Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Weź zamrożoną próbkę tkanki mózgowej myszy w buforze.

Próbka jest pokryta platyną w celu uwydatnienia szczegółów powierzchni oraz węglem dla stabilności strukturalnej.

Przenieść próbkę do fiolki z buforem do wytrawiania zawierającym detergent.

Inkubować, aby ułatwić rozpad tkanki, pozostawiając nienaruszoną błonę i białka osadzone w powłoce.

Umyj buforem, aby usunąć zanieczyszczenia.

Dodaj roztwór blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Wprowadź pierwotne przeciwciała specyficzne dla docelowego białka błony neuronalnej.

Przemyć buforem, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi ze złotem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Umyj buforem, aby usunąć nadmiar przeciwciał.

Spłucz wodą, aby zapobiec artefaktom z pozostałości soli podczas mikroskopii.

Zamontuj próbkę na transmisyjnym mikroskopie elektronowym lub siatce TEM.

Pod TEM wizualizuj docelowe białko błony neuronalnej identyfikowane przez cząsteczki złota, które pojawiają się jako czarne kropki.

W celu roztwarzania SDS przenieść replikę do 4-mililitrowej szklanej fiolki wypełnionej 1 mililitrem buforu do wytrawiania SDS. Pozostaw do strawienia na 18 godzin w temperaturze 80 stopni Celsjusza, wstrząsając. W celu znakowania immunologicznego myć replikę przez 10 minut w świeżym buforze do trawienia SDS. Następnie inkubuj go z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi rozcieńczonymi w 2% BSA TBS w wilgotnej komorze w temperaturze 15 stopni Celsjusza przez 24 do 72 godzin.

Następnie zamontuj replikę na pokrytej formvarem, 100-liniowej siatce równoległych prętów. Zobrazuj replikę za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego o napięciu 80 lub 100 kilowoltów. Następnie uzyskaj obrazy cyfrowe za pomocą kamery CCD.