Name: Kwantyfikacja i analiza powstawania translokacji chromosomowych stymulowanych przez endonukleazę HO przez wyżarzanie jednoniciowe u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę wyżarzania jednoniciowego do analizy translokacji chromosomowych wywołanych endonukleazą HO u Saccharomyces cerevisiae. Technika ta pozwala badać kontrolę genetyczną rearanżacji genomu i stabilność DNA po napromieniowaniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana ze środków National Institutes of Health oraz Beckman Research Institute of the City of Hope. Chcielibyśmy podziękować recenzentom za konstruktywne uwagi, które przyczyniły się do zwiększenia przejrzystości manuskryptu.

1. Częstotliwości translokacji stymulowanych przez HO
<ol>
	<li>Zaszczep 10-20 niezależnych kultur o objętości 1 ml w podłożu YPGly/Lac (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 3% glicerolu i 3% mleczanu) pojedynczymi koloniami pożądanego genotypu. Inkubuj kultury przez noc lub przez czas wystarczający do osiągnięcia gęstości komórkowej około 5x107-1x108 cell/ml, w temperaturze 30°C na rotatorze lub przy delikatnym mieszaniu. </li>
	<li>Dodaj do kultur galaktozę do stężenia końcowego 2%, aby indukowć pęknięcia dwuniciowe (DSBs) kierowane przez endonukleazę HO w substratach translokacji his3-Δ3' (chromosom III) i his3-Δ5' (chromosom XV). </li>
	<li>Inkubuj przez 4 h w temperaturze 30°C na rotatorze lub przy delikatnym mieszaniu.</li>
	<li>Po 4 h wysiej odpowiednie rozcieńczenia kultur na podłoże YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy), aby uzyskać około 100 do 200 kolonii na płytce, oraz wystarczającą liczbę komórek na podłoże pozbawione histydyny, aby uzyskać obserwowalną liczbę rekombinantowych kolonii His+. Inkubuj płytki w temperaturze 30°C przez dwa do trzech dni. </li>
</ol>
UWAGA: Krok 1.4 opisuje oznaczenie częstości translokacji w warunkach selekcyjnych poprzez wysiew kultur na podłoże pozbawione histydyny. Test ten można przeprowadzić również w warunkach nieselekcyjnych, wysiewając kultury na podłoże YPD, a następnie wykonując wysiew replikacyjny powstałych kolonii na płytki –His po dwóch lub trzech dniach. Metody te dają zbliżone częstości translokacji (Rysunek 2C). 
<ol start="5">
	<li>Wyznacz częstotliwość translokacji, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych względem histydyny przez całkowitą liczbę wysianych żywych komórek (wyznaczoną poprzez wysianie rozcieńczeń na podłożu YPD). Oblicz medianę częstotliwości translokacji oraz 95% przedział ufności15.</li>
</ol>
2. Wydajność wysiewu
<ol>
	<li>Pobrać aliquot komórek z każdej hodowli nocnej i określić liczbę komórek za pomocą licznika komórkowego (Baxter Healthcare Corporation. Catolog #: B3178-1).</li>
	<li>Wysiać około 100 do 200 komórek na podłoże YPD, stosując odpowiednie rozcieńczenie. Inkubować przez dwa do trzech dni w temperaturze 30°C (np. dla hodowli o gęstości 1x108 komórek/ml należy wysiać 100-200 μl rozcieńczenia 10-5 na płytkę).</li>
	<li>Dodać do hodowli 20% galaktozy do stężenia końcowego 2%.</li>
	<li>Po 4 h pobrać aliquot komórek z każdej hodowli, określić liczbę komórek za pomocą licznika komórkowego i wysiać około 100 do 200 komórek na podłoże YPD, stosując odpowiednie rozcieńczenie. Inkubować przez dwa do trzech dni w temperaturze 30°C.</li>
	<li>Wyznaczyć wydajność wysiewu, dzieląc liczbę kolonii powstałych na podłożu YPD przez liczbę wysianych komórek, a następnie mnożąc otrzymany iloraz przez 100. Obliczyć medianę procentową z 95% przedziałem ufności.</li>
</ol>
3. Analiza genomiczna metodą Southern blot
<ol>
	<li>Wybrać pojedynczą kolonię rekombinacyjną His+ z każdego niezależnego doświadczenia i przygotować DNA genomowe16.</li>
	<li>Strawić około 4 μg DNA za pomocą endonukleazy restrykcyjnej BamHI.</li>
	<li>Rozdzielić fragmenty strawione enzymem BamHI na żelu agarozowym 0,7% i przenieść je na dodatnio naładowaną membranę nylonową (Hybond N+, GE Healthcare. Numer produktu: RPN303B)17.</li>
	<li>Przeprowadzić hybrydyzację z sondą znakowaną 32P, otrzymaną metodą random priming (Amersham Biosciences. Numer produktu: RPN1604), wykorzystując klon genomowy BamHI/BamHI o wielkości 1,8 kb zawierający gen HIS3.</li>
	<li>Wizualizować fragmenty DNA za pomocą autoradiografii lub obrazowania fosforowego.</li>
</ol>
4. Analiza chromosome blot z wykorzystaniem chromosomów rozdzielonych w jednorodnym polu elektrycznym o zmiennej konfiguracji (CHEF):
<ol>
	<li>Przygotowanie chromosomów z wybranych rekombinantów His+ w czopkach agarozowych18:
		<ul>
			<li>Hodowlę płynną kandydującego rekombinanta His+ zawierającego chromosom tXV::III prowadzić w 5 ml pożywki YPD do uzyskania stężenia około 1-2 x 108 komórek/ml.</li>
			<li>Odwirować i przemyć komórki 2 razy w 50 mM EDTA.</li>
			<li>Resuspendować komórki w około 200 μl 50 mM EDTA i ogrzać do 50°C.</li>
			<li>Dodać taką samą objętość stopionej 2% (w/v) agarozy niskotopliwej rozgrzanej do 50°C, dokładnie wymieszać.</li>
			<li>Rozlać aliquoty o objętości około 80 μl do form do czopków i pozostawić do schłodzenia na 30 min w 4°C.</li>
			<li>Wysunąć czopki z formy do płytki 12-dołkowej. W każdym dołku można umieścić do pięciu czopków.</li>
			<li>Do każdego dołka dodać 3 ml świeżo przygotowanego roztworu do sferoplastyki (14 mM 2-β-merkaptoetanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg/ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M sorbitol). Inkubować w 37°C przez 4 godziny przy łagodnym wytrząsaniu.</li>
			<li>Usunąć roztwór do sferoplastyki i zastąpić go 3 ml roztworu LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA, 1% (w/v) dodecylosiarczanu litu, pH dostosowane do 8.0). Inkubować w 37°C przez 15 min przy łagodnym wytrząsaniu.</li>
			<li>Usunąć roztwór LDS i zastąpić go kolejną 3 ml alikwotą LDS. Inkubować w 37°C przez noc przy łagodnym wytrząsaniu.</li>
			<li>Usunąć LDS i zastąpić go 3 ml 0,2 X NDS (0,6 g zasady Tris, 93 g dwuwodnego EDTA dwusodowego, 5 g N-lauroylosarkozyny, pH dostosowane do 8.0, dopełnić do 500 ml wodą dH2O). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min przy łagodnym wytrząsaniu. Usunąć NDS i powtórzyć czynność 2 razy.</li>
			<li>Usunąć NDS i zastąpić go 3 ml buforu TE. Przemywać przy łagodnym wytrząsaniu przez 30 min w temperaturze pokojowej. Powtórzyć 4 razy.</li>
			<li>Przechowywać czopki w 4°C w 2 ml buforu TE. Czopki mogą być przechowywane do roku.</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Rozdzielić chromosomy na 1% żelu agarozowym przy użyciu aparatu Bio-Rad CHEF-DRII w 14°C (Katalog #: 170-3612).</li>
</ol>
Parametry: 1.st blok: czas przełączania 70s, 15h przy 6V/cm. 
2.nd blok: czas przełączania 120s, 11h przy 6V/cm
<ol start="3">
	<li>Wizualizuj chromosomy poprzez barwienie 1μg/ml bromkiem etydyny przez 30 min, naświetlanie dawką 60 mJ UV w urządzeniu UV Stratalinker (Stratagene) oraz odbarwianie przez 30 min w dH2O. Naświetlanie chromosomów zabarwionych bromkiem etydyny powoduje nacięcia w DNA, co umożliwia wydajny transfer na membranę.</li>
	<li>Przenieś chromosomy na membranę dodatnio naładowaną (Hybond N+, GE Healthcare. Product Code: RPN303B) drogą kapilarną w warunkach denaturujących (0.4N NaOH, 1.5M NaCl).</li>
	<li>Przeprowadź hybrydyzację z sondą znakowaną 32P, otrzymaną metodą random priming (Amersham Biosciences. Product Code: RPN1604), z wykorzystaniem klonu genomicznego BamHI/BamHI o wielkości 1.8 kb zawierającego gen HIS317.</li>
	<li>Wizualizuj chromosomy za pomocą autoradiografii lub obrazowania fosforowego.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Graficzna reprezentacja testu translokacji przedstawiona jest na poziomie chromosomowym (Rycina 1). Przedstawiono również schemat procedury eksperymentalnej (Rycina 2A). Wydajność wysiewu przed i po indukcji określa się poprzez podzielenie całkowitej liczby żywych komórek tworzących kolonie przez całkowitą liczbę ciał komórkowych w hodowli, wyznaczoną za pomocą licznika hemocytometrem (Rycina 4B). Wydajności wysiewu przed i po indukcji nie różniły się istotnie dla komórek typu dzikiego (p-value= 0.1400) (Tabela 1).
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tabela danych dotyczących żywotności kultur komórkowych z miernikami ciał komórkowych, żywych komórek i wydajności wysiewania przed i po indukcji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Wydajność wysiewania przed i po indukcji w komórkach typu dzikiego.
a Liczbę ciał komórkowych na mililitr określa się za pomocą licznika komórek (hemacytometru). 
b Liczbę żywych komórek na mililitr określa się poprzez wysiew odpowiednich rozcieńczeń na podłoże nieselektywne w celu uzyskania ˜100-200 kolonii. 
cWydajność wysiewu przed i po indukcji określa się poprzez podzielenie całkowitej liczby żywych komórek tworzących kolonie przez całkowitą liczbę ciał komórkowych w hodowli, wyznaczoną za pomocą licznika komórek (hemacytometru).
Sugeruje to, że obecność lub brak któregokolwiek z chromosomów z translokacją nie wpływa na zdolność do przetrwania powstawania DSB. Częstotliwość translokacji chromosomowych można obliczyć, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych względem histydyny przez całkowitą liczbę żywych komórek wyznaczoną poprzez wysiew na podłoże YPD (Ryc. 2B). Analizę tę można przeprowadzić z użyciem szczepów o różnych genotypach, aby zidentyfikować, jak utrata funkcji białka wpływa na SSA (np. rad51Δ-/-). Częstotliwości rekombinacji wyznaczone w różnych szczepach można następnie przedstawić na wykresie, aby porównać różnice w zdolności tych szczepów do naprawy DSB indukowanych przez endonukleazę HO za pomocą SSA (Ryc. 2C). Częstotliwości translokacji uzyskane dla diploidalnego szczepu typu dzikiego w warunkach selekcyjnych (2.2x10-2) i nieselekcyjnych (2.17x10-2) nie różniły się od siebie statystycznie (p-value= 0.9131), podczas gdy częstotliwości translokacji uzyskane selekcyjnie (6.0x10-2) i nieselekcyjnie (11.9x10-2) u homozygoty rad51Δ-/- były podobne, lecz różniły się statystycznie (p-value= 0.0089). Częstotliwości uzyskane zarówno selekcyjnie (p-value=0.0001), jak i nieselekcyjnie (p-value=0.0002) u homozygoty rad51°-/- różniły się statystycznie od tych uzyskanych w odpowiadających im warunkach dla szczepu typu dzikiego.
Klonów z domniemaną translokacją można poddać dalszej analizie za pomocą genomowej analizy Southern blot oraz analizy chromosomal blot (Rycina 3). W przypadku analizy Southern, DNA genomowe jest trawione endonukleazą BamHI przed elektroforezą w żelu agarozowym, transferem na membranę i hybrydyzacją z sondą HIS3 o długości 1,8 kb znakowaną 32P, aby zwizualizować diagnostyczne fragmenty: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3', 4 kb tIII::XV, 5 kb tXV::III oraz 8 kb his3-Δ5' (Rycina 3B.1). Nienaruszone chromosomy można przygotować, rozdzielić metodą CHEF (Rycina 3B.2), przenieść na membranę nylonową i poddać hybrydyzacji z sondą HIS3 o długości 1,8 kb znakowaną 32P, aby zwizualizować nienaruszony chromosom XV o wielkości 1,1 Mb, chromosom z translokacją tXV:III o wielkości 0,8 Mb, chromosom z translokacją tIII:XV o wielkości 0,6 Mb oraz nienaruszony chromosom III o wielkości 0,3 Mb (Rycina 3B.3). Przedstawiona jest mapa graficzna obrazująca oczekiwane fragmenty DNA genomowego trawionego endonukleazą BamHI oraz chromosomy rodzicielskie i rekombinowane (Rycina 3A). 
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Schemat edycji genów pokazujący procesy integracji i delecji HIS3 z użyciem strzałek i symboli." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Powstawanie chromosomów translokacyjnych poprzez odżarzanie jednoniciowe (SSA). 1) DSB są tworzone w substratach his3-Δ3' oraz his3-Δ5' (odpowiednio w chromosomach XV i III) przez endonukleazę HO po dodaniu galaktozy do kultur. 2) DSB są przetwarzane w celu wygenerowania jednoniciowych końców 3' na końcach pękniętych chromosomów. 3) Aparat SSA odżarza komplementarne jednoniciowe sekwencje HIS3 o długości 311 lub 60 nukleotydów utworzone w każdym z substratów rekombinacji. Niehomologiczne ogony powstałe w wyniku odżarzania są usuwane poprzez trawienie endonukleazą. Komplementarne nawisy o długości 4 bp w pozostałych fragmentach chromosomowych utworzone przez trawienie endonukleazą HO mogą również ulec odżarzaniu. 4) Ligacja kończy proces tworzenia nienaruszonego genu HIS3 oraz chromosomu translokacyjnego tXV::III poprzez SSA. Komórki posiadające ten chromosom można wyselekcjonować na podstawie ich zdolności do wzrostu na pożywce pozbawionej histydyny. Ligacja może również prowadzić do powstania odwrotnego chromosomu translokacyjnego tIII::XV poprzez mechanizm podobny do NHEJ.
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Metoda określania częstotliwości rekombinacji drożdży: schemat z równaniami i wykresem słupkowym przedstawiający układ eksperymentalny i wyniki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Test określania częstotliwości translokacji przez SSA. A) Jeden ml kultur YPGly/Lac szczepionych jest pojedynczymi koloniami komórek o wybranym genotypie i hodowanych do odpowiedniej gęstości wynoszącej około 5x107-1x108 komórek/ml. Dodaje się galaktozę do stężenia końcowego 2%, aby wywołać pęknięcia dwuniciowe (DSBs) w substratach rekombinacyjnych na chromosomach III i XV. Aby przeprowadzić test w warunkach selekcyjnych, wykonuje się odpowiednie rozcieńczenia w taki sposób, aby na pożywkę YPD wysiać około 100 do 200 komórek, a na pożywkę pozbawioną histydyny wysiać wystarczającą liczbę komórek, by uzyskać obserwowalną liczbę rekombinowanych kolonii His+. Aby przeprowadzić test bez selekcji, około 100 do 200 komórek wysiewa się na YPD, hoduje przez dwa do trzech dni do momentu powstania pojedynczych kolonii, a następnie przenosi metodą replica plating na pożywkę pozbawioną histydyny. B) Częstotliwość translokacji można określić, dzieląc liczbę kolonii rosnących na płytkach –His przez frakcję rosnącą na YPD. C) Częstotliwości translokacji szczepów o różnych genotypach (tj. typu dzikiego oraz rad51Δ-/-) można przedstawić na wykresie w celu porównania różnic w zdolności tych szczepów do naprawy DSBs drogą SSA.
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Proces rozcieńczania kultury drożdży; liczenie w komorze hemacytometrycznej; wzór na wydajność wysiewu; schemat." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wyznaczanie wydajności wysiewu. (A) Przed i po indukcji DSB z kultury nocnej pobiera się alikwot komórek, wykonuje odpowiednie rozcieńczenia, a następnie przeprowadza liczenie w komorze hemacytometrycznej w celu określenia całkowitej liczby komórek w ml kultury. Odpowiednie rozcieńczenia wysiewa się na podłoże nieselektywne, aby określić całkowitą liczbę żywych komórek w ml poprzez zliczenie kolonii pojawiających się na podłożu YPD. (B) Wydajność wysiewu wyznacza się następnie poprzez podzielenie całkowitej liczby żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek i pomnożenie uzyskanego ilorazu przez 100.
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Schemat reorganizacji chromosomów, wyniki elektroforezy żelowej; analiza rekombinacji genetycznej, locus HIS3." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wykrywanie zdarzeń translokacji chromosomowych za pomocą analizy Southern blot DNA genomowego oraz chromosome blot. 
A) Graficzna reprezentacja odpowiednich chromosomów przed (lewo) i po (prawo) powstaniu translokacji. 
Wielkości chromosomów rodzicielskich i rekombinacyjnych podano w megoparach zasad (Mb). Wielkości fragmentów restrykcyjnych zawierających odpowiednie sekwencje, wygenerowanych poprzez trawienie BamHI DNA genomowego szczepów rodzicielskich i rekombinacyjnych i uwidocznionych na blotach poprzez hybrydyzację z 1,8 kb genomowym klonem BamHI HIS3, podano w kiloparach zasad (kb). Chromosomy nie są narysowane w skali. 
B) Analiza fizyczna domniemanych klonów z translokacją. 
(1) Analiza Genomic Southern blot – DNA genomowe zostało wyizolowane i strawione endonukleazą restrykcyjną BamHI, rozdzielone za pomocą elektroforezy żelowej, przeniesione na membranę nylonową i poddane hybrydyzacji z sondą HIS3 1,8 kb znakowaną 32P w celu uwidocznienia następujących fragmentów: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3', 4 kb tIII::XV, 5 kb tXV::III oraz 8 kb his3-Δ5'. Ścieżki: a) diploida rodzicielska, b) rekombinant z niezwrotną translokacją His+, c) rekombinant ze zwrotną translokacją His+. 
(2) Żele CHEF – Nienaruszone chromosomy przygotowano w czopach agarozy, rozdzielono metodą CHEF, zabarwiono bromkiem etydyny i uwidoczniono w świetle UV. Ścieżki: jak wyżej. 
(3) Chromosome blots – Rozdzielone chromosomy przeniesiono na membranę nylonową i poddano hybrydyzacji z sondą HIS3 1,8 kb znakowaną 32P w celu uwidocznienia następujących chromosomów: 1,1 Mb nienaruszony chromosom XV, 0,8 Mb chromosom translokacyjny tXV:III, 0,6 Mb chromosom translokacyjny tIII:XV oraz 0,3 Mb nienaruszony chromosom III. Ścieżki: jak wyżej.

<ol><li>Sen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genomic+deletions+mediated+by+recombination+between+Alu+elements%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements.</a> The American Journal of Human Genetics. 79, 41-53 (2006).</li>
<li>Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alu+recombination-mediated+structural+deletions+in+the+chimpanzee+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">Alu recombination-mediated structural deletions in the chimpanzee genome.</a> Plos Genetics. 3, 1939-1949 (2007).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+in+human+health%2C+disease%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Copy number variation in human health, disease, and evolution.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 451-481 (2009).</li>
<li>Goodier, J. L., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposons+revisited%3A+The+restraint+and+rehabilitation+of+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrotransposons revisited: The restraint and rehabilitation of parasites.</a> Cell. 135, 23-35 (2008).</li>
<li>Lanktree, M., Hegele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+in+metabolic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Copy number variation in metabolic phenotypes.</a> Cytogenet Genome Res. 123, 169-175 (2008).</li>
<li>Mullighan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+genetic+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia.</a> Nature. 446, 758-764 (2007).</li>
<li>Mattarucchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microhomologies+and+interspersed+repeat+elements+at+genomic+breakpoints+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microhomologies and interspersed repeat elements at genomic breakpoints in chronic myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 47, 625-632 (2008).</li>
<li>Stenger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+distribution+of+inverted+and+direct+Alus+in+the+human+genome%3A+implications+for+insertion%2C+exclusion%2C+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability.</a> Genome Res. 11, 12-27 (2001).</li>
<li>Hedges, D., Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inviting+instability%3A+Transposable+elements%2C+double-strand+breaks%2C+and+the+maintenance+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Inviting instability: Transposable elements, double-strand breaks, and the maintenance of genome integrity.</a> Mutat Res. 616, 46-59 (2007).</li>
<li>Symington, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RAD52+epistasis+group+genes+in+homologous+recombination+and+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66, 630-670 (2002).</li>
<li>Lewis, L., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tying+up+loose+ends%3A+nonhomologous+end-joining+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat Res. 451, 71-89 (2000).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD59+is+required+for+efficient+repair+of+simultaneous+double-strand+breaks+resulting+in+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> DNA Repair (Amst). 7, 788-800 (2008).</li>
<li>Nicholas, R., Pannunzio, G. M. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD59+and+RAD1+cooperate+in+translocation+formation+by+single-strand+annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 56, 87-100 (2010).</li>
<li>Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+Inhibits+Translocation+Formation+by+Non-Conservative+Homologous+Recombination+in+Saccharyomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Rad51 Inhibits Translocation Formation by Non-Conservative Homologous Recombination in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Knight, W. Confidence Intervals for the Median: Two sided Symmetric --95 or Better. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.math.unb.ca/~knight/utility/MedInt95.htm">http://www.math.unb.ca/~knight/utility/MedInt95.htm</a> (2006).</li>
<li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57, 267-272 (1987).</li>
<li>Sambrook, J., MacCallum, P., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Iadonato, S. P., Gnirke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RARE-cleavage+analysis+of+YACs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RARE-cleavage analysis of YACs.</a> Methods Mol. Biol. , 75-85 (1999).</li>
<li>Argueso, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+associated+with+repetitive+DNA+can+reshape+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks associated with repetitive DNA can reshape the genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 11845-11850 (2008).</li>
<li>Batzer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alu+repeats+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetic+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Alu repeats and human disease.</a> Molecular Genetic Metabolism. 67, 183-193 (1999).</li>
<li>Fasullo, M., Dave, P., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-damaging+agents+stimulate+the+formation+of+directed+reciprocal+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-damaging agents stimulate the formation of directed reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat. Res. 314, 121-133 (1994).</li>
<li>Richardson, C., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+chromosomal+translocations+induced+by+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks.</a> Nature. 405, 697-700 (2000).</li>
<li>Look, A. T. Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphomas. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLook%2C+AT+%22The+Genetic+Basis+of+Human+Cancer%22">The Genetic Basis of Human Cancer</a>. , McGraw Hill. (2002).</li>
<li>Fasullo, M. T., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+of+chromosome+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+use+of+his3+recombinational+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direction of chromosome rearrangements in Saccharomyces cerevisiae by use of his3 recombinational substrates.</a> Mol. Cell. Biol. 8, 4370-4380 (1988).</li>
<li>Manthey, G. M., Naik, N., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Msh2+Blocks+an+Alternative+Mechanism+for+Non-Homologous+Tail+Removal+during+Single-Strand+Annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Msh2 Blocks an Alternative Mechanism for Non-Homologous Tail Removal during Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 4, e7488-e7488 (2009).</li>
<li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiation+Oncology+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li>
<li>Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells%3A+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li>
<li>Ivanov, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Requirements+for+the+single-strand+annealing+pathway+of+double-strand+break+repair+in+Saccharyomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Genetics. 142, 693-704 (1996).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wysokie dawki promieniowania jonizującego niosą ze sobą immanentne ryzyko niestabilności genomu poprzez generowanie licznych DSB19. Genomy eukariotyczne obfitują w sekwencje repetytywne, które stanowią doskonałe substraty do powstawania translokacji i innych rearanżacji genomowych20,21. Translokacje chromosomalne zachodzące drogą HR są często obserwowane, gdy DSB są wprowadzane pomiędzy sekwencje repetytywne12,21,22. Przekonujące dowody sugerują, że znaczną część niestabilności genomowej związanej z białaczkami i chłoniakami można przypisać translokacjom chromosomalnym, co podkreśla wagę zrozumienia mechanizmu ich powstawania u eukariotów22,23. Opracowaliśmy system w drożdżach pączkujących do badania formowania chromosomów translokacyjnych poprzez indukowaną DSB HR pomiędzy krótkimi regionami homologii na różnych chromosomach, których rozmiar jest zbliżony do elementów repetytywnych rozproszonych w genomach drożdży i ludzi.
W tym teście substrat translokacji his3-Δ3' znajduje się na jednej kopii chromosomu XV. Drugi allel his3 (his3-Δ200) posiada delecję ok. 1kb promotora i sekwencji kodującej HIS3, co zapobiega wykorzystaniu tej sekwencji jako matrycy do naprawy24. Substrat his3-Δ5' znajduje się w locus LEU2 na jednej kopii chromosomu III, podczas gdy druga kopia chromosomu III zawiera niezmieniony allel LEU2 (Rycina 1). Kaseta ekspresyjna endonukleazy HO indukowana galaktozą, oznakowana KAN-MX, została wstawiona do locus TRP1 chromosomu IV (trp1::GAL-HO-KAN-MX). Każdy substrat translokacji jest flankowany przez sekwencję rozpoznawania endonukleazy HO, która może zostać poddana cięciu poprzez indukcję ekspresji genu HO za pomocą dodania galaktozy do pożywki. Po cięciu substratów his3-Δ3' oraz his3-Δ5' indukowanym przez endonukleazę HO, komórki mogą efektywnie wykorzystać wspólny krótki odcinek homologii sekwencji HIS3 (311 bp lub 60 bp), aby naprawić uszkodzone chromosomy w drodze HR, generując chromosom translokowany z nienaruszonym allelem HIS312-14,25.
Ponieważ komórki rodzicielskie nie posiadają nienaruszonej kopii genu HIS3, nie są one w stanie rosnąć na podłożu –His. Na podłożu pozbawionym histydyny można wyselekcjonować jedynie komórki, w których doszło do translokacji. W związku z tym częstotliwość translokacji chromosomowych można obliczyć, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych względem histydyny przez całkowitą liczbę żywotnych komórek wysianych, określoną poprzez wysiew na podłoże YPD. Następnie z reprezentatywnych kolonii His+ można wyizolować DNA genomowe i nienaruszone chromosomy, a obecność chromosomu z translokacją zweryfikować za pomocą analizy Southern blot DNA genomowego oraz analizy chromosome blot.
Dokładna analiza pozwoliła nam zebrać dodatkowe istotne informacje na temat testu12. Analiza genomiczna metodą Southern blot dostarczyła dowodów na niemal całkowite cięcie chromosomów XV i III po 30 minutach indukcji endonukleazy HO, w związku z czym w populacji nie występuje istotne tło nieprzeciętych substratów chromosomalnych (G. Manthey &amp; A. Bailis, wyniki niepublikowane). Analizy genomiczne Southern blot oraz chromosome blot przeżywalników His- wskazują, że komórki często tracą jeden, drugi lub oba przecięte chromosomy, a mimo to pozostają żywotne (L. Liddell &amp; A. Bailis, wyniki niepublikowane). Co istotne, niemal równa wydajność wysiewu na podłożu nieselektywnym przed i po indukcji ekspresji endonukleazy HO wskazuje, że ani brak naprawy uszkodzonych chromosomów, ani brak zachowania chromosomów translokacyjnych nie wpływa na zdolność do przeżycia po powstaniu DSB. Zgodnie z tym wykazano, że chromosom translokacyjny tXV:III jest niestabilny w komórkach mitotycznych w warunkach braku selekcji. Zademonstrowano to poprzez nocną hodowlę rekombinantów His+ zawierających tXV::III na podłożu nieselektywnym, wysiewanie pojedynczych kolonii na płytki nieselektywne, a następnie przenoszenie ich metodą replica plating na podłoże selektywne pozbawione histydyny. Od 10% do 70% kolonii powstałych na tych płytkach utraciło chromosom translokacyjny tXV::III (N. Pannunzio &amp; A. Bailis, wyniki niepublikowane). 
Chromosomy z translokacjami powstałe w wyniku ekspozycji na promieniowanie jonizujące (IR) u ludzi wykazują podobną niestabilność26. Sugeruje to, że powstawanie translokacji może przyczyniać się do wczesnych zdarzeń w procesie tumorigenzy poprzez promowanie utraty heterozygotyczności. Po drugie, rozległe analizy genetyczne i molekularne wskazują, że SSA, wydajny i obligatoryjnie niekonserwatywny mechanizm HR, jest głównym mechanizmem powstawania translokacji poprzez HR po jednoczesnym powstaniu DSBs na dwóch chromosomach12,27,28. Jest to zgodne z odkryciem, że duże dawki IR prowadzą do gęstości DSBs wystarczającej do stworzenia pęknięć w sąsiedztwie wielu sekwencji repetytywnych w genomie drożdży oraz do wysokiej częstotliwości powstawania translokacji przez HR. Wspólnie obserwacje te sugerują, że onkogenny efekt ekspozycji na IR u ludzi może w części wynikać z naprawy DSBs za pomocą wydajnego mechanizmu HR, który generuje translokacje, które poprzez swoją immanentną niestabilność promują zmiany genetyczne inicjujące tumorigenzę. Ponieważ promieniowanie jest często stosowane w leczeniu nowotworów, przegrupowania genomu wynikające z naprawy indukowanych promieniowaniem DSBs mogą przyczyniać się do powstawania nowotworów wtórnych, które często pojawiają się u pacjentów. Zatem model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu podstaw genetycznych i molekularnych istotnej odpowiedzi klinicznej na leczenie IR.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie treści źródłowej do przetłumaczenia. Czekam na tekst z JoVE, który mam przełożyć na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi.&quot;&gt;&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/3150/3150materialy.jpg&quot; alt=&quot;Materiały&quot;/&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

ilościowe oznaczenie i analiza powstawania translokacji chromosomowych indukowanych przez endonukleazę ho poprzez odżarzanie pojedynczych nici w saccharomyces cerevisiae

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Zmienność genetyczna jest często zapośredniczona przez reorganizacje genomowe, które powstają w wyniku interakcji między rozproszonymi elementami repetytywnymi obecnymi w każdym genomie eukariotycznym. Proces ten stanowi istotny mechanizm generowania różnorodności między organizmami oraz w ich obrębie1-3. Genom ludzki składa się w około 40% z sekwencji repetytywnych pochodzenia retrotranspozonowego, w tym z różnych LINE i SINE4. Zdarzenia wymiany między tymi elementami repetytywnymi mogą prowadzić do reorganizacji genomu, w tym do translokacji, które mogą zaburzać dawkę oraz ekspresję genów, co może skutkować chorobami autoimmunologicznymi i sercowo-naczyniowymi5, a także nowotworami u ludzi6-9.
Wymiana między elementami repetytywnymi zachodzi na różne sposoby. Wymiana między sekwencjami wykazującymi pełną (lub niemal pełną) homologię odbywa się w procesie zwanym rekombinacją homologiczną (HR). W przeciwieństwie do niej, niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) wykorzystuje niewielką lub żadną homologię sekwencji do przeprowadzenia wymiany10,11. Głównym celem HR w komórkach mitotycznych jest naprawa pęknięć dwuniciowych (DSB) powstających endogennie w wyniku błędnej replikacji DNA i uszkodzeń oksydacyjnych lub w wyniku ekspozycji na promieniowanie jonizujące (IR) oraz inne egzogenne czynniki uszkadzające DNA.
W opisanym tutaj teście pęknięcia dwuniciowe (DSBs) są jednocześnie tworzone na granicach substratów rekombinacyjnych w dwóch różnych loci chromosomalnych w komórkach diploidalnych za pomocą indukowanej galaktozą endonukleazy HO (Rysunek 1). Naprawa pękniętych chromosomów generuje translokacje chromosomalne poprzez mechanizm SSA (single strand annealing), w którym sekwencje homologiczne sąsiadujące z końcami chromosomów zostają kowalencyjnie połączone po procesie hybrydyzacji. Jeden z substratów, his3-Δ3', zawiera allel HIS3 z uciętym końcem 3' i znajduje się na jednej kopii chromosomu XV w natywnym locus HIS3. Drugi substrat, his3-Δ5', znajduje się w locus LEU2 na jednej kopii chromosomu III i zawiera allel HIS3 z uciętym końcem 5'. Oba substraty są flankowane przez miejsce rozpoznawania endonukleazy HO, które może być celem nacięcia przez endonukleazę HO. Miejsca rozpoznawania endonukleazy HO natywne dla locus MAT, na obu kopiach chromosomu III, zostały usunięte we wszystkich szczepach. Zapobiega to oddziaływaniu między substratami rekombinacyjnymi a innymi pękniętymi końcami chromosomów, co mogłoby zakłócić przebieg testu. Kaseta ekspresyjna endonukleazy HO indukowana galaktozą z markerem KAN-MX jest wstawiona w locus TRP1 na chromosomie IV. Substraty dzielą 311 bp lub 60 bp sekwencji kodującej HIS3, które mogą zostać wykorzystane przez aparat HR do naprawy drogą SSA. Komórki, które wykorzystują te substraty do naprawy pękniętych chromosomów poprzez HR, tworzą nienaruszony allel HIS3 oraz translokację chromosomalną tXV::III, którą można wyselekcjonować na podstawie zdolności do wzrostu na podłożu pozbawionym histydyny (Rysunek 2A). Częstotliwość translokacji przez HR oblicza się, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych względem histydyny, które pojawiają się na podłożu selekcyjnym, przez całkowitą liczbę żywych komórek uzyskanych po wysianiu odpowiednich rozcieńczeń na podłożu nieselekcyjnym (Rysunek 2B). W tym systemie wykorzystano różne mutanty naprawy DNA do badania genetycznej kontroli powstawania translokacji drogą SSA12-14.

Test translokacji stymulowanej przez HO monitoruje proces wyżarzania pojedynczej nici po powstaniu pęknięć obu nici DNA w wielu loci u diploidalnych Saccharomyces cerevisiae. Mechanizm ten może służyć jako model przemieszczeń genomowych w komórkach somatycznych wyższych eukariotów po ekspozycji na wysokie dawki promieniowania jonizującego.

Ilościowe oznaczenie i analiza powstawania translokacji chromosomowych indukowanych przez endonukleazę HO poprzez odżarzanie pojedynczych nici w Saccharomyces cerevisiae

Zmienność genetyczna jest często mediowana przez reorganizacje genomowe, które powstają w wyniku interakcji między rozproszonymi elementami powtarzalnymi obecnymi w każdym...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie kontroli genetycznej tworzenia translokacji poprzez kneeling jednoniciowy w diploidalnych komórkach drożdży pączkujących. Jest to realizowane poprzez wstępne zaszczepienie kultur pojedynczymi koloniami o konkretnym genotypie i ich nocną inkubację. Drugim krokiem procedury jest indukowanie jednoczesnego powstania pęknięć dwuniciowych przez endonukleazę ho na dwóch chromosomach poprzez dodanie galaktozy do kultur.Kolejne rozcieńczenia tych kultur wysiewa się na podłoża selektywne i nieselektywne. Ostatnim krokiem jest wyznaczenie częstości translokacji poprzez zliczenie kolonii powstałych na podłożach selektywnych i nieselektywnych. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące genetyczną kontrolę powstawania translokacji przez pojedynczą nić, poprzez analizę zmian w częstości stymulowanego powstawania translokacji w szczepach o różnych genotypach.Znaczenie tej techniki rozciąga się na konsekwencje terapejnego naświetlania pacjentów z nowotworami, ponieważ pęknięcia obu nici DNA oraz powstawanie translokacji są głównymi skutkami takiego leczenia. Aby rozpocząć procedurę wyznaczania częstotliwości translokacji indukowanych przez enzym ho, zaszczepić od 10 do 20 niezależnych kultur o objętości jeden mililitr w podłożu glicerolowo-mleczanowym Y peak pojedynczymi koloniami o pożądanym genotypie, a następnie inkubować kultury przez noc w temperaturze 30 °C na rotatorze. Gdy kultury osiągną pożądaną gęstość komórkową, dodać do nich 20% galaktozy do stężenia końcowego 2%. Galaktoza indukuje ekspresję endonukleazy ho, która spowoduje pęknięcia obu nici w allelu his3-Δ5' na chromosomie 3 oraz allelu his3-Δ3' na chromosomie 15. Inkubować przez cztery godziny w temperaturze 30 °C na rotatorze.Kolejny krok jest kluczowy dla powodzenia procedury. Niezbędne jest staranne rozcieńczenie i wysianie kultur. Aby uzyskać częstotliwości translokacji wystarczająco powtarzalne, by umożliwić statystycznie istotne porównania między szczepami o różnym genotypie, po czterech godzinach należy wysiać odpowiednie rozcieńczenia kultur na podłoże pozbawione histydyny oraz na podłoże YPD. W celu uzyskania około 100 do 200 kolonii na płytkę, inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni.Po pojawieniu się kolonii można określić częstotliwość translokacji. Efektywność wysiewu przed i po indukcji ekspresji endonukleazy ho wskaże, czy obecność lub brak któregokolwiek z chromosomów translokacyjnych wpływa na zdolność przeżycia po powstaniu DSB. Fragmentuje jedną kopię zarówno chromosomu trzy, jak i chromosomu 15, aby określić efektywność wysiewu przed indukcją.W pierwszej kolejności należy pobrać alikwot komórek z każdej kultury inkubowanej przez noc i określić liczbę komórek, wykonując odczyt za pomocą cytometru hematologicznego. Następnie, stosując odpowiednie rozcieńczenie, należy wysiać około 100 do 200 komórek na podłoże YPD i inkubować przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 °C aż do pojawienia się kolonii. Do pozostałych kultur należy dodać 20% galaktozy do stężenia końcowego 2% i inkubować w temperaturze 30 °C przez cztery godziny, aby określić wydajność wysiewu po indukcji.Po czterech godzinach indukcji pobierz alikwot komórek z każdej hodowli i określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Wysiej odpowiednie rozcieńczenie w celu przeliczenia około 100 do 200 komórek na podłoże YPD; inkubuj przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 °C aż do pojawienia się kolonii. Po wystąpieniu kolonii na płytkach można określić wydajność wysiewu. Domniemane klony z translokacją można przebadać metodą southern blot.W tej procedurze wykorzystuje się DNA genomiczne przygotowane z pojedynczej kolonii rekombinacyjnej HIS+ z każdej niezależnej próby. Każdą próbkę DNA o masie około 4 µg trawiono restryktazą BAM H I. Fragmenty po trawieniu BAM H I rozdzielano w żelu agarozowym 0,7%, a następnie przenoszono na dodatnio naładowaną membranę nylonową i hybrydyzowano z sondą znakowaną P 32, otrzymaną metodą random priming z wykorzystaniem klonu genomicznego BAM H I o wielkości 1,8 kb zawierającego gen HIS3. Fragmenty DNA wizualizowano za pomocą autoradiografii lub obrazowania fosforycznego. Inną metodą badania potencjalnych klonów z translokacją jest analiza wykresu chromosomowego.W pierwszej kolejności chromosomy preparuje się z wybranych rekombinantów hiss plus w próbkach typu plug aros; oddziela się chromosomy na żelu aros 1% w homogenicznym polu elektrycznym o zmiennej konfiguracji (CHEF) w temperaturze 14°C. Stosuje się następujące parametry: pierwszy blok 14°C, czas przełączania 72 s i 15 godzin przy 6 V/cm, drugi blok 14°C, czas przełączania 122 s i 11 godzin przy 6 V/cm. Po zakończeniu elektroforezy chromosomy wizualizuje się poprzez barwienie żelu bromkiem etydium przez 30 minut, a następnie naświetlanie promieniowaniem UV i odbarwianie w wodzie destylowanej; chromosomy przenosi się na membranę naładowaną dodatnio metodą kapilarną.W warunkach denaturujących przeprowadza się hybrydyzację z sondą znakowaną P 32, uzyskaną metodą random priming z 1,8 kilobazy klonu genomicznego Bam H I Bam H I zawierającego gen HIS3. Chromosomy wizualizuje się za pomocą autoradiografii lub obrazowania fosforowego. Częstość translokacji chromosomalnych można obliczyć, dzieląc liczbę kolonii histydynowo-troficznych przez całkowitą liczbę żywych komórek, określoną poprzez wysiew na podłoże YPD.W tym przykładzie obliczona częstość rekombinacji wynosi około 3%. Analizę częstości translokacji stymulowanych przez ho można przeprowadzić z użyciem szczepów o różnych genotypach, aby porównać różnice w zdolności do naprawy pęknięć dwuniciowych poprzez odbliznowienie, jak pokazano na tym reprezentatywnym wykresie. Częstości translokacji uzyskane zarówno selektywnie, jak i nieselektywnie u homozygoty RAD 51 delta null były statystycznie różne od tych uzyskanych w odpowiadających warunkach u szczepu typu dzikiego, zarówno przed, jak i po wysiewie indukcyjnym.Wydajność określa się poprzez podzielenie całkowitej liczby żywotnych komórek tworzących kolonie przez całkowitą liczbę ciał komórkowych w hodowli, wyznaczoną za pomocą licznika komórek (hemocytometru), jak pokazano w tej tabeli przed i po wysiewaniu indukowanym. Wydajność nie różniła się znacząco w przypadku komórek typu dzikiego, co sugeruje, że obecność lub brak dowolnego chromosomu z translokacją nie wpływa na zdolność do przeżycia po powstaniu DSB.Domniemane klony niosące translokację można zbadać za pomocą genomowej analizy Southern blot. Przedstawiono tutaj graficzną reprezentację odpowiednich chromosomów przed i po powstaniu translokacji. Wielkości fragmentów restrykcyjnych zawierających odpowiednie sekwencje, wygenerowanych przez trawienie BamH1 DNA genomowego szczepów rodzicielskich i rekombinantów i ujawnionych na blotach poprzez hybrydyzację z 1,8 kb sondą BamH1.Trzy klony genomowe genu HIS3 zostały przedstawione w parach kilobaz dla analizy Southern blot. Genomowe DNA trawione jest endonukleazą BMH1 i hybrydyzowane z probem HIS3 o długości 1,8 kilobazy, znakowanym P 32, w celu wizualizacji tych fragmentów diagnostycznych.Fragmenty 0.8 kilobazy HIS3 Δ20, 1.7 kilobazy HIS3 Δ3', 4 kilobazy T315, 5 kilobazy T153 oraz 8 kilobazy HIS3 Δ5'. Ścieżka A to diploid rodzicielski. Ścieżka B to rekombinant z nie wzajemną translokacją his+, a ścieżka C to wzajemna translokacja his+.Analiza rekombinowanego BLO chromosomowego może być również wykorzystana do badania klonów z translokacjami. Nieuszkodzone chromosomy przygotowane w próbkach typu aros są rozdzielane za pomocą elektroforezy chef, a żel barwiony bromkiem irydu i wizualizowany w świetle UV. Rozdzielone chromosomy są następnie przenoszone na membranę nylonową i hybrydyzowane z sondą o długości 1,8 kilobazy znakowaną P 32.Trzy sondy do wizualizacji nienaruszonego chromosomu 1.1 megabase, chromosomu z translokacją T 15 three o wielkości 15.8 megabase, chromosomu z translokacją T three 15 o wielkości 0.6 megabase oraz nienaruszonego chromosomu three o wielkości 0.3 megabase. Ścieżka A to szczep rodzicielski. Ścieżka B to rekombinant z nie-wzajemną translokacją his+, a ścieżka C to rekombinant z wzajemną translokacją his+.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, w jaki sposób określić częstotliwość powstawania translokacji po wielokrotnych pęknięciach dwuniciowych indukowanych przez HO.

quantitation-analysis-formation-ho-endonuclease-stimulated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilość i analiza formowania się translokacji chromosomowych stymulowanych endonuklearazą HO poprzez scalanie pojedynczych nici w Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Opisujemy dwa uzupełniające się protokoły do dokładnego określenia czasu trwania fazy S u S. cerevisiae za pomocą EdU, analogu tymidyny, który jest wprowadzany in vivo i wykrywany za pomocą chemii Click za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Pozwala to na łatwą charakterystykę czasu trwania replikacji DNA i przeoczonych defektów replikacji u mutantów.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Ten protokół przedstawia metodę izolacji chromatyny specyficzną dla locus, opartą na rekombinacji specyficznej dla miejsca, w celu oczyszczenia interesującego miejsca pojedynczej kopii genu w jego natywnym kontekście chromatyny z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae.

Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje test pozachromosomalnego łączenia niehomologicznych końców (NHEJ) i test rekombinacji homologicznej (HR) w celu ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR w komórkach HEK-293T.

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Poznaj metodę wyżarzania jednoniciowego do analizy translokacji chromosomowych wywołanych endonukleazą HO u Saccharomyces cerevisiae. Technika ta pozwala badać kontrolę genetyczną rearanżacji genomu i stabilność DNA po napromieniowaniu.

Kwantyfikacja i analiza powstawania translokacji chromosomowych stymulowanych przez endonukleazę HO przez wyżarzanie jednoniciowe u Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowe oznaczenie i analiza powstawania translokacji chromosomowych indukowanych przez endonukleazę HO poprzez odżarzanie pojedynczych nici w Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów