Osadzenie mózgu Drosophila w matrycy w celu obrazowania poklatkowego neuronów zegara okołodobowego

Zacznij od pokrywki szalki Petriego zawierającej mózg larwy Drosophila, wstępnie wystawionej na cykl światła/ciemności. Wycinek zawiera fluorescencyjne neurony zegarowe wykazujące ekspresję białka.

Dodaj bogatą w składniki odżywcze pożywkę z antybiotykami wspomagającymi przeżycie neuronów i ciepły roztwór fibrynogenu.

Delikatnie wymieszaj roztwór, aby równomiernie rozprowadzić fibrynogen

.

Umieść niewielką ilość tej mieszaniny na szkiełku nakrywkowym naczynia ze szklanym dnem.

Dodaj trombinę, aby zareagowała z fibrynogenem, aby wywołać tworzenie trójwymiarowej matrycy fibryny.

Przenieś mózg na tę matrycę, ustawiając go przodem do dołu, aby wyrównać neurony zegara do obrazowania.

Złóż macierz na mózgu, aby ją zakotwiczyć i zapobiec ruchowi

.

Dodaj pożywkę bogatą w składniki odżywcze, aby dezaktywować aktywność trombiny.

Uszczelnij naczynie membraną przepuszczającą gazy, aby utrzymać nawodnienie i żywotność neuronów.

Wykonuj poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne w określonych odstępach czasu.

Zmiany fluorescencji w neuronach zegarowych ujawniają ich rytmiczną aktywację i hamowanie, zsynchronizowane z cyklem światła / ciemności, odzwierciedlając rytmy okołodobowe, dzienny cykl aktywnośc