Wykorzystanie reflektometrii spektralnej do określenia zmielinizowanych średnic aksonów w nieruchomym wycinku mózgu myszy

Weźmy hiperspektralny mikroskop konfokalny ze stabilizowanym źródłem laserowym skonfigurowanym dla szerokiego zakresu spektralnego, aby odkodować nanostrukturę osłonki mielinowej tkanki mózgowej.

Użyj lustra referencyjnego, aby uchwycić podstawowe widmo odbicia. Usuń lustro i uzyskaj ciemne widmo przesunięcia w celu korekcji szumów detektora.

Przenieś komorę z ustalonym wycinkiem tkanki mózgowej na scenę mikroskopu.

Dopasuj płaszczyznę ogniskową do obszaru tkanki będącego przedmiotem zainteresowania, zapewniając wystarczającą głębokość, aby zminimalizować zakłócenia z interfejsu szkło-tkanka.

Światło lasera jest kierowane na wielowarstwową osłonkę mielinową aksonów.

Gdy światło oddziałuje z mieliną, na stykach warstw pojawiają się częściowe odbicia, powodując wzory interferencyjne spowodowane różnymi grubościami warstw i współczynnikami załamania światła.

Uzyskaj obrazy spektralne tych wzorców interferencyjnych.

Po korekcie linii podstawowej i analizie sygnału, widmo odbicia ujawnia okresowość liczby falowej, co pozwala na określenie średnic mielinizowanych aksonów.

Zamontuj lustro referencyjne na stoliku mikroskopu, powierzchnią skierowaną w stronę soczewki obiektywu. Jeśli nie jest łatwo umieścić lustro na stoliku mikroskopu, przyklej lustro do płaskiej płytki. Dostosuj stolik mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej z powierzchnią lustra. Następnie dostosuj wzmocnienie PMT i moc lasera, biorąc pod uwagę zakres dynamiczny detektora.

Pod pseudokolorem sprawdź, czy nie ma nasycenia w całym zakresie długości fali. Jeśli zaobserwuje się nasycenie, zmniejsz moc lasera. Następnie uruchom akwizycję skanowania lambda. Zdejmij lustro ze stolika i powtórz tę samą akwizycję bez próbki, aby uzyskać ciemne odniesienie. Następnie zapisz dane w wielostosowym formacie TIFF.

Aby przeprowadzić akwizycję obrazu SpeRe, umieść zamontowaną tkankę na stoliku mikroskopu. Aby z grubsza wyrównać tkankę z płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu, za pomocą okularu użyj trybu fluorescencji szerokokątnej. Przy włączonym skanowaniu na żywo steruj stolikiem mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej do obszaru zainteresowania w tkance. Aby uniknąć szumów tła z szkiełka nakrywkowego, wybierz obszar docelowy o głębokości co najmniej 15 mikrometrów z powierzchni styku tkanki szklanej.

Uzyskaj stos obrazów spektralnych dla obszaru docelowego, korzystając z tej samej procedury, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Następnie zapisz dane dla tkanki i ciemnego offsetu w formacie TIFF z wieloma stosami. Aby przetworzyć obrazy w ImageJ, otwórz dane spektralne dla lustra referencyjnego i tkanki mózgowej.

Wybierz ROI dla otwartych stosów obrazów, środkowy obszar dla lustra referencyjnego i segment włókna aksonowego dla tkanki mózgowej. Następnie uruchom obraz, układaj w stosy, kreśl profil osi z, aby uzyskać surowe widma dla wybranych ROI.

Włókna aksonów mogą być strukturalnie niejednorodne na całej swojej długości, dlatego zaleca się wybór ROI na małym segmencie aksonu, zwykle mniejszym niż 5 mikrometrów, w celu zminimalizowania artefaktów częściowej objętości.

Otwórz dane z ciemnego przesunięcia, jeden wykonany dla lustra referencyjnego, a drugi dla tkanki mózgowej, i wykreśl profil osi z, jak pokazano poniżej. Następnie użyj opcji kopiowania i wklejania, aby zapisać wszystkie uzyskane opcje.