JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 5:37 min. • May 29th, 2025
Zacznij od skrawka tkanki skórnej naskórka zawierającego śródnaskórkowe włókna nerwowe lub IENF, cienkie zakończenia neuronów czuciowych.
IENF są bogate w mitochondria, dostarczając energię do przekazywania sygnałów neuronów.
Tkanka ma znakowane fluorescencyjnie IENF, mitochondria i jądra naskórka.
Za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego sekwencyjnie pobierz dyskretne sygnały fluorescencyjne o odpowiednich długościach fal dla jąder, IENF i mitochondriów.
Aktywuj skanowanie na żywo, aby przechwycić sygnał IENF, obejmujący warstwę naskórka.
Następnie wykonaj skanowanie sekwencyjne dla każdego sygnału, aby wyeliminować przesłuch sygnału fluorescencji.
Na podstawie połączonego obrazu, za pomocą oprogramowania, przytnij i wyizoluj fluorescencyjne na niebiesko komórki naskórka.
Następnie przetwórz przycięty obszar, aby zwiększyć rozdzielczość zielonych sygnałów IENF i czerwonych sygnałów mitochondrialnych.
Następnie wygeneruj obraz powierzchni 3D, aby utworzyć maskę dla IENF, a następnie nałóż na obraz powierzchni mitochondriów, aby wyizolować mitochondria specyficzne dla nerwów.
W końcowym wyniku IENF pojawiają się w kolorze cyjanu, podczas gdy mitochondria pojawiają się jako maleńkie struktury w kolorze magenta.
Wybierz 40-krotny obiektyw zanurzeniowy w olejku w odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Wybierz odpowiednie lasery i detektory do obrazowania jąder, włókien nerwowych i mitochondriów. Wprowadź następujące parametry skanowania do oprogramowania mikroskopu o rozdzielczości 12 bitów. Częstotliwość skanowania 600 Hz z uśrednianiem dwóch klatek i zoomem 2,2. Ustaw oprogramowanie mikroskopu w celu uzyskania zoptymalizowanej rozdzielczości bocznej, wybierając rozdzielczość skanowania 1024 na 1024. Zoptymalizuj rozdzielczość osiową i przekrój optyczny, wybierając aperturę konfokalną jednej przewiewnej jednostki z krokiem z 210 nanometrów.
Skanuj każdy sygnał osobno i dostosuj napięcie detektora oraz przesunięcie, aby usunąć wszelkie nadmiernie i niedostatecznie nasycone piksele. Aktywuj skanowanie na żywo dla sygnału nerwowego i dostosuj regulator ostrości z, aby znaleźć i ustawić górną i dolną płaszczyznę ogniskową w oprogramowaniu mikroskopu, które obejmują sygnał nerwowy w sekcji tkanki. Zeskanuj ostateczną wersję serii Z za pomocą skanowania sekwencyjnego, aby wyeliminować przesłuchy sygnału fluorescencyjnego.
Odizoluj naskórek od warstwy rogowej naskórka i skóry właściwej, rysując obszar wokół naskórka za pomocą narzędzia do zaznaczania na zduplikowanym obrazie oryginalnego obrazu. Następnie przytnij obraz do zaznaczenia. Oblicz funkcje rozproszenia punktów dla zielonych i czerwonych sygnałów konfokalnych fluorescencji, korzystając z funkcji obliczania funkcji rozproszenia. Następnie ustaw parametry średniego współczynnika załamania światła dla oleju na 1,515, a aperturę numeryczną dla obiektywu 40x na 1,25. Ustaw otwór detektora w jednym obszarze, jednostce i wybierz długość fali wzbudzenia laserowego.
Użyj przywracania iteracyjnego ustawionego na 100% ufność, limit iteracji wynoszący 10 cykli oraz zielone i czerwone PSF do dekonwolucji sygnałów zielonej i czerwonej fluorescencji. Użyj narzędzia Utwórz powierzchnię, aby utworzyć powierzchnię wokół zdekonwoluowanych sygnałów nerwowych, wybierając niezaznaczoną funkcję gładkości, bezwzględną intensywność progowania, dolny próg 3 000 i górny próg 65 535. Utrzymuj powierzchnie powyżej 10 wokseli.
Usuń powierzchnie nienerwowe, używając karty Edycja na powierzchni nerwu, aby wybrać pojedyncze powierzchnie nienerwowe, lub przytrzymaj Control, aby wybrać wiele powierzchni nienerwowych. Usuń wybrane powierzchnie nienerwowe, naciskając przycisk Usuń. Użyj zakładki Edycja na powierzchni nerwu i naciśnij przycisk Maskuj wszystko we właściwościach maski.
W nowym oknie wybierz Kanał 5 Mitochondria zdeconvolved pod wyborem Kanał, a następnie zaznacz zduplikowany kanał przed zastosowaniem maski. Naciśnij przycisk radiowy, aby uzyskać stałą wewnątrz na zewnątrz i sprawdź, czy ustawiona jest powierzchnia zewnętrzna wokseli na 0,0. I naciśnij przycisk OK.
Na koniec utwórz powierzchnie specyficzne dla mitochondriów za pomocą narzędzia Utwórz powierzchnię, aby utworzyć powierzchnię wokół zamaskowanych, zdekonwoluowanych sygnałów mitochondrialnych, wybierając niezaznaczoną funkcję Wygładzanie i używając opcji Odejmowanie tła do progowania. Ustaw średnicę największej kuli na 1,50 mikrometra, dolny próg na 2 000, a górny próg na maksymalnie 65 535. Upewnij się, że powierzchnie powinny znajdować się powyżej 1,0 wokseli.