Name: Oddzielenie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA i RNA od środowiskowej społeczności wirusowej za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Poznaj metodę chromatografii hydroksyapatytowej do separacji ssDNA, dsDNA i RNA z próbek środowiskowych. Technika umożliwia izolację kwasów nukleinowych z mniej niż 9% przenoszenia między frakcjami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Office of Science (BER) Departamentu Energii USA w ramach umowy o współpracy nr De-FC02-02ER63453 oraz przez Program Sekwencjonowania Genomów Mikrobowych National Science Foundation (numery grantów 0626826 i 0731916). Dziękujemy Johnowi Glassowi za wiedzę techniczną i porady oraz K. Ericowi Wommackowi za pomoc w pobieraniu próbek środowiskowych.

1. Przygotowanie roztworów
Przed przeprowadzeniem chromatografii na hydroksyapatycie należy przygotować bufory fosforanowe oraz odpowiednio nawodnić hydroksyapatyt.
<ol>
<li>1M roztwór fosforanowy, pH 6,8: W kolbie o pojemności 1L rozpuścić 19,98g fosforanu sodu jednowodnego w 1L sterylnej wody H2O traktowanej DEPC. Przygotować 1M roztwór fosforanu sodu dwuzasadowego w kolbie o pojemności 1L, rozpuszczając 141,96g fosforanu sodu dwuzasadowego w 1L sterylnej wody H2O traktowanej DEPC. Połączyć roztwory jednoskładnikowy i dwuskładnikowy w stosunku 1:1. Umieścić kolbę na mieszadle magnetycznym i mieszać za pomocą mieszadełka magnetycznego. Dostosować pH do 6,8, dodając wodorotlenek sodu (aby zwiększyć pH) lub kwas fosforowy (aby zmniejszyć pH).</li>
<li>Bufor fosforanowy 0,12M: W kolbie o pojemności 500ml połączyć 30ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.</li> 
<li>Bufor fosforanowy 0,18M: W kolbie o pojemności 50ml połączyć 45ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.</li> 
<li>Bufor fosforanowy 0,20M: W kolbie o pojemności 50ml połączyć 50ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.</li> 
<li>Bufor fosforanowy 0,40M: W kolbie o pojemności 50ml połączyć 100ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.</li> 
<li>„Bufor fosforanowy 1,0M” (rzeczywiste stężenie fosforanu w tym roztworze wynosi 0,91M): W kolbie o pojemności 50ml połączyć 30ml 1M roztworu fosforanowego (pH 6,8), 2,5ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 5ml 0,5M EDTA. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 25ml. Dostosować pH do 6,8. Dodać sterylną wodę H2O traktowaną DEPC do uzyskania objętości 250ml. Autoklawować.</li> 
<li>Hydratacja hydroksyapatytu: Odważyć 1g hydroksyapatytu i przenieść do probówki o pojemności 50ml. Dodać 6ml buforu fosforanowego 0,12M do hydroksyapatytu i wymieszać przez odwracanie probówki. Przed użyciem podgrzać do temperatury 60°C i dokładnie wymieszać. Przechowywać przez dłuższy czas w temperaturze 4°C.</li>
<li>Przed użyciem doprowadzić wszystkie bufory fosforanowe i hydratowany hydroksyapatyt do temperatury 60°C.</li> 
</ol>
2. Przygotowanie kolumny Econo-Column
<ol>
<li>Zamknąć kurek. Przepłukać kolumnę kilka razy dejonizowaną wodą H2O poprzez wielokrotne odwracanie kolumny i zlewanie zawartości.</li>
<li>Wyjąć kurek z kolumny Econo-column i wysterylizować kolumnę w autoklawie.</li>
<li>Ponownie włożyć i zamknąć kurek. Dodać 1ml Sigmacote do sterylnej kolumny Econo-column i pokryć wszystkie szklane powierzchnie. Otworzyć kurek i zlać zawartość.</li>
<li>Podłączyć kolumnę do cyrkulacyjnej kąpieli wodnej i ustawić temperaturę na 60°C. Aby zapewnić minimalne straty ciepła wzdłuż kolumny, zaleca się owinięcie jej materiałem izolacyjnym, takim jak folia aluminiowa lub piankowa izolacja rur.</li> 
<li>Przepłukać kolumnę Econo-column dwukrotnie sterylną wodą H2O wolną od RNaz, a następnie dwukrotnie sterylnym, wolnym od RNaz buforem fosforanowym 0,12M.</li>
</ol>
3. Chromatografia na hydroksyapatycie
<ol>
<li>Upewniając się, że kurek jest zamknięty, powoli dodaj 2ml wcześniej przygotowanej, resuspendowanej hydroksyapatytu na dno kolumny Econo za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 2ml.</li>
<li>Pozostaw hydroksyapatyt do osadzenia pod wpływem siły grawitacji przez 30 minut.</li>
<li>Odprowadź bufor z kolumny i zamknij kurek. Połącz kwasy nukleinowe z buforem fosforanowym 0,12M do końcowej objętości 50 μl i inkubuj w temperaturze 60°C przez 10 minut w bloku grzejnym lub kąpieli wodnej.</li> 
<li>Szybko nanieś przygotowane w buforze fosforanowym 0,12M kwasy nukleinowe na hydroksyapatyt za pomocą pipety serologicznej 2ml, dbając o to, aby nie naruszyć wypełnienia kolumny.</li>
<li>Pozostaw kwasy nukleinowe do związania z hydroksyapatytem na 30 minut.</li>
<li>Umieść probówkę 15ml pod kolumną, otwórz kurek i zbierz pierwszą frakcję zawierającą ssDNA. Zamknij kurek.</li>
<li>Dodaj 6ml buforu fosforanowego 0,12M do hydroksyapatytu, uważając, aby nie naruszyć wypełnienia kolumny, otwórz kurek i zbierz jednoniciowy DNA do probówki 15ml z poprzedniego kroku. Zamknij kurek.</li>
<li>Dodaj do probówki 1 objętość roztworu fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:25:1 v/v/v), wymieszaj energicznie i wiruj przy 350 x g przez 15 minut. Przenieś nadsącz zawierający ssDNA do nowej probówki 15ml.</li>
<li>Powtórz kroki 3.76 i 3.87, używając 6ml buforu fosforanowego 0,20M w celu elucji i oczyszczania RNA z kolumny, pamiętając o zastosowaniu nowej probówki 15ml do zbierania frakcji.</li>
<li>Powtórz kroki 3.76 i 3.87, używając 6ml buforu fosforanowego 0,40M w celu elucji i oczyszczania dsDNA z kolumny, pamiętając o zastosowaniu nowej probówki 15ml do zbierania frakcji.</li> 
<li>Powtórz kroki 3.76 i 3.87, używając 6ml buforu fosforanowego 1,0M w celu całkowitego wypłukania pozostałego dsDNA z kolumny, pamiętając o zastosowaniu nowej probówki 15ml do zbierania frakcji.</li>
</ol>
4. Odsalanie próbek kwasów nukleinowych
<ol>
<li>Przenieś 4-5ml próbki do urządzenia do filtrowania odśrodkowego Amicon Ultra-4 wyposażonego w membranę Ultracel z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 30 0.</li>
<li>Skoncentruj próbkę do objętości &lt; 50μl, wirując przy 6 0 x g, 30°C przez 5 minut (lub do momentu uzyskania pożądanej objętości koncentratu) w rotorze z kątem stałym. Odlej filtrat.</li>
<li>Dodaj pozostałą część próbki(i) do urządzenia do filtrowania odśrodkowego Amicon Ultra-4 i uzupełnij objętość do 4-5ml za pomocą wolnego od RNazy buforu 1X TE.</li>
<li>Skoncentruj próbkę do objętości &lt; 50μl, wirując przy 6 0 x g, 30°C przez 5 minut (lub do momentu uzyskania pożądanej objętości koncentratu) w rotorze z kątem stałym. Odlej filtrat.</li>
<li>Dodaj 4-5ml wolnego od RNazy buforu 1X TE do urządzenia do filtrowania odśrodkowego Amicon Ultra-4. Skoncentruj próbkę do objętości &lt; 50μl, wirując przy 6 0 x g, 30°C przez 5 minut (lub do momentu uzyskania pożądanej objętości koncentratu) w rotorze z kątem stałym. Odlej filtrat.</li>
<li>Powtórz krok 4.5 jeszcze 5 razy, aby całkowicie odsolić próbkę(i) kwasów nukleinowych.</li>
<li>Przenieś pozostałą próbkę(i) do sterylnej probówki typu eppendorf o pojemności 1,7ml. Dodaj 1/10 objętości 3M octanu sodu, pH 7.0, dwie objętości 100% etanolu oraz 1μl Glycoblue. Wymieszaj dokładnie za pomocą wortexa.</li>
<li>Wiruj przy 28 00 x g, 4°C przez 60 minut. Odlej nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj 30μl 70% etanolu. Wiruj przy 28 0 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odlej nadsącz, wysusz i resuspenduj każdą frakcję w odpowiedniej objętości wolnego od RNazy buforu TE.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1 podsumowuje przedstawione metody wykorzystania chromatografii na hydroksyapatycie do frakcjonowania kwasów nukleinowych ssDNA, dsDNA i RNA z mieszanej populacji wirusów. Metoda ta wykorzystuje oddziaływanie ładunków między ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym kwasów nukleinowych a dodatnio naładowanymi jonami Ca2+ obecnymi w hydroksyapatycie, co pozwala na efektywne frakcjonowanie podtypów kwasów nukleinowych (ssDNA, dsDNA i RNA) przy zwiększających się stężeniach buforu fosforanowego 12.
Frakcjonowanie na hydroksyapatycie „społeczności” in vitro znanych genomów wirusowych ssDNA (M13mp18), dsDNA (lambda) oraz RNA (MS2 i phi6) przedstawiono na Rysunku 2. Kwasy nukleinowe połączono w równych stężeniach, nałożono na kolumnę z hydroksyapatytem, a następnie elukowano przy użyciu rosnącego stężenia buforu fosforanowego. Każdy podtyp kwasu nukleinowego elukuje niezależnie od pozostałych, przy przeniesieniu mniej niż 9% materiału z jednej frakcji do kolejnej.
Zastosowanie tej techniki w odniesieniu do kwasów nukleinowych wyizolowanych ze zbiorowiska wirusów pobranego z zatoki Chesapeake przedstawiono na Rysunku 3. Całkowita wydajność kwasów nukleinowych wyizolowanych z oczyszczonych wirusów została naniesiona na kolumnę z hydroksyapatytem. Materiał genomiczny składający się z ssDNA, RNA i dsDNA został niezależnie eluowany odpowiednio przy stężeniach 0,12 M, 0,20 M oraz 0,40 M/1,0 M buforu fosforanowego. Dwuniciowy DNA jest eluowany przy stężeniach fosforanu 0,40 M i 1,00 M i w tym przypadku dominuje w tym zbiorowisku wirusów w porównaniu do genotypów ssDNA i RNA. Obserwacja ta jest zgodna z oczekiwanym składem zbiorowisk wirusowych w środowiskach morskich i estuariowych, gdzie większość odzyskiwalnych kwasów nukleinowych to dsDNA 13.
<img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="Separacja kwasów nukleinowych za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej. Wiązanie DNA i RNA w temperaturze 60°C, gradient buforowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Schemat blokowy metody chromatografii na hydroksyapatycie w celu frakcjonowania kwasów nukleinowych. Mieszaninę ssDNA, dsDNA i RNA przygotowaną w buforze fosforanowym 0,12 M podgrzewa się do 60°C i naniesiono na kolumnę z hydroksyapatytem utrzymywaną w stałej 60°C przy użyciu łaźni wodnej z cyrkulacją. Kwasy nukleinowe (ssDNA, RNA i dsDNA) są eluowane z hydroksyapatytu przy użyciu rosnących stężeń buforu zawierającego fosforany. Rysunek ten został powielony za zgodą American Society of Microbiology i pierwotnie pojawił się w publikacji Andrews-Pfannkoch et al. 201012.
<img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="Wynik elektroforezy żelowej; rozdział prążków DNA; podpisane ścieżki; widoczny marker masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Rozdzielanie znanych kwasów nukleinowych wirusów za pomocą chromatografii na hydroksyapatycie. Równe stężenia ssDNA M13mp18, ssRNA MS2, dsRNA phi6 oraz dsDNA lambda (odpowiednio ścieżki 2–5) zostały połączone (ścieżka 6) i naniesione na kolumnę z hydroksyapatytem. Jednoniciowy DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6) oraz dsDNA (lambda) zostały niezależnie wymyte z kolumny z hydroksyapatytem przy użyciu roztworów 0,12 M (ścieżka 8), 0,18 M (ścieżka 9) oraz 0,40 M/1,0 M (ścieżka 10). Do potwierdzenia wielkości genomów użyto drabinki 1 kb (ścieżki 1, 7). Rysunek ten został powielony za zgodą American Society of Microbiology i pierwotnie pojawił się w pracy Andrews-Pfannkoch et al. 2010.12.
<img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="Wynik elektroforezy DNA; porównanie ścieżek; drabinka wskazuje rozmiary fragmentów do analizy molekularnej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rysunek 3. Separacja kwasów nukleinowych wirusów wyizolowanych z populacji w zatoce Chesapeake. Kwasy nukleinowe zostały wyizolowane i naniesione na kolumnę z hydroksyapatytem. ssDNA (ścieżka 0,12 M), RNA (ścieżka 0,20 M) oraz dsDNA (ścieżki 0,40 M/1,0 M) zostały niezależnie eluowane przy użyciu buforu fosforanowego o stężeniach odpowiednio 0,12 M, 0,20 M oraz 0,40 M/1,0 M. Do wizualnego potwierdzenia przybliżonej masy cząsteczkowej i masy kwasów nukleinowych użyto markerów Hi Mass DNA Ladder (ścieżka L1) oraz 1kb Ladder (ścieżka L2). Rycina ta została powielona za zgodą American Society of Microbiology i pierwotnie pojawiła się w pracy Andrews-Pfannkoch et al. 2010.12.

<ol><li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotes%3A+The+Unseen+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+evolution+of+the+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Popul+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li>
<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages%3A+Evolution+of+the+Majority%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li>
<li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li>
<li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay%3A+Implications+for+Prophage+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li>
<li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition%3A+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li>
<li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Viruses+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li>
<li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li>
<li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li>
<li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li>
<li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li>
<li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA%2C+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li>
<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton%3A+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metodologia chromatografii na hydroksyapatycie jest wysoce wydajnym i niezawodnym narzędziem do frakcjonowania kwasów nukleinowych z mieszanych zespołów wirusowych, gdy celem jest badanie łącznie skład kwasów nukleinowych w obrębie społeczności. Zazwyczaj ssDNA, RNA i dsDNA będą eluowane z kolumny przy stężeniach buforu fosforanowego przekraczających w przybliżeniu&tilde; odpowiednio 0 i 0,40 M. Należy jednak pamiętać, że każda partia hydroksyapatytu może mieć nieco inny skład i profil elucji...

<table><tbody><tr><td>Kolumna Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>737-0717</td><td>wewnętrzna średnica 0.7cm opakowanie/2</td></tr><tr><td>Hydroksyapatyt</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0520</td><td>Bio-Gel HTP Gel stopień DNA, 100g/td&amp;gt;</td></tr><tr><td>Fosforan sodu, jednowodny</td><td>VWR international</td><td>VW1497-01</td><td>Monohydrat, kryształ 500g</td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwuzasadowy</td><td>VWR international</td><td>VW1496-01</td><td>Bezwodny, proszek 500g</td></tr><tr><td>Woda traktowana DEPC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9922</td><td>1L</td></tr><tr><td>10% roztwór SDS</td><td>Invitrogen</td><td>24730-020</td><td>UltraPure, 1L</td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9262</td><td>pH 8.0, 1L</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td></td></tr><tr><td>pipeta serologiczna 2ml</td><td>VWR international</td><td>89130-884</td><td>polistyrenowa, sterylna</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe BD Falcon</td><td>VWR international</td><td>21008-936</td><td>15ml, sterylne</td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1 v/v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>UltraPure, 100ml</td></tr><tr><td>Urządzenie do wirowania Amicon Ultra-4</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC803024</td><td>membrana Ultracel-30</td></tr><tr><td>Bufor TE 20X, wolny od RNaz</td><td>Invitrogen</td><td>T11493</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>15mg/ml</td></tr></tbody></table>

wyodrębnianie jednoniciowego dna, dwuniciowego dna oraz rna z środowiskowej populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Wirusy, w szczególności bakteriofagi (fagi), są najliczniejszymi bytami biologicznymi na Ziemi1,2. Wirusy modulują liczebność i różnorodność komórek gospodarza, przyczyniają się do obiegu składników odżywczych, zmieniają fenotyp komórki gospodarza oraz wpływają na ewolucję zarówno społeczności komórek gospodarzy, jak i społeczności wirusów poprzez lateralny transfer genów 3. Liczne badania podkreśliły oszałamiającą różnorodność genetyczną wirusów oraz ich potencjał funkcjonalny w wielu środowiskach naturalnych.
Techniki metagenomiczne są wykorzystywane do badania różnorodności taksonomicznej i potencjału funkcjonalnego złożonych zespołów wirusowych, których członkowie posiadają genotypy jednoniciowego DNA (ssDNA), dwuniciowego DNA (dsDNA) oraz RNA 4-9. Obecne protokoły przygotowywania bibliotek stosowane do badania wirusów środowiskowych zawierających DNA lub RNA wymagają wstępnej obróbki nukleazami w celu usunięcia matryc niebędących celem badania 10. Jednakże pełne zrozumienie zbiorczego zestawu genów społeczności wirusów oraz ich różnorodności wymaga wiedzy o wszystkich członkach, niezależnie od składu genomu. Frakcjonowanie oczyszczonych podtypów kwasów nukleinowych stanowi skuteczny mechanizm badania zespołów wirusowych bez utraty części sygnatury genetycznej danej społeczności.
Hydroksyapatyt, krystaliczna forma fosforanu wapnia, jest wykorzystywany w separacji kwasów nukleinowych, a także białek i drobnoustrojów od lat 60. XX wieku11. Poprzez wykorzystanie oddziaływań ładunkowych między dodatnio naładowanymi jonami Ca2+ hydroksyapatytu a ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym podtypów kwasów nukleinowych, możliwe jest preferencyjne eluowanie każdego podtypu kwasu nukleinowego niezależnie od pozostałych. Niedawno zastosowaliśmy tę strategię do niezależnego frakcjonowania genomów wirusów zawierających ssDNA, dsDNA i RNA w celu przygotowania do sekwencjonowania DNA 12. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę frakcjonowania i odzyskiwania wirusowych kwasów nukleinowych ssDNA, dsDNA i RNA z mieszanych zbiorów wirusowych przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie.

Opisujemy wydajną metodę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz cząsteczek RNA z wirusowych społeczności środowiskowych. Kwasy nukleinowe są frakcjonowane przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie z zastosowaniem rosnących stężeń buforów zawierających fosforany. Metoda ta umożliwia izolację wszystkich typów wirusowych kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych.

Wyodrębnianie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowej populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie

Wirusy, a w szczególności bakteriofagi (fagi), są najliczniejszymi bytami biologicznymi na Ziemi1,2. Wirusy modulują liczebność i różnorodność komórek gospodarza, ...

Niniejszy materiał wideo prezentuje procedurę rozdzielania mieszanych zespołów wirusowych na podstawie składu ich kwasów nukleinianowych. Umożliwia to badanie różnorodności taksonomicznej oraz potencjału funkcjonalnego złożonych zespołów wirusowych. W procesie rozdzielania kwasów nukleinianowych zastosowano hydroksyapatyt, krystaliczną formę fosforanu wapnia.W pierwszej kolejności przygotowuje się i równoważy kolumnę z hydroksyapatytem, a następnie nanosi na nią oczyszczone kwasy nukleinowe wirusów; oddziaływanie elektrostatyczne między dodatnio naładowanymi jonami wapnia hydroksyapatytu a ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym poszczególnych podtypów kwasów nukleinowych wiąże je z wypełnieniem kolumny. Następnie jednoniciowy DNA/RNA oraz dwuniciowy DNA są sekwencyjnie eluowane przy użyciu buforu fosforanowego o różnych stężeniach. Otrzymane kwasy nukleinowe są następnie odsalane i zagęszczane w celu przygotowania do wizualizacji, kwantyfikacji i identyfikacji za pomocą sekwencjonowania DNA; elektroforeza w żelu agarozowym potwierdza, że gatunki kwasów nukleinowych mogą zostać rozdzielone przy przenoszeniu (carryover) poniżej 9%.W ten sposób metoda ta umożliwia ocenę różnorodności i potencjału funkcjonalnego społeczności wirusowych. Witam, nazywam się Doug Fro i jestem pracownikiem naukowym w laboratorium dr Shannon Williamson w j Craig Venture Institute. Dzisiaj zaprezentuję Państwu procedurę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowego zbioru wirusów.Metoda ta posiada zalety względem istniejących metod, takich jak obróbka jądra komórkowego, która celuje albo w DNA, albo w RNA. Chromatografia na hydroksyapatycie umożliwia wychwycenie całej populacji wirusów. Metoda ta pozwala nam odpowiedzieć na kilka pytań w dziedzinie ekologii wirusów.Na przykład, jaki jest całkowity zestaw genów lub różnorodność społeczności wirusowej? Po raz pierwszy pomyśleliśmy o tej metodzie, gdy chcieliśmy zbadać całe zgromadzenia planktonu z zatoki Chesapeake, nie poświęcając przy tym części sygnatury genetycznej. Roztwory niezbędne do tego eksperymentu należy przygotować wcześniej zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym; obejmują one bufor fosforanowy 0,12 M, bufor fosforanowy 0,20 M, bufor fosforanowy 0,40 M oraz roztwór fosforanowy 1 M.Wszystkie roztwory przy pH 6.8 oraz hydratyzowany hydroksyapatyt w dniu eksperymentu należy poddać równoważeniu, umieszczając je w kąpieli wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania kolumny econo, która posłuży do separacji kwasów nukleinowych wirusa. Do końca kolumny econo należy przymocować kurek i upewnić się, że jest on zamknięty.Za pomocą pipety należy dodać wodę dejonizowaną do kolumny, następnie nałożyć korek na górną część kolumny i kilkakrotnie ją odwrócić, aby ją przepłukać. Wodę należy odlać i powtórzyć ten proces mycia kilka razy. Następnie należy wyjąć kurek z kolumny econ i wysterylizować go w autoklawie.Kurek nie może być autoklawowany, ponieważ by stopił się pod wpływem temperatury. Przepłucz kurek wodą zjonizowaną, a następnie ponownie 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia po zakończeniu autoklawowania. Zamontuj kurek i zamknij go.Następnie, pracując pod wyciągiem, należy dodać jeden mililitr sigma coat do kolumny i pokryć szkło kolumny, odwracając ją ruchem obrotowym, jak pokazano tutaj. Pokrycie powierzchni sigma coat zminimalizuje przyleganie kwasów nukleinowych do powierzchni szkła. Podczas rozdziału wszystkie powierzchnie szklane zostały pokryte.Otwórz kurek i zlej zawartość do probówki stożkowej. Następnie, aby podłączyć kolumnę do cyrkulacyjnej łaźni wodnej, użyj dwóch zacisków, aby przymocować kolumnę do statywu. Podłącz rurki silikonowe z cyrkulacyjnej łaźni wodnej w taki sposób, aby przepływ wody z łaźni odbywał się od dołu do góry.Ustaw temperaturę na 60 °C i uruchom cyrkulację. W praktyce kolumna oraz przewody powinny zostać owinięte materiałem izolacyjnym, takim jak folia aluminiowa lub piankowa izolacja rur. Aby zminimalizować utratę ciepła, etap ten nie został tutaj przedstawiony.Aby lepiej zobrazować procedurę, należy zamknąć kranik. Za pomocą pipety dodać 10 mililitrów sterylnej wody wolnej od RNazy. Otworzyć kranik i pozwolić wodzie spłynąć.Następnie należy ponownie przeprowadzić mycie zgodnie z procedurą drugiego mycia. Płukanie należy powtórzyć dwukrotnie, używając 10 ml sterylnego, wolnego od RNA buforu fosforanowego 0,12 M, odlewając ciecz pomiędzy kolejnymi płukaniami. Kolumna jest teraz gotowa do chromatografii na hydroksyapatycie.Upewnij się, że kurek stopowy kolumny econ jest zamknięty. Następnie, używając sterylnej pipety serologicznej o pojemności 2 mL, powoli dodaj 2 mL przygotowanej resuspensji rehydratyzowanej hydroksyapatyty na dno kolumny. Nałóż z powrotem zakrętkę kolumny.Pozostawć hydroksyapatyt do osadzenia pod wpływem grawitacji przez 30 minut. Ta metoda wymaga dbałości o szczegóły. Kolumna z hydroksyapatytem pracuje z szybkością od 0,25 do 0,5 ml na minutę.Należy zatem uważnie obserwować kolumnę, aby nie dopuścić do jej wyschnięcia. Po upływie 30 minut należy otworzyć kurek, aby spuścić bufor do pojemnika na odpady. Następnie należy zamknąć kurek i odrzucić frakcję przepływową.Połącz kwasy nukleinowe z 0,12 M buforem fosforanowym do uzyskania końcowej objętości 500 µL i inkubuj w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Pozwoli to na wyrównanie temperatury kwasów nukleinowych do temperatury kolumny i usprawni rozdział poszczególnych gatunków kwasów nukleinowych poprzez usunięcie ewentualnych struktur drugorzędowych. Za pomocą pipety seryjnej o pojemności 2 mL szybko nanieś roztwór kwasów nukleinowych na hydroksyapatyt, dbając o to, aby nie naruszyć kolumny.Po przepływie całej objętości 500 µL na kolumnę, na jej górę można dodać niewielką ilość 0,12 M buforu fosforanowego, aby zapobiec wysychaniu. Pozostawić kwasy nukleinowe do związania z hydroksyapatytem na 30 minut. Po inkubacji wiązania umieścić probówkę stożkową o pojemności 15 mL pod kolumną.Następnie otwórz kurek i pobierz początkową próbkę o objętości 500 µL, która zawiera jednoniciowy DNA. Po pobraniu 500 µL zamknij kurek. Następnie dodaj sześć mililitrów buforu fosforanowego o stężeniu 0,12 M do hydroksyapatytu, dbając o to, aby nie naruszyć kolumny.Następnie otwórz kurek i kontynuuj zbieranie przelywu zawierającego jednoniciowy DNA do tej samej probówki o pojemności 15 mililitrów, co w poprzednim kroku. Po zebraniu około sześciu mililitrów zamknij kurek. Do probówki dodaj objętość roztworu fenol-chloroform-alkohol izoamylowy równą objętości próbki, wymieszaj energicznie za pomocą wortexa, a następnie wiruj przy 3 500 ×g przez 15 minut.Po wirowaniu w probówce powstaną dwie warstwy. Przenieś górną warstwę wodną, zawierającą jednoniciowy DNA, do nowej probówki o objętości 15 ml i przechowuj próbkę w temperaturze pokojowej. Aby eluować i oczyścić RNA z kolumny, dodaj 6 ml 0,20 M buforu fosforanowego i zbierz filtraty do nowej probówki o objętości 15 ml. Następnie przeprowadź ekstrakcję fenolo-chloroformową.W przypadku próbki jednoniciowego DNA powtórz ten proces, używając sześciu mililitrów 0,40 M buforu fosforanowego w celu elucji i oczyszczenia dwuniciowego DNA z kolumny. Na koniec, aby usunąć z kolumny wszelkie pozostałości dwuniciowego DNA, powtórz ten proces jeszcze raz.Tym razem użyj sześciu mililitrów 1,00 M buforu fosforanowego do odsolenia próbek kwasów nukleinowych. Przenieś od czterech do pięciu mililitrów każdej próbki do urządzenia do filtrowania odwirówkowego Ultra 4 z membraną ultrafiltracyjną o progu odcięcia 30 000 Da. Skoncentruj próbkę do objętości poniżej 500 µL, wirując z prędkością 6 000 ×g w temperaturze 30 °C przez około pięć minut w rotorze z kątem stałym. Po odlaniu filtratu dodaj pozostałą część próbek do filtra.Dopełnić objętość do 4–5 ml za pomocą beznukleazowego buforu 1X TE. Następnie ponownie wirować do uzyskania zagęszczonej objętości. Około pięć minut po wirowaniu dodać 4–5 ml beznukleazowego buforu 1X TE do filtra i zagęścić.Powtórz ten etap płukania jeszcze pięć razy, aby całkowicie odsolić próbki kwasów nukleinowych. Gdy próbki zostaną całkowicie zagęszczone i odsolone, przenieś pozostałe kwasy nukleinowe do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Wytrąć kwasy nukleinowe, dodając 1/10 objętości octanu sodu, dwie objętości 100% etanolu oraz 1 µL GlycoBlue, a następnie wymieszaj dokładnie za pomocą vortexa i odwiruj w wirówce.28 000 g w temperaturze 4°C przez 60 minut w wirówce. Należy uważać, aby nie zresuspenderować osadu.Dodaj 300 µL 70% etanolu i wiruj przy 28 000 ×g w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie osusz i resuspenduj każdą frakcję w odpowiedniej objętości buforu TE dla RNA. Równe stężenia kwasów nukleinowych wirusów M13 MP18 (jednoniciowe DNA), MS2 (jednoniciowe RNA), Φ6 (dwuniciowe RNA) oraz lambda (dwuniciowe DNA) zostały połączone, a następnie rozdzielone przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie, co pokazano w tym filmie. Równe stężenia jednoniciowego DNA M13 MP18, jednoniciowego RNA MS2, dwuniciowego RNA Φ6 oraz dwuniciowego DNA Lambda zostały połączone, co przedstawiono w ścieżce 6, i naniesione na kolumnę z hydroksyapatytem, jak widać tutaj.Jednoniciowy DNA/RNA oraz dwuniciowy DNA zostały niezależnie wymyte z kolumny z hydroksyapatytem przy użyciu buforu fosforanowego o stężeniach 0,12 M, 0,18 M, 0,40 M i 1,00 M. Do potwierdzenia wielkości genomów użyto drabinki 1 KB. Wyniki te wskazują, że metoda ta może być skutecznie stosowana do rozdzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA, przy przenoszeniu mniej niż 9% materiału z jednej frakcji do kolejnej.Metodę tę zastosowano również do rozdzielenia kwasów nukleinowych wyizolowanych ze społeczności wirusów w Zatoce Chesapeake, co przedstawiono tutaj. Jednoniciowe DNA/RNA oraz dwuniciowe DNA były niezależnie eluowane przy użyciu stężeń buforu fosforanowego odpowiednio 0,12 M, 0,20 M i 0,40 M lub 1,00 M; w pierwszej ścieżce użyto drabinki DNA o wysokiej masie, a w drugiej drabinki 1 KB, aby wizualnie potwierdzić przybliżoną masę cząsteczkową i masę kwasów nukleinowych, co widać tutaj; dwuniciowe DNA było dominującym typem kwasów nukleinowych wyekstrahowanych z wirio-planktonu z Zatoki Chesapeake. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak rozdzielać kwasy nukleinowe z mieszanego zespołu wirusowego przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie.Obejmuje to przygotowanie kolumny z hydroksyapatytem oraz kwasów nukleinowych, rozdzielenie i elucję kwasów nukleinowych przy użyciu różnych stężeń buforu fosforanowego i odsolenie, a także zagęszczanie kwasów nukleinowych po rozdzieleniu.

separation-single-stranded-dna-double-stranded-dna-rna-from-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Rozdział jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA i RNA z wirusowej społeczności środowiskowej za pomocą chromatografii na hydroxyapatycie

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Przedstawiamy ulepszony protokół izolacji wysokocząsteczkowego DNA z hipersalinitycznych mat mikrobjalnych. Przed ekstrakcją i puryfikacją DNA komórki mikrobjalne są oddzielane od macierzy maty. Pozwala to na zwiększenie stężenia, poprawę jakości oraz zwiększenie rozmiaru DNA. Protokół ten może być stosowany również w przypadku innych próbek trudnych do obróbki.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego DNA z mat mikrobowych

Izotachforeza (ITP) jest wydajną elektrokinetyczną techniką rozdziału i prekonecentracji, znajdującą zastosowanie w wielu obszarach, od detekcji toksyn po przygotowanie próbek. W niniejszym opracowaniu omawiamy zasady fizyczne ITP oraz metodologię zastosowania tej techniki w dwóch konkretnych przykładach: rozdziału i detekcji małych cząsteczek oraz oczyszczaniu kwasów nukleowych z lizatu kultur komórkowych.

Izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół do oceny dostępności organicznych i nieorganicznych składników odżywczych oraz obfitości i struktury społeczności mikroorganizmów i wirusów w odległych środowiskach morskich.

Odkrywanie niewidzialnych graczy w oceanie - przewodnik terenowy po chemii wody i mikrobiologii morskiej

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Ten protokół opisuje opłacalną metodę przyspieszenia ekstrakcji DNA plazmidowego. Wykorzystując niestandardowe, drukowane 3D stojaki kompatybilne ze standardowymi wirującymi stojakami do płytek, naukowcy mogą przetwarzać jednocześnie do 48 kolumn wirujących z kołkami lub do 116 kolumn wirujących bez kołków, co znacznie skraca czas obsługi w porównaniu z ręcznymi metodami mikrowirówkowych.

Ekstrakcja DNA metodą kolumnową o średniej przepustowości z wykorzystaniem racków 24-dołkowych

Poznaj metodę chromatografii hydroksyapatytowej do separacji ssDNA, dsDNA i RNA z próbek środowiskowych. Technika umożliwia izolację kwasów nukleinowych z mniej niż 9% przenoszenia między frakcjami.

Oddzielenie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA i RNA od środowiskowej społeczności wirusowej za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej (Wideo) | JoVE Journal

Wyodrębnianie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowej populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie

Przeglądaj więcej filmów