Name: Kriokonserwacja zarodków myszy za pomocą witryfikacji na bazie glikolu etylenowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj metodę witryfikacji zarodków myszy z użyciem glikolu etylenowego, która zapewnia przeżywalność powyżej 90% i wysokie wskaźniki urodzeń. Protokół ten jest mniej toksyczny niż konwencjonalne metody kriokonserwacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to zostało przeprowadzone we współpracy z National BioResource Project oraz Ministerstwem Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii.

Ogólny schemat eksperymentu przedstawiono na Rys. 1.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
 <li>Przygotuj pożywkę podstawową (zwaną tutaj PB1) w szklanej butelce o pojemności 10 ml zgodnie z poniższą tabelą:
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
<td> </td>
 <td>massa molowa</td>
 <td>mM</td>
 <td>mg/100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>58.4</td>
 <td>136.98</td>
 <td>800.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>74.6</td>
 <td>2.68</td>
 <td>20.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>136.1</td>
 <td>1.47</td>
 <td>20.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2HPO (hematoksylina i eozyna)4.12H2O</td>
 <td>358.14</td>
 <td>8.04</td>
 <td>288.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl₂2,6H2O</td>
 <td>203.3</td>
 <td>0.49</td>
 <td>10.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glukoza</td>
 <td>180.2</td>
 <td>5.56</td>
 <td>100.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pirowinian</td>
 <td>110</td>
 <td>0.33</td>
 <td>3.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl22,2H2O</td>
 <td>147</td>
 <td>0.9</td>
 <td>13.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicylina G</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>6,0 (w przybliżeniu)</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Przygotowanie roztworu Ficoll-sucroza (FS):
 <ol>
 <li>Do 14 ml roztworu PB1 w probówce o pojemności 50 ml dodać następujące odczynniki chemiczne.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Ficoll 70</td>
 <td>6,0 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sacharoza</td>
 <td>3,424 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>42,0 mg</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Wymieszać Ficoll 70 i sacharozę w roztworze PB1, a następnie dokładnie wstrząsnąć do całkowitego rozpuszczenia.</li>
 <li>Po upewnieniu się, że powyżej nastąpiło całkowite rozpuszczenie, należy dodać BSA na powierzchnię roztworu i przechowywać go w temperaturze 4°C aż do całkowitego rozpuszczenia BSA (&gt; 4 godziny lub przez noc).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotować roztwór równoważący (EFS20) oraz roztwór witryfikacyjny (EFS40) w probówce o pojemności 50 ml:
 <ul>
 <li>EFS20: 20%(v/v) glikolu etylenowego, 24% (w/v) Ficollu i 0,4 mol/L sacharozy w PB1 z BSA</li>
 <li>EFS40: 40% (v/v) glikolu etylenowego, 18% (w/v) Ficollu oraz 0,3 mol/L* sukroza w PB1 z BSA 
 *W przypadku zarodków z linii BALB/c lub ICR należy zwiększyć stężenie sacharozy do 0,9 mol/l, ponieważ są one bardziej podatne na uszkodzenia kriogeniczne.6.</li>
 </ul>
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
<td> </td> 
<td>roztwór EFS20</td>
 <td>roztwór EFS40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glikol etylenowy</td>
 <td>1 ml</td>
 <td>2 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>roztwór FS</td>
 <td>4 ml</td>
 <td>3 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Sterylizować roztwór poprzez filtrację, używając 0.45 μm przefiltrować. Przygotować alikwoty w polistyrenowych probówkach o pojemności 5 ml i przechowywać w 4°CMożna ich używać przez około 6 miesięcy.</li>
 <li>Przygotowanie roztworu do rozmrażania zarodków zawierającego 0,75 M sacharozy (TS1)
 <ol>
 <li>Rozpuścić 7,7 g sacharozy w PB1 (przygotowanym w kroku 1.1) i doprowadzić objętość całkowitą do 30 ml. Mieszać przez delikatne potrząsanie do całkowitego rozpuszczenia sacharozy.</li>
 <li>Nanieść 90 mg BSA na powierzchnię roztworu i pozostawić do całkowitego rozpuszczenia.</li>
 <li>Sterylizować roztwór poprzez filtrację.</li>
 <li>Podzielić na alykwoaty i przechowywać w temperaturze 4°CMożna ich używać przez około 1 miesiąc.</li>
 </ol>
 
 Uwaga: TS1 można również przygotować z dostępnego komercyjnie M2. 
 <ol start="6">
 <li>Rozpuścić 7,7 g sacharozy w M2 i doprowadzić całkowitą objętość do 30 ml.</li>
 <li>Mieszać, delikatnie wstrząsając, aż sacharoza całkowicie się rozpuści.</li>
 <li>Sterylizować roztwór poprzez filtrację.</li>
 <li>Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze 4°C. Można ich używać przez około 1 miesiąc.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>TS2 (roztwór do rozmrażania zawierający 0,25 M sacharozy):
 <ol>
 <li>Rozcieńczyć 10 ml TS1 w 20 ml PB1 lub M2, w zależności od potrzeb.</li>
 <li>Podzielić na alykwoaty i przechowywać w temperaturze 4°CMożna ich używać przez około 1 miesiąc.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Witryfikacja zarodków myszy w stadium 2 komórek
<ol>
 <li>Przygotować zarodki myszy w stadium 2 komórek poprzez kojenie naturalne lub konwencjonalne techniki zapłodnienia in vitro.</li>
 <li>Odmierzyć 50 μl EFS40 do probówki kriogenicznej. Dalsze etapy procedury witryfikacji należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Nanieść 50 μl EFS20 na dno plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm lub 60 mm.</li>
 <li>Przenieść do 30 zarodków do EFS20 za pomocą szklanej kapilary, używając minimalnej ilości medium hodowlanego. Włączyć stoper na 2 min. 
 Uwaga: Zarodki należy umieścić na dnie kropli, co zapewni ich efektywne odwodnienie. Sprawdzić morfologię zarodków pod stereomikroskopem. Odwodnione zarodki wykazują obkurczoną morfologię, jak pokazano na Rys. 2A. Jeśli nie są one wystarczająco odwodnione, odczekać dodatkowe 1 lub 2 min.</li>
 <li>W około 1,5 min pobrać zarodki z kropli EFS20, używając minimalnej ilości roztworu. Przenieść je do EFS40 w probówce kriogenicznej przygotowanej w kroku 2.1. Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy dostosować czas pobierania zarodków tak, aby wszystkie zarodki zostały przeniesione do EFS40 w okolicach 2 min.</li>
 <li>Odczekać 1 min.</li>
 <li>Włożyć probówkę kriogeniczną bezpośrednio do ciekłego azotu (LN2).</li>
</ol>
3. Rozmrażanie witryfikowanych zarodków myszy w stadium 2 komórek
<ol>
 <li>Przed rozmrażaniem przygotuj płytkę z kroplami po 10 μl pożywki do hodowli zarodków dla odzyskiwanych zarodków (patrz krok 3.13). Przykryj płytkę olejem i umieść w inkubatorze CO2 do czasu użycia. Uwaga: Choć w tym eksperymencie można stosować dowolne pożywki do rutynowej hodowli zarodków, zalecamy pożywki o wyższej osmolarności, takie jak pożywka M16.</li>
 <li>Podgrzej TS1 do 37°C.</li>
 <li>Załóż maskę ochronną i rękawice kriogeniczne. Otwórz zbiornik LN2 i wyjmij krioprobówkę zawierającą zarodki.</li>
 <li>Szybko otwórz górną część probówki i wylej LN2. Odczekaj 30 s, aby zapobiec zamarznięciu TS1 w następnym kroku.</li>
 <li>Za pomocą pipety 100ul dodaj do probówki 850 μl TS1 (37°C) i wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując (około dziesięciu razy w ciągu 25 sekund), aż roztwór zostanie równomiernie rozpuszczony.</li>
 <li>Przenieś całą objętość z probówki na plastikową płytkę Petriego o średnicy 60 mm (lub szkiełko zegarkowe) (Rys. 3A). Uwaga: Zarodkami należy operować w temperaturze pokojowej (2-25°C) aż do momentu umieszczenia ich w inkubatorze CO2 w kroku 3.14.</li>
 <li>Uruchom czasomierz na 3 min.</li>
 <li>Po około 2 min w TS1 delikatnie potrząśnij płytką, aż pożywka zawierająca zarodki rozprzestrzeni się po powierzchni płytki (Rys. 3B). Uwaga: Pomoże to zarodkom opaść na dno, ponieważ po przeniesieniu do TS1 unoszą się one w pobliżu powierzchni.</li>
 <li>Nanieś na płytkę trzy krople TS2 po 50 μl (Rys. 3C).</li>
 <li>Po 3 min w TS1 sprawdź morfologię zarodków za pomocą stereomikroskopu; powinny być lekko obkurczone. Zobacz morfologię zarodków na wcześniejszym etapie (Rys. 2B) i późniejszym etapie (Rys. 2C) w TS1. Uwaga: Jeśli zarodki są nadal obrzęknięte, pozostaw je w TS1 na kolejne 1 do 3 min.</li>
 <li>Pobierz zarodki i przenieś je do pierwszej kropli TS2 (Rys. 3D). Uruchom czasomierz na 3 min.</li>
 <li>Po 3 min przenieś zarodki do drugiej, a następnie do trzeciej kropli (Rys. 3E).</li>
 <li>Przenieś zarodki do pożywki hodowlanej przygotowanej w kroku 3.1. Zarodki mają kształt przedstawiony na Rys. 2D.</li>
 <li>Umieść płytkę w inkubatorze CO2. Około 10 min później przenieś zarodki do kolejnej kropli pożywki hodowlanej, aby wypłukać sacharozę przeniesioną z TS2.</li>
 <li>Kontynuuj hodowlę w inkubatorze CO2 do czasu transferu zarodków. 
 Uwaga: Przenieś zarodki do jajowodów samic biorczyń w dniu rozmrażania. Długa hodowla in vitro może zmniejszyć żywotność zarodków u niektórych szczepów myszy.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
In vitro oraz in vivo-rozwój zarodków po rozmrożeniu przedstawiono w tabelach 1 i 2. Zaletami niniejszego protokołu są wysoka przeżywalność zarodków po rozmrożeniu oraz jego szeroka stosowalność w odniesieniu do różnych szczepów myszy.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Szczep</td>
 <td>Całkowita liczba probówek</td>
 <td>Liczba witryfikowanych zarodków</td>
<td>Odzyskane (Liczba (%))</td>
<td>Morfologicznie prawidłowe (Liczba (%))</td>
<td>Rozwój do blastocyst (liczba (%))</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6J</td>
 <td>20</td>
 <td>400</td>
 <td>397 (99)</td>
 <td>394 (99)</td>
 <td>342 (87)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BALB/cA</td>
 <td>15</td>
 <td>300</td>
 <td>296 (99)</td>
 <td>282 (95)</td>
 <td>238 (84)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ICR</td>
 <td>24</td>
 <td>480</td>
 <td>474 (99)</td>
 <td>443 (93)</td>
 <td>398 (90)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Rozwój in vitro embrionów rozmrożonych po witryfikacji u powszechnie stosowanych szczepów myszy
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Stan zarodków</td>
 <td>Liczba samic biorców</td>
 <td>Liczba transferowanych embrionów</td>
 <td>Miejsca implantacji (liczba (%))</td>
 <td>Żywe potomstwo (liczba (%))</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Świeże</td>
 <td>12</td>
 <td>180</td>
 <td>141 (78.3)</td>
 <td>110 (61.1)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Szkłowaty</td>
 <td>16</td>
 <td>242</td>
 <td>202 (83.5)</td>
 <td>125 (51.7)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Rozwój in vivo witryfikowanych i rozmrożonych zarodków u myszy C57BL/6J.
<img alt="Schemat procesu kriokonserwacji: witryfikacja zarodków, przechowywanie w LN₂, etapy odmrażania i rekonwalescencji." src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogólny schemat eksperymentu, obejmujący równoważenie, witryfikację i rozmrażanie zarodków.
<img alt="Schemat procesu rozmrażania zarodka w stadium dwóch komórek, witryfikacja do medium M16, roztwór sacharozy TS1." src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Morfologia embrionów na każdym etapie rozmrażania.
<img alt="Schemat równowagi statycznej z cz petriami przedstawiający proces przenoszenia cieczy i sekwencję reakcji." src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Procedura rozmrażania zarodków. Wszystkie procedury są wykonywane w temperaturze pokojowej. (A), Dodać 850 μl TS1 (37°C) do probówki kriogenicznej, a następnie całą objętość roztworu z probówki przenieść na plastikową płytkę. Na tym etapie embriony wyglądają na obrzękłe, co przedstawiono w Ryc. 2B(B) Rozprowadzić roztwór po powierzchni płytki poprzez delikatne potrząsanie. (C) Umieścić trzy 50 μl krople medium TS2 na plastikową szalkę. (D) Przenieść zarodki do pierwszej kropli TS2. Po 3 minutach zarodki wyglądają na skurczone, co pokazano na Ryc. 2C(E), Przenosić je szeregowo do pozostałych kropli TS2, a następnie do pożywki hodowlanej.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
<li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li>
<li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li>
<li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li>
<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Od czasu pierwszej doniesienia o witryfikacji zarodków myszy opublikowanej przez Ralla i Fahy'ego w 1985 roku2, wprowadzono szereg ulepszeń technicznych w celu zwiększenia przeżywalności zarodków po rozmrażaniu. Jedną z najskuteczniejszych modyfikacji było zastosowanie glikolu etylenowego jako krioprotektanta ze względu na jego niską toksyczność i wysoką przenikalność przez błony komórkowe. Zalety te pozwalają na manipulowanie mrożonymi zarodkami w temperaturze pokojowej4; inne metody witryfikacji wymagają pracy z zarodkami w niższych temperaturach i nie zawsze znajdują zastosowanie u niektórych szczepów myszy, w tym BALB/c6. Pierwszą metodę witryfikacji opartą na glikolu etylenowym opracowali Kasai i wsp. w 1990 roku5,7. Ponieważ oryginalna metoda została zoptymalizowana pod kątem zastosowania plastikowych słomek jako pojemników, nieco zmodyfikowaliśmy protokół dla krioprobek, które są łatwiej dostępne w laboratoriach i bardziej odporne na uszkodzenia mechaniczne. W związku z tym opisana tutaj metoda witryfikacji może znaleźć zastosowanie w wielu laboratoriach wykorzystujących myszy jako modele badawcze. Tą samą metodą można mrozić zarodki myszy w stadium moruli i blastocysty8 oraz zarodki szczura9. Odkryliśmy jednak niedawno, że jakość krioprobek może wpływać na przeżywalność zarodków po zamrażaniu i rozmrażaniu. Dlatego przed witryfikacją zarodków niezbędne jest sprawdzenie gładkości wewnętrznej powierzchni krioprobek (np. patrz w Tabeli odczynników i sprzętu). 
Metody witryfikacji mają wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi metodami powolnego mrożenia, lecz wykazują one naturalną wadę w odniesieniu do celów transportowych. Ponieważ witryfikowane embriony powinny być przechowywane w temperaturze poniżej -120°C w celu zachowania ich żywotności, do ich bezpiecznego transportu zazwyczaj stosuje się kontenery transportowe typu dry shipper. Kontenery te są ciężkie i nieporęczne, a ich transport w obie strony jest kosztowny, zwłaszcza w przypadku przesyłek międzynarodowych. Obecnie opracowujemy nową metodę witryfikacji, dzięki której witryfikowane embriony mogą być przechowywane w temperaturze suchego lodu (około -80°C) przez co najmniej 7 dni10. Metoda ta powinna stanowić witryfikację nowej generacji.

<table><tbody><tr><td>Albumin surowicy bydlęcej</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>12657</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>058-00986</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 70</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0310-10</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>041-00595</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>500-04195</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;#183;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;#183;2H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>031-00435</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4687</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8574</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka M16</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Kriotubka</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-4501</td><td>&amp;#8220;Probówka kriogeniczna&amp;#8221;</td></tr></tbody></table>

kriokonserwacja embrionów myszy metodą witryfikacji z użyciem glikolu etylenowego

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Kriokonserwacja zarodków myszy stanowi podstawę technologiczną wspierającą nauki biomedyczne, ponieważ dzięki modyfikacjom genetycznym stworzono wiele szczepów myszy, a ich liczba systematycznie wzrasta z roku na rok. Rozwój techniczny tej dziedziny rozpoczął się od metod powolnego mrożenia w latach 70. XX wieku1, a następnie nastąpił rozwój metod witryfikacji opracowanych pod koniec lat 80.2. Zazwyczaj ta druga technika jest korzystniejsza ze względu na szybkość, prostotę oraz wysoką przeżywalność odzyskanych zarodków. Jednak zawarte w niej krioprotektanty są wysoce toksyczne i mogą wpływać na późniejszy rozwój zarodka. W związku z tym technika ta nie znajdowała zastosowania w przypadku niektórych szczepów myszy, nawet gdy roztwory schładzano do 4°C, aby złagodzić efekt toksyczny podczas manipulacji zarodkami. W RIKEN BioResource Center utrzymywanych jest ponad 5000 szczepów myszy o różnych podłożach genetycznych i fenotypach3, dlatego zoptymalizowaliśmy technikę witryfikacji, która pozwala nam kriokonserwować zarodki wielu różnych szczepów myszy, zapewniając wysoką przeżywalność zarodków po witryfikacji i rozmrażaniu (a dokładniej upłynnianiu) w temperaturze otoczenia4.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę witryfikacji embrionów myszy, która została z sukcesem zastosowana w naszym ośrodku. Roztwór do krio konserwacji zawiera glikol etylenowy zamiast DMSO, aby zminimalizować toksyczność dla embrionów5. Zawiera on również Ficoll w celu zapobiegania dewitryfikacji oraz sacharozę do regulacji osmotycznej. Embriony można przetwarzać w temperaturze pokojowej i przenieść do ciekłego azotu w ciągu 5 min. Ponieważ oryginalna metoda została zoptymalizowana pod kątem plastikowych słomek jako pojemników, nieznacznie zmodyfikowaliśmy protokół dla kriotubek, które są łatwiej dostępne w laboratoriach i bardziej odporne na uszkodzenia mechaniczne. Szczegółowo opisujemy również procedurę rozmrażania witryfikowanych embrionów, ponieważ jest to krytyczny etap dla efektywnego odzyskania żywych myszy. Metodologie te będą pomocne badaczom i technikom, którzy potrzebują bezpiecznego i kosztowo efektywnego sposobu konserwacji szczepów myszy do późniejszego wykorzystania.

Opisano metodę witryfikacji zarodków myszy opartą na glikolu etylenowym. Jest ona korzystniejsza od innych metod ze względu na prostotę i niską toksyczność dla zarodków, dzięki czemu może znaleźć szerokie zastosowanie u wielu szczepów myszy, w tym u myszy inbredowych i modyfikowanych genetycznie.

Kriokonserwacja embrionów myszy metodą witryfikacji z użyciem glikolu etylenowego

Kriokonserwacja zarodków mysich stanowi podstawę technologiczną wspierającą nauki biomedyczne, ponieważ wiele szczepów myszy zostało wytworzonych drogą modyfikacji genetycznej...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kriokonserwacja embrionów myszy w ciekłym azocie oraz ich rozmrażanie w celu uzyskania żywych myszy. Jest to realizowane poprzez początkowe zanurzenie embrionów myszy w medium równoważącym, przeniesienie ich do medium do witryfikacji w probówce kriogenicznej, a następnie umieszczenie ich w zbiorniku z ciekłym azotem. Następnie embriony mogą zostać rozmrożone w medium o wysokiej osmolarności i inkubowane w medium hodowlanym aż do momentu ich przeniesienia do samic biorców.Ostatecznie wyniki wykazują przeżywalność ponad 90% embrionów po rozmrożeniu z witryfikacji oraz wskaźnik urodzeń na poziomie od 30 do 70% po transferze embrionów. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że przenikalny krioprotektant glikol jest mniej toksyczny dla embrionów niż konwencjonalny krioprotektant. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu procedurę zademonstruje technik z mojego laboratorium.Przygotować dwa dwukomórkowe embriony mysie w hodowli, uzyskane poprzez kojenie naturalne lub konwencjonalne techniki IVF, przenosząc je do probówki kriogenicznej w celu późniejszego przechowywania, a następnie dodać 50 µL roztworu do zamrażania embrionów EF S 40. Następnie przygotować plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm lub 60 mm z 50 µL roztworu EFS 20 w temperaturze pokojowej.Za pomocą szklanej kapilary przenieś do szalki do 30 embrionów. Należy uważać, aby nie przenieść pożywki hodowlanej. Aby zapobiec odwodnieniu embrionów, umieść je na dnie kropli.Po około 60 do 90 sekundach, używając kapilary, pobierz odwodnione embriony o skurczonej morfologii. Przenieś te embriony do roztworu EFS w probówce kriogenicznej, przenosząc jak najmniejszą ilość EFS 20.Po przeniesieniu embrionów należy pozwolić im osiąść w EFS 40 przez jedną minutę przed zamrożeniem ich w ciekłym azocie. Przed rozmrożeniem embrionów należy umieścić w naczyniu hodowlanym co najmniej dwie krople po 10 µL pożywki do hodowli embrionów o wysokiej osmolarności, takiej jak pożywka M 16. Następnie krople należy całkowicie przykryć olejem silikonowym lub mineralnym, a naczynie umieścić w inkubatorze z dwutlenkiem węgla do czasu użycia.Następnie, w masce ochronnej i rękawicach kriogenicznych, podgrzej roztwór TS one do 37°C. Wyjmij embriony z pojemnika z ciekłym azotem. Następnie szybko otwórz probówkę kriogeniczną i wylej ciekły azot z powrotem do pojemnika lub do innego odpowiedniego naczynia.Następnie odczekać 30 sekund. Teraz dodać 850 µL ciepłego roztworu TS one do probówki kriogenicznej. Delikatnie aspirować i wydmuchiwać roztwór około 10 razy, aby został równomiernie rozpuszczony.Następnie przenieś całą objętość do plastikowej szalki Petriego o średnicy 60 mm lub na szkiełko zegarkowe i odczekaj trzy minuty, aż embriony wyrównają temperaturę do temperatury pokojowej, w której powinny pozostać przez resztę procedury. Nie należy używać urządzenia grzewczego.Szybko obejrzyj embriony w szalce pod mikroskopem stereoskopowym, aby ocenić ich wygląd na początku tej inkubacji. Po około dwóch minutach inkubacji zatop embriony, delikatnie potrząsając szalką, aż medium rozprowadzi się po jej powierzchni. W ostatniej minucie inkubacji nanieś do szalki trzy oddzielne krople roztworu TS two o objętości 50 µL.Po upływie trzech minut za pomocą stereomikroskopu należy potwierdzić, że embriony lekko się skurczyły. Jeśli embriony są nadal obrzęknięte, należy kontynuować inkubację przez kolejne jedną do trzech minut. Następnie należy pobrać embriony szklaną kapilarą i przenieść je do pierwszej kropli TS two.Odczekaj trzy minuty i przenieś embriony do drugiej kropli, a następnie do trzeciej kropli. Na koniec wyjmij z inkubatora przygotowaną szalkę z pożywką dla embrionów i za pomocą szklanej kapilary przenieś embriony do pierwszej kropli pożywki.W przypadku obserwacji pod stereoskopem, embriony powinny powoli odzyskać swoją prawidłową morfologię. Teraz należy umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze na około 10 minut. Następnie należy wypłukać sacharozę przeniesioną z TS two.Przenieś embriony do kolejnej kropli pożywki hodowlanej. Kontynuuj hodowlę embrionów w inkubatorze CO2 aż do ich transferu do uk. samic biorców. Po witryfikacji i regeneracji od 300 do 480 embrionów trzech różnych szczepów myszy, przeżywalność była bardzo wysoka.Po rozmrożeniu odsetek embrionów o prawidłowej morfologii wynosił od 93 do 99%, a co najmniej 84% z tych embrionów rozwinęło się do stadium blastocyst. Należy pamiętać, że praca z ciekłym azotem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować środki ostrożności, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu i zminimalizować ekspozycję na wycieki w bliskiej odległości. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać zasad bezpiecznego obchodzenia się z azotem.

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Krioprezerwacja zarodków mysich metodą witryfikacji na bazie glikolu etylenu

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółową instrukcję krok po kroku, jak pobierać i krio konserwować oocyty chomika, aby uzyskać wysoki wskaźnik przeżywalności po rozmrożeniu. Tę samą procedurę można zastosować do skutecznego zamrażania i rozmrażania zarodków myszy na różnych etapach rozwoju przedimplantacyjnego.

Pozyskiwanie i kriokonserwacja oocytów chomika oraz embrionów myszy

Zarodki przedimplantacyjne mogą być kriokonserwowane po umieszczeniu w hipertonicznym roztworze krioprotekcyjnym w celu wywołania odwodnienia komórkowego. Po osiągnięciu stanu równowagi w roztworze otaczającym zarodek indukuje się tworzenie kryształków lodu. Dalsze odwodnienie następuje podczas powolnego chłodzenia zarodka do temperatur ujemnych przed zanurzeniem w ciekłym azocie w celu przechowywania.

Kriokonserwacja embrionów przedimplantacyjnych bydła, owiec i kóz

W niniejszej pracy prezentujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy. Dzięki zastosowaniu tego zestawu konsekwentnie poprawiono rozwój embrionów w stadium dwóchkomórkowym po rozmrożeniu plemników w 5 szczepach myszy. W okresie 1,5 roku zarchiwizowano 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy poprzez krio konserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie pomyślnie odzyskano je metodą IVF.

Kriokonserwacja i odzyskiwanie plemników myszy przy użyciu zestawu I·Cryo

W tym filmie opisujemy procedurę witryfikacji pobranych zarodków królika na pożądanym etapie rozwoju przy użyciu glikolu etylenowego i dimetylosulfotlenku jako krioprotektantów oraz słomy kriogenicznej jako systemu nośnego. Zarodki zeszklone mają wysoki wskaźnik przeżywalności i mogą być przechowywane przez dłuższy czas do momentu wykorzystania.

Witryfikacja zarodków królików za pomocą słomki kriogenicznej: ultraszybka technika chłodzenia w celu zachowania zarodków królika do długotrwałego przechowywania

Ten film pokazuje procedurę rozmrażania zeszklonych zarodków królika oraz kroki zapobiegawcze dla optymalnego odzyskiwania zarodków.

Rozmrażanie zarodków królików: procedura rozgrzewająca w celu odzyskania kriokonserwowanych zarodków królików do transferu zarodków

Transfer zarodków macicowo-jajowodowych wykorzystuje połączenie macicowo-jajowodowe jako barierę zapobiegającą odpływowi zarodka, który może wystąpić podczas transferu macicy. Mężczyźni poddani wazektomii są zobowiązani do pozyskania biorców pseudociężarnych do transferu zarodków. Omówiono obie techniki.

Transfer zarodka macicowo-jajowodowego i wazektomia w modelu mysim

MicroSecure Vitrification został opracowany jako niekomercyjny, aseptyczny system zamkniętych urządzeń do witryfikacji, który jest zgodny z dobrymi praktykami FDA w zakresie produkcji i obchodzenia się z tkankami. Ze względu na wycofanie z przemysłu hydrofobowych słomek zarodkowych, procedura witryfikacji została zmodyfikowana tak, aby obejmowała wewnętrzną uszczelkę przed standardową wewnętrzną zatyczką bawełnianą.

Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs) są w ciągłym emulucie ocenianym w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z tym ryzyka. Manuskrypt ten opisuje minimalnie inwazyjną procedurę transferu zarodków z skutecznym protokołem kriokonserwacji, który pozwala na wykorzystanie królików jako idealnego zwierzęcego modelu rozrodu człowieka.

Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Tutaj prezentujemy poklatkowy protokół morfometryczny, aby śledzić intensywność kurczenia się i ponownego rozszerzania blastocyst podczas interwencji prewitryfikacyjnych i regeneracji po ociepleniu. Zastosowanie protokołu jest możliwe w laboratoriach zapłodnienia pozaustrojowego wyposażonych w mikroskopy poklatkowe i jest zalecane w opracowaniu optymalnej metody witryfikacji blastocyst.

Protokół morfometryczny do obiektywnej oceny zachowania blastocyst podczas etapów witryfikacji i ocieplania

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

W tym miejscu przedstawiamy protokół Spatula Montevideo do witryfikacji zarodków przedimplantacyjnych myszy i owiec, składający się z domowej szpatułki i wykorzystujący domowe roztwory. Zarodki są szybko równoważone w dwóch roztworach krioprotekcyjnych o rosnącym stężeniu, ładowane na szpatułkę, zanurzane w ciekłym azocie, a na koniec zamykane słomką o pojemności 0,5 ml.

Szpatułka Montevideo Urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków

Poznaj metodę witryfikacji zarodków myszy z użyciem glikolu etylenowego, która zapewnia przeżywalność powyżej 90% i wysokie wskaźniki urodzeń. Protokół ten jest mniej toksyczny niż konwencjonalne metody kriokonserwacji.

Kriokonserwacja embrionów myszy metodą witryfikacji z użyciem glikolu etylenowego

Przeglądaj więcej filmów