczeniem; akustyczne mikrostrumieniowanie można osiągnąć przy częstotliwościach audio, zapewniając, że system posiada granicę ciecz-powietrze o małym promieniu krzywizny 13. Menisk roztworu o objętości mikrolitrowej w probówce zapewnia odpowiednio mały promień krzywizny. Zastosowanie częstotliwości audio oznacza, że sprzęt może być tani i wszechstronny 13, a kwasy nukleinowe i inne odczynniki biochemiczne nie ulegają uszkodzeniom, co może zdarzyć się w przypadku standardowych sonikatorów laboratoryjnych.

Opisujemy nową metodę zwiększania wydajności cDNA z ilości mRNA pochodzących z pojedynczych komórek w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkrypcji. Nowatorstwo tej metody polega na zastosowaniu mikromiksera, który wykorzystuje zjawisko akustycznego mikrostrumieniowania do bardziej efektywnego mieszania cieczy w skalach mikrolitrowych niż w przypadku wstrząsania, wirowania w vortexie czy trituracji.

Zwiększenie wydajności cDNA z ilości mRNA odpowiadających pojedynczym komórkom w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkrypcji z wykorzystaniem akustycznego mikrostrumieniowania

Korelacja ekspresji genów z zachowaniem komórek jest najlepiej przeprowadzana na poziomie pojedynczych komórek. Nie jest to jednak łatwe do osiągnięcia, ponieważ niewielka ilość...

Niniejsza procedura zwiększa wydajność CD NA z ilości mRNA pochodzących z pojedynczej komórki. Należy rozpocząć od wyrównania temperatury miksomiksera w inkubatorze ustawionym na pożądaną temperaturę reakcji odwrotnej transkrypcji. Następnie należy przygotować standardowe laboratoryjne reakcje RT, zawierające ilości RNA z pojedynczej komórki w objętościach mikrolitrowych.Bezpiecznie umieść probówkę reakcyjną w otworach mieszających, wybierz odpowiednie parametry mieszania i włącz mikser microm. Ostatecznie procedurę tę można wykorzystać w celu uzyskania zwiększonych wydajności cDNA poprzez ilościową PCR jako przygotowanie do reakcji RT. Inkubuj mikser microm w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej jedną godzinę w celu wyrównania temperatury.W standardowych sterylnych, wolnych od nukleaz 200 µL cienkościennych probówkach do PCR. Przygotować reakcje odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami dostawcy, z zastrzeżeniem użycia ilości całkowitego RNA odpowiadającej pojedynczej komórce. Następnie dobrać odpowiednią częstotliwość i amplitudę mieszania mikroprzepływowego.Następnie stabilnie umieść probówkę w mikserze mikrofalowym. Następnie włącz mikser mikrofalowy. Pozostaw reakcję na 60 minut; po zakończeniu wyłącz mikser mikrofalowy i przenieś reakcje na lód w celu natychmiastowego wykorzystania w kolejnych aplikacjach. W porównaniu z innymi metodami, główną zaletą mieszania mikrofalowego w kontekście reakcji RT jest wydajność cDNA.W tej analizie ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej krzywe QPCR z zastosowaniem starterów zaprojektowanych do wykrywania cDNA reprezentującego mRNA neuro one ilustrują efekty mieszania microm przez pierwsze pięć minut lub przez pełne 60 minut w porównaniu z czasem trwania reakcji RT bezpośrednio przed inkubacją RT. Mieszanie microm przez pierwsze pięć minut nie doprowadziło do istotnej poprawy w stosunku do ation. Jednakże mieszanie microm przez pełne 60 minut spowodowało znaczną poprawę wydajności, odpowiadającą 15 cyklom QPCR.Ponadto analiza krzywej topnienia z qPCR wykazuje, że mikromieszanie przez pełne 60 minut poprzedzającej reakcji RT produkuje spójny sygnał w próbkach powtórzonych, co przedstawiono na czerwonych liniach. Kontrastuje to z różnymi przebiegami linii obserwowanymi przy mikromieszaniu tylko przez pierwsze pięć minut (linie niebieskie) lub przy samej inkubacji (linie czarne); linie szare to kontrole bez matrycy.

increasing-cdna-yields-from-single-cell-quantities-mrna-standard

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zwiększanie wydajności cDNA z pojedynczych ilości mRNA w standardowych reakcjach odwrotnej transkrypcji laboratoryjnej z użyciem akustycznego mikrostrumienia

Opisujemy proces wykorzystujący laserową mikrodysekcję do izolacji i ekstrakcji RNA z homogenicznej populacji komórek — neuronów piramidowych — w warstwie III zakrętu skroniowego górnego w pośmiertnych ludzkich mózgach. Następnie przeprowadzamy linearną amplifikację (opartą na T7) mRNA i hybrydyzujemy próbkę z macierzą Affymetrix human X3P.

Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Ilościowe oznaczenie poziomu RNA HIV-1 w osoczu oraz sekwencjonowanie pojedynczych genomów HIV-1 u osób z wiremią poniżej granicy wykrywalności (50-75 kopii/ml) jest trudne. W niniejszym materiale opisujemy sposób izolacji i oznaczania ilościowego wirusowego RNA z osocza przy użyciu testu real-time PCR, który wiarygodnie mierzy poziom RNA HIV-1 aż do 0,3 kopii/ml, a także metodę amplifikacji genomów wirusowych poprzez sekwencjonowanie pojedynczych genomów z próbek o bardzo niskiej ładunku...

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Prezentujemy eksperymentalne podejścia do badania interakcji RNA dwuniciowych białek wiążących RNA, aktywowanych przez RNA (PKR) podczas cyklu komórkowego ssaków przy użyciu komórek HeLa. Metoda ta wykorzystuje formaldehyd do sieciowania kompleksów RNA-PKR i immunoprecypitacji w celu wzbogacenia RNA związanych z PKR. Te RNA mogą być dalej analizowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub qRT-PCR.

Badanie interakcji RNA kinazy białkowej aktywowanej RNA podczas cyklu komórkowego ssaków

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Poznaj metodę zwiększania wydajności cDNA z mRNA pojedynczych komórek przy użyciu mikromiksera z akustycznym mikrostrumieniowaniem. Technika ta poprawia mieszanie w standardowych reakcjach odwrotnej transkryptazy.

Zwiększanie wydajności cDNA z pojedynczych ilości mRNA w pojedynczych komórkach w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkryptazy przy użyciu mikrostrumieniowania akustycznego (Wideo) | JoVE Journal

Zwiększenie wydajności cDNA z ilości mRNA odpowiadających pojedynczym komórkom w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkrypcji z wykorzystaniem akustycznego mikrostrumieniowania

Przeglądaj więcej filmów