Mikroskopia dwufotonowa do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków siatkówki myszy

Umieść szkiełko nakrywkowe zawierające montowaną na błonie tkankę siatkówki myszy pod mikroskopem dwufotonowym.

W tkance dochodzi do ekspresji biosensora wapnia opartego na FRET w fotoreceptorach czopków.

Korzystając z obiektywu zanurzonego w wodzie, skup się na tkance.

W oświetleniu tła zakończenia aksonów stożków pozostają zdepolaryzowane, umożliwiając napływ wapnia.

Wewnątrzkomórkowe wiązanie wapnia zmienia konformację biosensora, zbliżając do siebie fluorofory donorowe i akceptorowe.

Rozpocznij obrazowanie dwufotonowe.

Laser mikroskopu skupia niskoenergetyczne światło w bliskiej podczerwieni w tkance.

W ognisku lasera dwa fotony jednocześnie wzbudzają bioczujnik, wyzwalając transfer energii od dawcy do akceptora.

Zwiększa to fluorescencję akceptora, jednocześnie zmniejszając fluorescencję donora.

Obliczyć współczynnik fluorescencji.

Następnie zapewnij stymulację świetlną w celu hiperpolaryzacji czopków, zmniejszając wewnątrzkomórkowy poziom wapnia.

Powoduje to odwrócenie konformacji bioczujnika, hamując transfer energii od dawcy do akceptora i obniżając współczynnik fluorescencji.

Zapisz odpowiedzi, aby przeanalizować wywołaną światłem dynamikę wapnia w zakończeniach aksonów stożka.

Przenieś plasterek z komory trzymania do komory rejestracyjnej i natychmiast rozpocznij perfuzję z karbotlenowym roztworem zewnątrzkomórkowym. Utrzymuj natężenie przepływu perfuzyjnego 2 mililitry na minutę i temperaturę 37 stopni Celsjusza w komorze rejestracyjnej. Użyj obiektywu zanurzającego w wodzie 20x, 0,95 NA i kamery CCD w połączeniu z diodą LED na podczerwień pod komorą nagrywania, aby zlokalizować wycinek siatkówki.

Uruchom system obrazowania dwufotonowego, zgodnie ze wskazaniami producenta. Następnie włącz laser i ustaw go na 860 nanometrów. Włącz dwa kanały detekcji do obrazowania fluorescencyjnego ECFP i cytrynu. Następnie, korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, steruj mikroskopem dwufotonowym, aby zeskanować i wybrać rząd końcówek stożkowych do nagrywania. Ustaw akwizycję obrazu na obrazy o wymiarach 128 na 16 pikseli lub podobną konfigurację.

Ogranicz skanowany obszar do końcówek stożka, aby uniknąć wybielania fotopigmentów w zewnętrznych segmentach. Włącz laser. Pozwól stożkom dostosować się do lasera skanującego i światła tła bodźca przez 20 do 30 sekund przed zaprezentowaniem bodźców świetlnych lub zastosowaniem środków farmakologicznych. Teraz rozpocznij prezentację dowolnych bodźców. Bodźce są generowane poprzez modulację intensywności dwóch diod LED w czasie, za pomocą płytki mikroprocesorowej sterowanej przez niestandardowe oprogramowanie. Następnie rozpocznij jednoczesne nagrywanie dwóch kanałów fluorescencyjnych za pomocą odpowiedniego oprogramowania do akwizycji obrazu.