Kriokonserwacja zarodków myszy za pomocą witryfikacji na bazie glikolu etylenowego
18 listopada 2011
Opisano metodę witryfikacji mysich zarodków na bazie glikolu etylenowego. Jest korzystna w stosunku do innych metod ze względu na swoją prostotę i niską toksyczność embrionalną, a zatem może być szeroko stosowana do wielu szczepów myszy, w tym myszy wsobnych i zmodyfikowanych genowo.
Ogólnym celem tej procedury jest kriokonserwacja zarodków myszy w ciekłym azocie i rozmrożenie ich w celu odzyskania żywych myszy. Osiąga się to poprzez najpierw zanurzenie zarodków myszy w pożywce równoważącej, przeniesienie ich do pożywki witryfikacyjnej w krioprobówce, a następnie umieszczenie ich w zbiorniku z ciekłym azotem. Później zarodki mogą być rozmrażane w pożywce o wysokiej osmozie i inkubowane w pożywce hodowlanej, aż zostaną przeniesione do samic biorcy.
Ostatecznie wyniki wskazują na przeżycie ponad 90% zarodków po rozmrożeniu witryfikacji, a wskaźnik urodzeń od 30 do 70% po transferze zarodków. Główną zaletą tej techniki jest to, że przepuszczalny krioprotektant glikol jest mniej toksyczny dla zarodków niż konwencjonalny krioprotektant. Procedurę zademonstruje technik z mojego laboratorium przed rozpoczęciem tego protokołu.
Przygotować dwukomórkowe zarodki myszy w hodowli uzyskanej przez naturalne krycie lub konwencjonalne techniki IVF do krioprobówki w celu ewentualnego przechowywania, dodać 50 mikrolitrów roztworu do zamrażania zarodków EF S 40. Następnie przygotuj plastikową szalkę Petriego o grubości 35 milimetrów lub 60 milimetrów o temperaturze pokojowej 50 mikrolitrów. EFS 20.
Użyj szklanej kapilary, aby przenieść do naczynia do 30 zarodków. Uważaj, aby nie przenosić pożywki hodowlanej. Ponadto, aby zapewnić odwodnienie zarodków, umieść je na dnie kropli.
Po około 60 do 90 sekundach użyj rurki kapilarnej, aby pobrać odwodnione zarodki. Ze skurczoną morfologią. Przenieś te zarodki do roztworu EFS w probówce kriogenicznej, przenosząc jak najmniej EFS 20.
Po przeniesieniu zarodków pozwól im osiąść w EFS 40 przez jedną minutę przed zamrożeniem ich w ciekłym azocie. Przed rozmrożeniem zarodków umieścić w naczyniu hodowlanym co najmniej dwie krople 10 mikrolitrów pożywki do hodowli zarodków o wysokiej osmolarności, takiej jak pożywka M 16. Następnie całkowicie przykryj krople silikonem lub olejem mineralnym i umieść naczynie w inkubatorze dwutlenku węgla do czasu użycia.
Następnie podgrzej roztwór TS one do 37 stopni Celsjusza, nosząc maskę na twarz i rękawiczki kriogeniczne. Wyjmij zarodki ze zbiornika ciekłego azotu. Teraz szybko otwórz rurkę kriogeniczną i wylej ciekły azot do zbiornika lub dowolnego odpowiedniego pojemnika.
Następnie odczekaj 30 sekund. Teraz dodaj 850 mikrolitrów ciepłego roztworu TS one do rurki kriogenicznej. Delikatnie zassaj i odczep roztwór około 10 razy, aby równomiernie się rozpuścił.
Następnie przenieś całą objętość na plastikową 60-milimetrową szalkę Petriego. Lub szkło zegarkowe poczekaj trzy minuty, aż zarodki zrównoważą się do temperatury pokojowej, w której powinny pozostać do końca zabiegu. Nie używaj urządzenia rozgrzewającego.
Szybko zbadaj zarodki w naczyniu pod mikroskopem stereoskopowym, aby dowiedzieć się, jak wyglądają na początku tej inkubacji. Po około dwóch minutach inkubacji zanurz zarodki, delikatnie potrząsając naczyniem, aż podłoże rozprowadzi się na powierzchni naczynia. W ostatniej minucie inkubacji wyrzuć trzy oddzielne krople roztworu TS two o pojemności 50 mikrolitrów w naczyniu.
Po upływie trzech minut użyj mikroskopu stereoskopowego, aby potwierdzić, że zarodki nieznacznie się skurczyły. Jeśli zarodki są nadal spuchnięte, kontynuuj inkubację jeszcze przez jedną do trzech minut. Teraz podnieś zarodki za pomocą szklanej kapilary i przenieś je do pierwszej kropli TS dwa.
Odczekaj trzy minuty i przenieś zarodki do drugiej kropli. Po nim następuje trzecia kropla. Na koniec należy pobrać przygotowane naczynie na zarodki przechowywane w inkubatorze i za pomocą szklanej kapilary przenieść zarodki do pierwszej kropli pożywki.
W przypadku badania pod stereoskopem zarodki powinny powoli odzyskiwać swoją normalną morfologię. Teraz włóż naczynie z powrotem do inkubatora na około 10 minut. Następnie, aby wypłukać sacharozę, która została przeniesiona z TS dwa.
Przenieś zarodki do następnej kropli pożywki hodowlanej. Kontynuuj hodowlę zarodków w inkubatorze CO2, aż zostaną przeniesione do klatki moczowej samic biorczy. Po witryfikacji i odzyskaniu od 300 do 480 zarodków trzech różnych szczepów myszy, przeżywalność była bardzo wysoka.
Po rozmrożeniu odsetek zarodków wykazujących prawidłową morfologię wynosił od 93 do 99%, a z tych zarodków co najmniej 84% rozwinęło się w torbiele blastowe. Nie zapominaj, że praca z nieszczelnym azotem może być bardzo niebezpieczna i należy zachować środki ostrożności, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu i zminimalizować narażenie na wyciek na krótkich dystansach. Wykonując tę procedurę, należy zawsze przyjmować azot.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę witryfikacji opartą na glikolu etylenowym w celu kriokonserwacji zarodków myszy. Technika ta jest korzystna ze względu na swoją prostotę i niską toksyczność dla zarodków, co czyni ją odpowiednią dla różnych szczepów myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia rozrodu
- Embriologia
Wstęp
- Witryfikacja jest metodą stosowaną do przechowywania próbek biologicznych w niskich temperaturach.
- Konwencjonalne krioprotektanty mogą być toksyczne dla embrionów.
- Glikol etylenowy stanowi mniej toksyczną alternatywę do konserwacji embrionów.
- Metoda ta może być stosowana u myszy inbredalnych i modyfikowanych genetycznie.
Cel badania
- Opracowanie prostej i skutecznej metody kriokonserwacji embrionów myszy.
- Ocena przeżywalności oraz odsetka urodzeń embrionów po witryfikacji i rozmrażaniu.
- Dostarczenie protokołu, który może zostać szeroko wdrożony w laboratoriach.
Zastosowane metody
- Zarodki są zanurzane w mediach do equilibracji i witryfikacji.
- Zarodki są przechowywane w ciekłym azocie w celu kriokonserwacji.
- Rozmrażanie polega na przeniesieniu zarodków do medium o wysokiej osmolalności.
- Zarodki są hodowane do momentu, gdy będą gotowe do transferu do samic biorczych.
Główne wyniki
- Po rozmrażaniu zaobserwowano przeżywalność na poziomie ponad 90%.
- Wskaźniki urodzeń po transferze zarodków wynosiły od 30% do 70%.
- Zarodki wykazały prawidłową regenerację morfologiczną po rozmrażaniu.
- Odnotowano wysokie wskaźniki rozwoju do stadium blastocysty.
Wnioski
- Metoda oparta na glikolu etylenowym jest skuteczna w kriokonserwacji zarodków myszy.
- Technika ta minimalizuje toksyczność embrionalną w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Stanowi ona praktyczną opcję dla różnych szczepów myszy wykorzystywanych w badaniach.
Często zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Stabilna kriokonserwacja genetycznie zróżnicowanych zarodków myszy stanowi podstawę ciągłości badań translacyjnych i elastyczności w procesach rozwoju produktów biofarmaceutycznych. Witryfikacja oparta na glikolu etylenowym zapewnia wysoką przeżywalność zarodków i szerokie zastosowanie w różnych szczepach, co wspiera skalowalne zarządzanie koloniami oraz ochronę zasobów genetycznych. Metoda ta zmniejsza ryzyko biologiczne i bariery operacyjne w dostępie do modeli przedklinicznych w ramach programów odkrywczych i rozwojowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpieczną archiwizację i szybkie pobieranie genetycznie zmodyfikowanych modeli mysich do badań opartych na hipotezach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez zapewnienie spójnego dostępu do zwalidowanych systemów in vivo.
- Ułatwia selekcję portfolio poprzez utrzymywanie gotowych zasobów różnorodnych tło genetycznych w celu minimalizacji ryzyka mechanistycznego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane zarodki o wysokiej żywotności do dalszego screeningu fenotypowego oraz opracowywania testów.
- Gwarantuje powtarzalność i skalowalność w tworzeniu kohort przedklinicznych z zapasów kriozachowanowych.
- Zmniejsza zmienność materiałów biologicznych, wspierając niezawodne procesy oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Utrzymuje genetyczne modele chorób zapewniające porównywalność w badaniach podłużnych i międzybadawczych.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od wczesnej fazy odkryć po walidację przedkliniczną poprzez zabezpieczenie kluczowych szczepów.
- Wspiera decyzje o postępie prac w oparciu o analizę ryzyka, zapewniając dostępność modeli do badań potwierdzających.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół witryfikacji integruje etapy generowania modeli, zarządzania koloniami oraz inicjowania badań przedklinicznych, umożliwiając płynne przejście od inżynierii genetycznej do walidacji in vivo.
- Biologia odkrywcza: Pozwala na zachowanie zwalidowanych modeli genetycznych do iteracyjnego testowania hipotez i analizy szlaków sygnałowych.
- Screening: Dostarcza wysokiej jakości embriony do odtwarzalnego opracowywania testów i kampanii screeningowych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty przeżywalności i rozwoju w celu oceny wydajności kriokonserwacji.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość modeli dla dopasowania biomarkerów i badań translacyjnych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną, zestandaryzowaną możliwość kriokonserwacji w ramach programów B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez zachowanie wierności modelu.
- Wartość operacyjna: Usprawnia zarządzanie koloniami dzięki skalowalnej i powtarzalnej krio konserwacji oraz regeneracji.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez zapewnienie dostępności modelu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz szybki postęp w badaniach nad zwalidowanymi celami.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie manipulacji zarodkami oraz protokołów kriokonserwacji.
- Wymagany jest dostęp do przechowywania w ciekłym azocie oraz infrastruktury do kontrolowanego rozmrażania.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia spójnej przeżywalności i możliwości dalszego wykorzystania.
- Metoda jest dostosowywalna do szerokiego zakresu szczepów myszy, z optymalizacją protokołu w razie potrzeby.
- Przy pracy z materiałami kriogenicznymi niezbędne jest przestrzeganie zasad bezpieczeństwa.
