Mikroskopia dwufotonowa do monitorowania dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków siatkówki myszy

Umieść szkiełko nakrywkowe zawierające montowaną na błonie tkankę siatkówki myszy pod mikroskopem dwufotonowym.

W tkance dochodzi do ekspresji biosensora wapnia opartego na FRET w fotoreceptorach czopków.

Korzystając z obiektywu zanurzonego w wodzie, skup się na tkance.

W oświetleniu tła zakończenia aksonów stożków pozostają zdepolaryzowane, umożliwiając napływ wapnia.

Wewnątrzkomórkowe wiązanie wapnia zmienia konformację biosensora, zbliżając do siebie fluorofory donorowe i akceptorowe.

Rozpocznij obrazowanie dwufotonowe.

Laser mikroskopu skupia niskoenergetyczne światło w bliskiej podczerwieni w tkance.

W ognisku lasera dwa fotony jednocześnie wzbudzają bioczujnik, wyzwalając transfer energii od dawcy do akceptora.

Zwiększa to fluorescencję akceptora, jednocześnie zmniejszając fluorescencję donora.

Obliczyć współczynnik fluorescencji.

Następnie zapewnij stymulację świetlną w celu hiperpolaryzacji czopków, zmniejszając wewnątrzkomórkowy poziom wapnia.

Powoduje to odwrócenie konformacji bioczujnika, hamując transfer energii od dawcy do akceptora i obniżając współczynnik fluorescencji.

Zapisz odpowiedzi, aby przeanalizować wywołaną światłem dynamikę wapnia w zakończeniach aksonów stożka.

Przeni