Test fagocytozy żywych komórek komórek podobnych do mikrogleju przy użyciu ludzkich synaptosomów

Weź płytkę wielodołkową zawierającą komórki podobne do mikrogleju wykazujące aktywność fagocytarną.

Inkubuj z plamą jądrową, aby oznaczyć jądra.

Dodaj inhibitor polimeryzacji aktyny do dołka kontroli negatywnej.

Podczas inkubacji inhibitor wiąże się z filamentami aktyny, hamując polimeryzację aktyny i fagocytozę.

Utrzymuj płytkę w niskich temperaturach i dodaj wrażliwe na pH ludzkie synaptosomy znakowane barwnikiem - izolowane fragmenty nerwowych zakończeń synaptycznych.

Odwiruj płytkę w niskich temperaturach, aby promować interakcje komórka-synaptosomy, ale zapobiec przedwczesnemu wchłanianiu.

Przenieś płytkę do systemu obrazowania żywych komórek.

W badanym dołku synaptosomy są fagocytozowane i łączą się z lizosomami, tworząc fagolizosomy. Lizosomalne środowisko kwaśne aktywuje barwnik, powodując jego fluorescencję.

Z biegiem czasu, w studni testowej, więcej synaptosomów zostaje pochłoniętych, powodując dalszy wzrost fluorescencji.

Jednak w dołku kontroli ujemnej polimeryzacja aktyny jest hamowana, co uniemożliwia wychwyt synaptosomy. Uzyskana minimalna fluorescencja potwierdza zależność fluorescencji od fagocytozy za pośrednictwem aktyny.

W dniu testu usuń 40 mikrolitrów pożywki z dołka i dodaj 10 mikrolitrów roztworu do barwienia jądrowego. Inkubuj płytkę przez dwie godziny. Rozmrozić znakowane synaptosomy na lodzie i delikatnie sonikować za pomocą sonikatora wodnego przez jedną minutę. Ponownie natychmiast umieść synaptosomy na lodzie. Rozcieńczyć znakowane synaptosomy i kompletną pożywkę IMG w 1 mikrolitrze synaptosomów na 50 mikrolitrów pożywki.

Do kontroli negatywnej przygotuj 60 mikromolową cytochalazynę D w kompletnym pożywce IMG, aby zahamować polimeryzację aktyny, a tym samym fagocytozę. Następnie dodaj 10 mikrolitrów tego roztworu do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikromolów i inkubować przez 30 minut. Wyjąć płytkę z inkubatora i inkubować w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez 10 minut. Utrzymuj płytkę na lodzie i dodaj 50 mikrolitrów pożywki zawierającej synaptosomy.

Odwiruj płytkę o temperaturze 270 razy g przez trzy minuty w temperaturze 10 stopni Celsjusza i utrzymuj płytkę na lodzie aż do uzyskania zobrazowania. Włóż płytkę do czytnika obrazowania żywych komórek i wybierz studzienki do analizy. Następnie wybierz soczewkę obiektywową 20x. Następnie dostosuj ostrość diody elektroluminescencyjnej lub czasu integracji intensywności LED oraz wzmocnienie jasnego pola i kanałów niebieskich. Fluorescencja synaptosomów powinna być znikoma w początkowym punkcie czasowym.

Wybierz liczbę pojedynczych płytek, które mają być zdobyte w montażu na studnię. Zdobądź 16 pól na środku studni, obrazując około 5% całkowitej powierzchni studni. Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza i żądany przedział czasu do obrazowania.