Barwienie immunologiczne neuronów w wycinkach mózgu myszy po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Weź stałe i przepuszczalne wycinki mózgu myszy zawierające neurony, w tym neurony cholinergiczne wyrażające acetylotransferazę choliny.

Plastry są poddawane fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia docelowych mRNA zlokalizowanych w aksonach cholinergicznych, co skutkuje wzmocnieniem sygnałów za pomocą sond fluorescencyjnych, które są wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Dodaj roztwór blokujący zawierający białka i środek gaszący. Białka zapobiegają niespecyficznemu wiązaniu, a środek wygaszający neutralizuje resztkowe utrwalacze.

Inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które celują w neuronalną acetylotransferazę choliny.

Przemyć buforem, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Inkubuj z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, które wiążą się z pierwszorzędowymi przeciwciałami związanymi z acetylotransferazą choliny.

Umyj buforem, aby usunąć nadmiar przeciwciał, a następnie spłucz wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości buforu.

Zamontuj plastry za pomocą nośnika montażowego zawierającego plamę jądrową, aby oznaczyć jądra.

Korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej, zobrazuj wycinki, aby uwidocznić docelowe sygnały mRNA i cholinergiczne aktsony