Oddzielenie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA i RNA od środowiskowej społeczności wirusowej za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej

Ten film przedstawia procedurę rozdzielania mieszanych zespołów wirusów na podstawie ich składu kwasów nukleinowych. Umożliwia to badanie różnorodności taksonomicznej i potencjału funkcjonalnego złożonych zbiorowisk wirusowych. Tutaj hydroksyapatyt, krystaliczna forma fosforanu wapnia, jest stosowany do rozdzielania kwasów nukleinowych.

Najpierw kolumna hydroksyapatytu jest upakowana, a następnie do kolumny nakłada się równowagowo oczyszczone wirusowe kwasy nukleinowe, oddziaływanie ładunku między dodatnio naładowanymi jonami wapnia hydroksyapatytu a ujemnie naładowanym szkieletem fosforanowym podtypów kwasów nukleinowych wiąże kwasy nukleinowe z kolumną Nick. Następnie jednoniciowe, D-N-A-R-N-A i dwuniciowe DNA są sekwencyjnie nawiązywane do różnych stężeń buforu fosforanowego. Powstałe kwasy nukleinowe są następnie odsalane i zagęszczane w celu przygotowania do wizualizacji, kwantyfikacji i identyfikacji za pomocą sekwencjonowania DNA elektroforeza w żelu agros potwierdza, że gatunki kwasów nukleinowych można oddzielić przy przeniesieniu mniejszym niż 9%.

Metoda ta umożliwia zatem ocenę różnorodności i zdolności funkcjonalnych społeczności wirusowych. Cześć, nazywam się Doug Fro i jestem pracownikiem naukowym w laboratorium dr Shannon Williamson w j Craig Venture Institute. Dzisiaj pokażę Wam procedurę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA i RNA od środowiskowego zespołu wirusowego.

Metoda ta ma przewagę nad istniejącymi metodami, takimi jak leczenie jądrem, które jest ukierunkowane na DNA lub RNA. Chromatografia hydroksyapatytowa ma zdolność wychwytywania całej społeczności wirusowej. Metoda ta pozwala nam odpowiedzieć na kilka pytań z zakresu ekologii wirusów.

Na przykład, jaki jest całkowity dopełniacz genów lub różnorodność społeczności wirusowej? Po raz pierwszy pomyśleliśmy o tej metodzie, gdy chcieliśmy zbadać całe zbiorowiska planktonu Rio z Zatoki Chesapeake bez poświęcania części sygnatury genetycznej. Roztwory potrzebne do tego eksperymentu powinny być przygotowane z wyprzedzeniem zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym pisemnym protokole i zawierać 0,12 molowego buforu fosforanowego, 0,20 molowego buforu fosforanowego, 0,40 molowego buforu fosforanowego i jeden molowy roztwór fosforanu.

Wszystko o pH 6,8 i uwodnionym hydroksyapatycie w dniu eksperymentu, zrównoważ wszystkie fosforanowe i uwodniony hydroksyapatyt, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania kolumny ekonowej, która będzie używana do rozdzielania wirusowych kwasów nukleinowych. Przymocuj kran do końca kolumny ekonowej i upewnij się, że jest ona zamknięta.

Za pomocą pipetera dodaj zdejonizowaną wodę do kolumny, a następnie umieść nasadkę na górze kolumny i kilkakrotnie odwróć kolumnę, aby ją przepłukać. Odlej wodę i powtórz to pranie kilka razy. Następnie wyjmij kurek odcinający z kolumny ekonomicznej i przelej go w autoklawie, aby go wysterylizować.

Kurek odcinający nie jest autoklawem, ponieważ się stopi. Przepłukać kurek odcinający wodą jonizowaną, a następnie ponownie 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu po autoklawowaniu. Wymień kurek odcinający i zamknij go.

Następnie, pracując w dygestorium, dodaj jeden mililitr powłoki sigma do kolumny i pokryj szkło kolumny, odwracając kolumnę ruchem tocznym, jak pokazano tutaj. Pokrycie powłoką sigma zminimalizuje przywieranie kwasów nukleinowych do powierzchni szkła. Podczas separacji jedna powierzchnia szkła solnego została pokryta.

Otworzyć kurek odcinający i przelać do stożkowej rurki. Następnie, aby podłączyć kolumnę do obiegowej łaźni wodnej, użyj dwóch zacisków, aby przymocować kolumnę do stojaka pierścieniowego. Przymocuj silikonowe rurki od łaźni z wodą obiegową, tak aby przepływ wody z łaźni wodnej odbywał się od dołu do góry.

Ustaw temperaturę na 60 stopni Celsjusza i uruchom cyrkulację. W praktyce kolumna i rurka byłyby owinięte środkiem izolacyjnym, takim jak folia aluminiowa lub izolacja rur piankowych. Aby zminimalizować straty ciepła, ten krok nie jest tutaj pokazany.

Aby lepiej zobrazować procedurę, zamknij kurek odcinający. Za pomocą pipety dodaj 10 mililitrów sterylnej wody wolnej od RNA. Otwórz kurek odcinający i pozwól, aby woda spłynęła.

Następnie umyj ponownie po drugim praniu. Przepłukać dwukrotnie 10 mililitrami sterylnego buforu fosforanowego 0,12 molowego bez RNA i zdekantować między płukaniami. Kolumna jest teraz gotowa do chromatografii hydroksyapatytowej.

Upewnij się, że kurek odcinający kolumny econ jest zamknięty. Następnie, za pomocą sterylnej dwumililitrowej pipety serologicznej, powoli dodaj dwa mililitry przygotowanego, ponownie zawieszonego, ponownie uwodnionego hydroksy apetytu na dno kolumny. Załóż nasadkę kolumny.

Pozwól, aby apetyt hydroksylowy ustabilizował się pod wpływem siły grawitacji przez 30 minut. Ta metoda wymaga dbałości o szczegóły. Kolumna hydroksy apetytu przetwarza się z szybkością od 0,25 do 0,5 milicala na minutę.

Dlatego bardzo ważne jest, aby uważnie obserwować kolumnę, aby nie wyschła. Po upływie 30 minut otworzyć kurek odcinający, aby spuścić bufor do pojemnika na odpady. Zamknij kurek odcinający i odrzuć przepływ.

Połącz kwasy nukleinowe z 0,12 molowym buforem fosforanowym w końcowej objętości 500 mikrolitrów i inkubuj go w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 10 minut. Spowoduje to zrównoważenie kwasów nukleinowych do temperatury kolumny i poprawi separację różnych gatunków kwasów nukleinowych poprzez usunięcie wszelkich struktur drugorzędowych, które mogą być obecne. Za pomocą dwumililitrowej pipety serologicznej szybko nałóż roztwór kwasu nukleinowego na apetyt hydroksy, uważając, aby nie naruszyć kolumny.

Gdy całe 500 mikrolitrów spłynie na kolumnę, niewielką ilość 0,12-molowego buforu fosforanowego można dodać do górnej części kolumny, aby zapobiec jej wysychaniu. Pozwól kwasom nukleinowym związać się z apetytem hydroksylowym przez 30 minut. Po inkubacji wiązania umieścić stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów pod kolumną.

Następnie otwórz kurek odcinający i zbierz początkową próbkę o pojemności 500 mikrolitrów, która zawiera jednoniciowe DNA. Po zebraniu 500 mikrolitrów zamknij kurek odcinający. Następnie dodaj sześć mililitrów 0,12-molowego buforu fosforanowego do apetytu hydroksylowego, uważając, aby nie naruszyć kolumny.

Następnie otwórz kurek odcinający i kontynuuj zbieranie przepływu przez zawierający singletowe nici DNA w tej samej 15-mililitrowej probówce z poprzedniego kroku. Po zebraniu około sześciu mililitrów zamknij kurek. Dodać jedną objętość roztworu alkoholu fenolowo-chloroformowego i izoamylowego do probówki, energicznie wymieszać przez wirowanie, a następnie odwirować w temperaturze 3 500 razy G przez 15 minut.

Po odwirowaniu probówka będzie zawierała dwie warstwy. Przenieś górną warstwę przyzwolenia, która zawiera pojedynczą nić DNA, do nowej 15-mililitrowej probówki i przechowuj próbkę w temperaturze pokojowej w celu elucji i oczyszczenia RNA Z kolumny dodaj sześć mililitrów 0,20 molowego buforu fosforanowego i zbierz przepływy przed użyciem nowej 15-mililitrowej probówki. Następnie wykonaj ekstrakcję chloroformem fenolowym.

Jeśli chodzi o jednoniciową próbkę DNA, powtórz ten proces, używając sześciu mililitrów 0,40 molowego buforu fosforanowego, aby wymyć i oczyścić dwuniciowe DNA z kolumny. Na koniec, aby usunąć kolumnę z wszelkich pozostałości dwuwątkowego DNA o splotach DNA. Powtórz ten proces jeszcze raz.

Tym razem przy użyciu sześciu mililitrów 1,00 molowego buforu fosforanowego do odsolenia próbek kwasów nukleinowych. Przenieś od czterech do pięciu mililitrów każdej próbki do anon Ultra cztery odśrodkowe urządzenie filtrujące wyposażone w próbkę koncentratu ultra błony komórkowej o masie cząsteczkowej o masie cząsteczkowej o masie cząsteczkowej do mniej niż 500 mikrolitrów, wirując w temperaturze 6 000 GS w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około pięć minut w wirniku o stałym kącie. Po odrzuceniu przepływu, dodać pozostałą część próbek do filtra.

Zwiększ objętość do czterech do pięciu mililitrów za pomocą jednego buforu XTE wolnego od RNA. Następnie ponownie wiruj, aż do uzyskania skoncentrowanej objętości. Około pięciu minut po wirowaniu dodaj cztery do pięciu mililitrów wolnego RNA, jeden bufor XTE do filtra i skoncentruj

Ponownie powtórz to mycie i dodatkowe pięć razy, aby całkowicie odsolić próbki kwasów nukleinowych. Gdy próbki zostaną całkowicie zagęszczone i odsolone, przenieś pozostałe próbki kwasów nukleinowych do sterylnej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra. Wytrącić kwasy nukleinowe, dodając jedną dziesiątą objętości octanu sodu, dwie objętości 100% etanolu i jeden mikrolitr błękitu glikologicznego dobrze wymieszanego przez wirówkę.

28 000 GS cztery stopnie Celsjusza. 60 minut do Kent. Uważając, aby nie naruszyć pelletu.

Dodaj 300 mikrolitrów 70% etanolu wirowania w temperaturze pokojowej 28 000 GS przez 10 minut, aby nie można było wyschnąć i ponownie zawiesić każdą frakcję w odpowiedniej objętości RNA. Wolny bufor TE o równych stężeniach wirusowych kwasów nukleinowych M 13 MP 18, jednoniciowego DNA MS dwuniciowego, RNA FI sześcioniciowego dwuniciowego, RNA i lambda dwuniciowego DNA połączono, a następnie rozdzielono za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej, jak pokazano na tym filmie. Równe stężenia M 13 MP 18, jednoniciowego DNA MS dwóch, jednoniciowego, RNA pięciu sześcioniciowego, RNA i dwuniciowego DNA Lambda połączono, jak pokazano na torze szóstym i nałożono na kolumnę hydroksyapatytu, jak widać tutaj.

Jednoniciowy D-N-A-R-N-A i dwuniciowy DNA zostały niezależnie odniesione z kolumny hydroksyapatytu przy użyciu 0,12 molowego, 0,18 molowego, 0,40 molowego i 1,00 molowego buforu fosforanowego. Do potwierdzenia rozmiarów genomu użyto drabiny o wartości jednego KB. Wyniki te wskazują, że metoda ta może być stosowana do skutecznego oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA i RNA z mniej niż 9% przeniesieniem z jednej frakcji do drugiej.

Metoda ta została również wykorzystana do oddzielenia kwasów nukleinowych wyizolowanych ze społeczności wirusowej w Zatoce Chesapeake, jak pokazano tutaj. Jednoniciowe D-N-A-R-N-A i dwuniciowe DNA zostały niezależnie oznaczone przy użyciu stężeń buforu fosforanowego wynoszących odpowiednio 0,12 mola, 0,20 mola i 0,40 mola lub 1,00 mola drabinka DNA o dużej masie na pierwszym pasie i jedna drabinka KB na drugim pasie zostały wykorzystane do wizualnego potwierdzenia przybliżonej masy cząsteczkowej i masy kwasów nukleinowych, jak można zobaczyć tutaj, Dwuniciowy DNA był dominującym typem kwasu nukleinowego ekstrahowanym z planktonu Chesapeake Bay Verio. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielić kwasy nukleinowe od mieszanego zespołu wirusów za pomocą chromatografii hydroksyapatytowej.

Obejmuje to przygotowanie kolumny hydroksyapatytowej i kwasów nukleinowych, separację i iluzję kwasów nukleinowych przy użyciu różnych stężeń buforu fosforanowego i odsalanie oraz zagęszczanie kwasów nukleinowych po oddzieleniu.