Barwienie immunologiczne neuronów w wycinkach mózgu myszy po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Weź stałe i przepuszczalne wycinki mózgu myszy zawierające neurony, w tym neurony cholinergiczne wyrażające acetylotransferazę choliny.

Plastry są poddawane fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia docelowych mRNA zlokalizowanych w aksonach cholinergicznych, co skutkuje wzmocnieniem sygnałów za pomocą sond fluorescencyjnych, które są wykrywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Dodaj roztwór blokujący zawierający białka i środek gaszący. Białka zapobiegają niespecyficznemu wiązaniu, a środek wygaszający neutralizuje resztkowe utrwalacze.

Inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które celują w neuronalną acetylotransferazę choliny.

Przemyć buforem, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Inkubuj z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem, które wiążą się z pierwszorzędowymi przeciwciałami związanymi z acetylotransferazą choliny.

Umyj buforem, aby usunąć nadmiar przeciwciał, a następnie spłucz wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości buforu.

Zamontuj plastry za pomocą nośnika montażowego zawierającego plamę jądrową, aby oznaczyć jądra.

Korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej, zobrazuj wycinki, aby uwidocznić docelowe sygnały mRNA i cholinergiczne aktsony barwione specyficznymi przeciwciałami.

Przykryj każdą plasterkę 100 do 200 mikrolitrami roztworu blokującego, zawierającego trzy miligramy na mililitr BSA, 100 milimolową glicynę i 0,25% Triton X-100 w PBS. Przykryj każde szkiełko parafilmem i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji, w ilości od 100 do 200 mikrolitrów przeciwciała rozcieńczonego w roztworze blokującym do szkiełek, stosuje się tutaj przeciwciało acetylotransferazy antycholinowej. Po przykryciu szkiełka parafilmem inkubować przez dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Upewnij się, że plasterki mózgu nie wysychają. W razie potrzeby ponownie nałóż roztwór przeciwciała anty-chAT na wycinki mózgu 24 godziny po inkubacji.

Po trzykrotnym umyciu szkiełek w 1X PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, dodaj do szkiełek od 100 do 200 mikrolitrów odpowiedniego sprzężonego przeciwciała wtórnego Alexa. Przykryj parafilmem i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Po upływie godziny umyj szkiełka trzy razy w 1X PBS przez pięć minut każde, tak jak poprzednio, a następnie umyj raz wodą destylowaną. Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego zawierającego DAPI. A następnie wizualizuj wycinki mózgu pod mikroskopem fluorescencyjnym.