Kwantyfikacja i analiza powstawania translokacji chromosomowych stymulowanych przez endonukleazę HO przez wyżarzanie jednoniciowe u Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem tej procedury jest określenie genetycznej kontroli tworzenia translokacji przez klęczenie jednoniciowe w diploidalnych pączkujących komórkach drożdży. Osiąga się to poprzez pierwsze zaszczepienie kultur pojedynczymi koloniami o określonym genotypie i wyhodowanie ich przez noc. Drugim etapem procedury jest wywołanie jednoczesnego tworzenia podwójnego pęknięcia nici przez endonukleazę ho na dwóch chromosomach poprzez dodanie galaktozy do kultur.

Następnie rozcieńczenia tych kultur posiewa się na pożywkach selektywnych i nieselektywnych. Ostatnim krokiem jest określenie częstotliwości translokacji poprzez zliczanie kolonii powstających na pożywkach selektywnych i nieselektywnych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na genetyczną kontrolę tworzenia translokacji przez pojedynczą nić, klęczenie przez zmiany częstotliwości powstawania translokacji stymulowanej ho w szczepach o różnych genotypach.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku konsekwencji ekspozycji na promieniowanie terapeutyczne u pacjentów z rakiem, ponieważ pęknięcia podwójnej nici DNA i tworzenie translokacji są głównymi konsekwencjami tego leczenia. Aby rozpocząć procedurę określania ho stymulowanych częstotliwości translokacji, należy zaszczepić od 10 do 20 niezależnych jednomililitrowych kultur pożywki mleczanu glicerolu o piku Y pojedynczymi koloniami pożądanego genotypu, inkubować kultury przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza na rotatorze. Gdy hodowle osiągną pożądaną gęstość komórek, dodaj 20% galaktozy do kultur do końcowego stężenia 2% Galaktoza wywoła ekspresję endonukleazy ho, która skieruje pęknięcia podwójnej nici w historii allelu pierwotnego delta pięć na chromosomie trzecim i ma trzy allele pierwotne delta trzy na chromosomie 15 inkubować przez cztery godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza na rotatorze.

Następny krok ma kluczowe znaczenie dla powodzenia zabiegu. Konieczne jest staranne rozcieńczenie i posiew kultur. Jeśli miałbyś uzyskać częstotliwości translokacji, które są wystarczająco powtarzalne, aby umożliwić statystycznie istotne porównania między szczepami o różnym genotypie: Po czterech godzinach odpowiednie rozcieńczenie kultur na pożywce pozbawionej histydyny, a także na YPD td, około 100 do 200 kolonii na płytkę, inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.

Kiedy powstają kolonie, można określić częstotliwość translokacji. Wydajność posiewu przed i po indukcji ekspresji endonukleazy ho wskaże, czy obecność lub brak któregokolwiek chromosomu translokacyjnego wpływa na zdolność do przetrwania tworzenia DSB. To fragmentuje jedną kopię zarówno chromosomu trzeciego, jak i chromosomu 15 w celu określenia wydajności posiewu przed indukcją.

Najpierw usuń podwielokrotność komórek z każdej nocnej hodowli i określ liczbę komórek, licząc za pomocą hemocytometru. Następnie użyj odpowiedniego rozcieńczenia, aby umieścić około 100 do 200 komórek na inkubacji YPD przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż pojawią się kolonie. Dodaj 20% galaktozy do pozostałych kultur do końcowego stężenia 2% i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery godziny, aby określić wydajność powlekania po indukcji.

Usunąć podwielokrotność komórek z każdej kultury po czterech godzinach indukcji i oznaczyć liczbę komórek za pomocą cytometru hemologicznego Policzyć około 100 do 200 komórek, stosując odpowiednie rozcieńczenie na inkubacji YPD, przez dwa do trzech dni w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż do powstania kolonii. Gdy na płytkach pojawią się kolonie, można określić skuteczność posiewu. Przypuszczalne klony przenoszące translokację można badać za pomocą southern blot.

W tej procedurze wykorzystuje się genomowe DNA przygotowane z pojedynczego syku i rekombinowanej kolonii z każdej niezależnej próby, trawi około czterech mikrogramów każdej próbki DNA z BAM H, jedną endonukleazą restrykcyjną, oddziela BAM H jeden strawione fragmenty na 0,7% aros, a następnie przenosi się do dodatnio naładowanej membrany nylonowej zhybrydyzowanej z sondą znakowaną P 32, uzyskaną przez losowe zalewanie 1,8 KILOBASE BMH, jeden BMH, jeden klon genomowy zawierający HIS trzy geny. Wizualizacja fragmentów DNA za pomocą automatycznej radiografii lub obrazowania fosfologicznego. Innym sposobem badania przypuszczalnych klonów zawierających translokację jest analiza wykresu chromosomowego.

Chromosomy są najpierw przygotowywane z wyselekcjonowanego syku plus rekombinantów w aros czopach oddzielnych chromosomów na 1%aros żelu w konturze zaciśniętym jednorodnym polu elektrycznym lub chef w temperaturze 14 stopni Celsjusza. Następujące parametry są używane pierwszy blok 14 stopni Celsjusza, 72. czas przełączania i 15 godzin przy sześciu woltach centymetra, drugi blok, 14 stopni Celsjusza, 122. czas przełączania i 11 godzin przy sześciu woltach na centymetr. Po zakończeniu elektroforezy uwidocznij chromosomy, barwiąc żel bromkiem AUM przez 30 minut, a następnie naświetlając promieniowaniem UV i zatrzymując i destylując chromosomy przenoszące wodę do dodatnio naładowanej błony przez działanie kapilarne.

Warunki denaturacji hybrydyzują z sondą znakowaną P 32 uzyskaną przez losowe torowanie z 1,8 kilobase bam H jeden bam H jeden klon genomowy zawierający syk. Trzy geny wizualizują chromosomy za pomocą automatycznej radiografii lub obrazowania fosfologicznego. Częstość translokacji chromosomowych można obliczyć, dzieląc liczbę fototroficznych kolonii histaminy przez całkowitą liczbę żywotnych komórek określoną przez posiew na YPD.

W tym przykładzie obliczona częstość rekombinacji wynosi około 3%Test częstotliwości translokacji stymulowanej ho można przeprowadzić przy użyciu szczepów o różnych genotypach w celu porównania różnic w zdolności do naprawy pęknięć podwójnej nici przez pojedynczą nić. Klęczenie, jak pokazano na tym reprezentatywnym wykresie. Częstości translokacji uzyskane zarówno selektywnie, jak i nieselektywnie z homozygotą zerową delta RAD 51 różniły się statystycznie od tych uzyskanych przy użyciu odpowiednich warunków ze szczepem typu dzikiego, zarówno przed, jak i po posiewie indukcyjnym.

Wydajność określa się, dzieląc całkowitą liczbę żywotnych komórek tworzących kolonie przez całkowitą liczbę ciał komórkowych w hodowli, określoną za pomocą liczby cytometrów hemologicznych, jak pokazano w tej tabeli przed i po posiewie indukcyjnym. Wydajność nie różniła się znacząco dla komórek typu dzikiego, co sugeruje, że obecność lub brak któregokolwiek z chromosomów translokacyjnych nie wpływa na zdolność do przeżycia. Formacja DSB.

Przypuszczalne klony przenoszące translokację można zbadać za pomocą genomowej analizy southern blot. Przedstawiono tutaj graficzną reprezentację odpowiednich chromosomów przed i po utworzeniu translokacji. Rozmiary fragmentów restrykcyjnych zawierających odpowiednie sekwencje generowane przez BAM H pierwsze trawienie genomowego DNA ze szczepów rodzicielskich i rekombinowanych i ujawniane na blotach przez hybrydyzację z 1,8 kilozasadowym BAM H.

Jego trzy genomowe klony są wymienione w parach kilozasad do analizy southern blot. Genomowe DNA jest trawione przez endonukleazę BMH i hybrydyzowane do P 32 znakowanej 1,8 kilozasady. Trzy sondy HIS do wizualizacji tych fragmentów diagnostycznych.

0,8 kilobazy HIS trzy delta 201,7 kilobaza syk trzy delta trzy prime cztery kilozasady T 3 15 5 kilobase T 15 trzy i osiem kilobase syk trzy delta pięć fragmentów pierwszych. Pas A jest diploidem macierzystym. Tor B to translokacja sycząca plus translokacja nieodwrotna, a pas C to jego plus translokacja odwrotna.

Rekombinowana analiza chromosomalna BLO może być również stosowana do badania klonów zawierających translokację. Nienaruszone chromosomy przygotowane w czopach aros są oddzielane za pomocą elektroforezy szefa kuchni, a żel barwi bromkiem irydu i wizualizuje w świetle UV. Oddzielone chromosomy są następnie osuszane do nylonu i hybrydyzowane z P 32 znakowanym 1,8 kilozasadą.

Jego trzy sondy do wizualizacji 1,1 megabazy nienaruszonej chromosomu, 15,8 megabazy T 15, trzech chromosomów translokacyjnych 0,6 megabazy T, trzech chromosomów translokacyjnych 15 i 0,3 megabazy nienaruszonego chromosomu trzeciego. Pas A jest wdrożonym elementem nadrzędnym. Tor B to A jego plus translokacja nieodwrotna rekombinowana, a pas C to jego plus translokacja wzajemna rekombinowana.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić częstotliwość powstawania translokacji po wielu stymulowanych przerwaniach podwójnej nici.