Osadzenie mózgu Drosophila w matrycy w celu obrazowania poklatkowego neuronów zegara okołodobowego

Zacznij od pokrywki szalki Petriego zawierającej mózg larwy Drosophila, wstępnie wystawionej na cykl światła/ciemności. Wycinek zawiera fluorescencyjne neurony zegarowe wykazujące ekspresję białka.

Dodaj bogatą w składniki odżywcze pożywkę z antybiotykami wspomagającymi przeżycie neuronów i ciepły roztwór fibrynogenu.

Delikatnie wymieszaj roztwór, aby równomiernie rozprowadzić fibrynogen

Umieść niewielką ilość tej mieszaniny na szkiełku nakrywkowym naczynia ze szklanym dnem.

Dodaj trombinę, aby zareagowała z fibrynogenem, aby wywołać tworzenie trójwymiarowej matrycy fibryny.

Przenieś mózg na tę matrycę, ustawiając go przodem do dołu, aby wyrównać neurony zegara do obrazowania.

Złóż macierz na mózgu, aby ją zakotwiczyć i zapobiec ruchowi

Dodaj pożywkę bogatą w składniki odżywcze, aby dezaktywować aktywność trombiny.

Uszczelnij naczynie membraną przepuszczającą gazy, aby utrzymać nawodnienie i żywotność neuronów.

Wykonuj poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne w określonych odstępach czasu.

Zmiany fluorescencji w neuronach zegarowych ujawniają ich rytmiczną aktywację i hamowanie, zsynchronizowane z cyklem światła / ciemności, odzwierciedlając rytmy okołodobowe, dzienny cykl aktywności.

Po przeniesieniu mózgu do roztworu roboczego, dozuj mózg i pożywkę na pokrywkę sterylnej szalki Petriego. Następnie dodaj kolejne 3,5 mikrolitra SAM z antybiotykami i dodaj 3,5 mikrolitra ciepłego SAM z fibrynogenem.

Ważne jest, aby przez cały czas trwania tej procedury utrzymywać pożywkę SAM z fibrynogenem w temperaturze 37 stopni.

Następnie wymieszaj roztwór wokół mózgu, delikatnie pipetując tą samą końcówką pipety i odessaj 2 mikrolitry roztworu, aby umieścić go na szkiełku nakrywkowym do naczynia ze szklanym dnem. Następnie dodaj 0,8 mikrolitra trombiny do kropli i bardzo szybko wymieszaj, aby zainicjować polimeryzację, która będzie wyglądać na białą. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie wybierz mózg i umieść go na polimeryzującej matrycy fibryny.

Dodanie trombiny po przeniesieniu mózgu do kropelki. Nie jest to zalecane, ponieważ bardzo komplikuje procedurę.

Zorientuj mózg w razie potrzeby i bardzo delikatnie popchnij mózg jak najbliżej szkiełka nakrywkowego. Następnie wybierz warstwę spolimeryzowanej fibryny i złóż ją na wierzchu mózgu, wykonując małe i delikatne ruchy, które nie odrywają matrycy. Kontynuuj składanie warstw spolimeryzowanej fibryny nad mózgiem z różnych części skrzepu, aby ustabilizować mózg. Następnie umieść 20 mikrolitrów SAM z antybiotykami na osadzonym mózgu, aby zatrzymać aktywność trombiny. Następnie połóż kawałek membrany PTFE na podłożu i przyklej krawędzie membrany do natłuszczonych części naczynia.