Zwiększenie wydajności cDNA z ilości mRNA odpowiadających pojedynczym komórkom w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkrypcji z wykorzystaniem akustycznego mikrostrumieniowania
11 lipca 2011
Opisujemy nową metodę zwiększania wydajności cDNA z ilości mRNA pochodzących z pojedynczych komórek w standardowych laboratoryjnych reakcjach odwrotnej transkrypcji. Nowatorstwo tej metody polega na zastosowaniu mikromiksera, który wykorzystuje zjawisko akustycznego mikrostrumieniowania do bardziej efektywnego mieszania cieczy w skalach mikrolitrowych niż w przypadku wstrząsania, wirowania w vortexie czy trituracji.
Niniejsza procedura zwiększa wydajność CD NA z ilości mRNA pochodzących z pojedynczej komórki. Należy rozpocząć od wyrównania temperatury miksomiksera w inkubatorze ustawionym na pożądaną temperaturę reakcji odwrotnej transkrypcji. Następnie należy przygotować standardowe laboratoryjne reakcje RT, zawierające ilości RNA z pojedynczej komórki w objętościach mikrolitrowych.
Bezpiecznie umieść probówkę reakcyjną w otworach mieszających, wybierz odpowiednie parametry mieszania i włącz mikser microm. Ostatecznie procedurę tę można wykorzystać w celu uzyskania zwiększonych wydajności cDNA poprzez ilościową PCR jako przygotowanie do reakcji RT. Inkubuj mikser microm w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez co najmniej jedną godzinę w celu wyrównania temperatury.
W standardowych sterylnych, wolnych od nukleaz 200 µL cienkościennych probówkach do PCR. Przygotować reakcje odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami dostawcy, z zastrzeżeniem użycia ilości całkowitego RNA odpowiadającej pojedynczej komórce. Następnie dobrać odpowiednią częstotliwość i amplitudę mieszania mikroprzepływowego.
Następnie stabilnie umieść probówkę w mikserze mikrofalowym. Następnie włącz mikser mikrofalowy. Pozostaw reakcję na 60 minut; po zakończeniu wyłącz mikser mikrofalowy i przenieś reakcje na lód w celu natychmiastowego wykorzystania w kolejnych aplikacjach. W porównaniu z innymi metodami, główną zaletą mieszania mikrofalowego w kontekście reakcji RT jest wydajność cDNA.
W tej analizie ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej krzywe QPCR z zastosowaniem starterów zaprojektowanych do wykrywania cDNA reprezentującego mRNA neuro one ilustrują efekty mieszania microm przez pierwsze pięć minut lub przez pełne 60 minut w porównaniu z czasem trwania reakcji RT bezpośrednio przed inkubacją RT. Mieszanie microm przez pierwsze pięć minut nie doprowadziło do istotnej poprawy w stosunku do ation. Jednakże mieszanie microm przez pełne 60 minut spowodowało znaczną poprawę wydajności, odpowiadającą 15 cyklom QPCR.
Ponadto analiza krzywej topnienia z qPCR wykazuje, że mikromieszanie przez pełne 60 minut poprzedzającej reakcji RT produkuje spójny sygnał w próbkach powtórzonych, co przedstawiono na czerwonych liniach. Kontrastuje to z różnymi przebiegami linii obserwowanymi przy mikromieszaniu tylko przez pierwsze pięć minut (linie niebieskie) lub przy samej inkubacji (linie czarne); linie szare to kontrole bez matrycy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono nową metodę zwiększenia wydajności cDNA z mRNA pojedynczej komórki przy użyciu mikromiksera. Technika ta wykorzystuje akustyczne mikroprądy w celu poprawy mieszania cieczy w standardowych reakcjach odwrotnej transkrypcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biotechnologia
- Genomika
Wprowadzenie
- Synteza cDNA jest kluczowa dla analizy ekspresji genów.
- Analiza pojedynczych komórek wiąże się z trudnościami w uzyskaniu odpowiedniej wydajności RNA.
- Tradycyjne metody mieszania mogą być niewystarczające dla małych objętości.
- Akustyczny mikroprzepływ stanowi potencjalne rozwiązanie w celu poprawy mieszania.
Cel badania
- Opracowanie metody zwiększania wydajności cDNA z mRNA pojedynczych komórek.
- Wykorzystanie mikromiksera w celu usprawnienia mieszania cieczy.
- Ocena skuteczności tej metody w standardowych reakcjach RT.
Zastosowane metody
- Równoważenie mikromiksera w inkubatorze w temperaturze 37°C.
- Przygotowanie standardowych reakcji odwrotnej transkrypcji z RNA pojedynczych komórek.
- Umieszczenie probówek z reakcją w mikromikserze.
- Dostosowanie parametrów mieszania i uruchomienie mikromiksera.
Główne wyniki
- Zaobserwowano zwiększone wydajności cDNA w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Mikromikser skutecznie usprawnił mieszanie w skalach mikrolitrowych.
- Wyniki ilościowej PCR potwierdziły zwiększone wydajności.
- Metoda ta jest możliwa do zastosowania w różnych analizach RNA pojedynczych komórek.
Wnioski
- Mikromieszacz zapewnia znaczną przewagę w syntezie cDNA z mRNA pojedynczych komórek.
- Podejście to może ułatwić dokładniejsze badania ekspresji genów.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować szersze analizy transkryptomiczne pojedynczych komórek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zwiększenie wydajności cDNA z mRNA pojedynczych komórek rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w procesach walidacji celów i przesiewania fenotypowego. Dzięki umożliwieniu analizy większej liczby genów w jednej komórce z precyzją ilościową, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w decyzjach na wczesnym etapie odkrywania. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka hipotez terapeutycznych poprzez powtarzalne i skalowalne odczyty molekularne z ograniczonych próbek biologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez zwiększenie liczby wykrywalnych celów genowych w pojedynczej komórce.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność techniczną w konwersji mRNA do cDNA, poprawiając spójność testu pomiędzy powtórzeniami.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio dzięki bardziej niezawodnej detekcji rzadkich transkryptów powiązanych z mechanizmami chorobowymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane biblioteki cDNA do dalszego przesiewania, zwiększając czułość identyfikacji trafień.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przetwarzanie wejściowego RNA przy użyciu dostępnego sprzętu laboratoryjnego, zwiększając przepustowość.
- Wartość platformy: Kompatybilna ze standardowymi odczynnikami RT i analityką qPCR, co ułatwia integrację z istniejącymi kaskadami przesiewowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia odkrywanie biomarkerów w rzadkich populacjach komórek poprzez poprawę granic detekcji dla celów przejściowych lub o niskiej ekspresji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki, które wspierają spójność międzyfunkcyjną zespołów badawczych i przedklinicznych.
- Łagodzenie ryzyka: Zmniejsza ryzyko wyników fałszywie ujemnych w walidacji celów poprzez zwiększenie wydajności cDNA bez konieczności stosowania specjalistycznej infrastruktury mikroprzepływowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, a konkretnie wspiera przejście od generowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego do identyfikacji związków wiodących poprzez poprawę jakości i ilości cząsteczek dostarczanych do przesiewu funkcjonalnego.
- Biologia odkrywcza: usprawnia walidację celu poprzez umożliwienie kompleksowego profilowania transkrypcyjnego z ilości mRNA pochodzących z pojedynczej komórki.
- Screening: poprawia przygotowanie do analizy dzięki zwiększeniu wydajności cDNA, co wspiera wiarygodne wykrywanie zmian ekspresji indukowanych związkami.
- Analityka: generuje ilościowe wyniki kompatybilne z qPCR, które umożliwiają statystyczne porównanie ekspresji genów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: wspierają ciągłość prac przedklinicznych, umożliwiając wykrywanie transkryptów istotnych dla przebiegu choroby w ograniczonych próbkach pierwotnych komórek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: stanowi skalowalną i niskokosztową możliwość zastosowania w wielu projektach i systemach modelowych bez konieczności posiadania dedykowanych platform mikroprzepływowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez redukcję szumu technicznego podczas syntezy cDNA z ograniczonej ilości wejściowej RNA.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność procesów analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach przy użyciu standardowej aparatury laboratoryjnej.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go dzięki umożliwieniu bardziej kompleksowego profilowania molekularnego każdej próbki, co redukuje liczbę biologicznych wyników fałszywie ujemnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera optymalizację ryzyka w procesie rozwoju poprzez zwiększenie pewności danych dotyczących zaangażowania celu i modulacji szlaków, pochodzących z analiz pojedynczych komórek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga znajomości zasad akustycznego mikrostrumieniowania oraz optymalizacji parametrów częstotliwości i amplitudy dla konkretnych objętości reakcyjnych.
- Zależy od dostępu do inkubatora z kontrolą temperatury oraz kompatybilnych cienkościennych probówek PCR w celu efektywnego utworzenia menisku.
- Konieczna jest standaryzacja czasu mieszania i ustawień mocy dla wszystkich użytkowników, aby zapewnić powtarzalne wydajności cDNA.
- Wymaga walidacji integralności kwasów nukleinowych po mieszaniu w celu potwierdzenia braku degradacji spowodowanej efektami mechanicznymi lub termicznymi.
- Ograniczone do zastosowań, w których zwiększona wydajność cDNA bezpośrednio poprawia czułość analityczną kolejnych etapów, takich jak qPCR lub przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania.
