Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa
13 września 2011
Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).
Ogólnym celem tej procedury jest badanie właściwości elektrofizjologicznych serca, takich jak przewodzenie, repolaryzacja, arytmogeneza i gospodarka wapniowa, przy użyciu technik mapowania optycznego w perfundowanym sercu królika w układzie Langendorf. Jest to realizowane poprzez izolację i perfuzję wsteczną całego serca królika poprzez aortę. Kolejnym krokiem procedury jest odsłonięcie powierzchni serca, zniesienie skurczów serca poprzez zastosowanie stanu hamowania sprzężenia pobudzenia ze skurczem oraz odpowiednie barwienie mięśnia sercowego za pomocą wskaźników fluorescencyjnych wrażliwych na napięcie oraz wapń.
Następnie, przy użyciu panoramicznego systemu mapowania optycznego, rejestrowane są optyczne potencjały czynnościowe z dużej części epikardium komór. Sygnały optyczne są następnie nanoszone na zrekonstruowaną geometrię 3D powierzchni epikardialnej serca. Na tym etapie, przy użyciu niepanoramicznego podwójnego systemu obrazowania, można jednocześnie rejestrować optyczny potencjał czynnościowy oraz przejściowe stężenie wapnia.
Niniejsza procedura dostarcza ilościowych danych dotyczących przestrzennych i czasowych właściwości mięśnia sercowego, pobudzenia i repolaryzacji, a także spójnych parametrów gospodarki wapniowej, które mogą być analizowane zarówno podczas prawidłowego rytmu, jak i w przypadku arytmii przedsionkowych i komorowych. Witam, nazywam się dr Iger Eov. Jestem profesorem inżynierii biomedycznej na Washington University w St. Louis.
Przedstawiona dzisiaj technika optyczna to unikalna technologia, która posiada szereg zalet w porównaniu do tradycyjnych mikro- i mikroelektrogramów, ponieważ pozwala na jednoczesną rejestrację dziesiątek i dziesiątek tysięcy potencjałów czynnościowych oraz przejściowych zmian stężenia wapnia. Ponadto technologia ta jest odporna na artefakty powstające podczas stymulacji elektrycznej i defibrylacji, które silnie zniekształcają potencjały czynnościowe rejestrowane przez wszelkie elektrogramy. Co więcej, przejściowe zmiany stężenia wapnia mogą być rejestrowane wyłącznie za pomocą tej techniki.
Po prostu nie ma alternatywy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie elektrofizjologii serca, takie jak mechanizmy indukcji, utrzymywania i przerywania zagrażających życiu arytmii przedsionkowych i komorowych, a także modelowanie funkcji w obrębie przewodzenia i sprzężenia pobudzenia z kurczem w chorobach takich jak wrodzone wady serca, choroby metaboliczne i niewydolność serca. Po przygotowaniu do operacji, przeprowadzić eutanazję królika za pomocą mieszanki pentobarbitalu sodu i heparyny.
Gdy tylko królik przestanie reagować na odruch bólowy, otwórz klatkę piersiową i wyciśnij serce oraz płuca. Wykonaj nacięcie na górnym odcinku aorty wstępującej, przed odgałęzieniami łuku aorty, a następnie włącz pompę, aby rozpocząć przepływ roztworu Tyro w systemie perfuzji LRF bez recyrkulacji. Szybko zamocuj serce do kaniuli aorty o rozmiarze 16 G podłączonej do systemu perfuzji LOR.
Wypłucz powietrze z aorty i zawiąż kaniulę aorty po całkowitej perfuzji. Bezzwłocznie rozetnij osierdzie. Następnie usuń tłuszcz otaczający serce w obrębie tchawicy i płuc oraz tkanki łączną.
Bardzo ważne jest zapobieganie gromadzeniu się płynu w lewej komorze, co mogłoby doprowadzić do niedokrwienia. Należy zatem wprowadzić silikonową rurkę drenażową przez żyłę płucną i zastawkę mitralną do lewej komory. Następnie przenieść serce wraz z kaniulą do systemu perfuzji Langendorfa z recyrkulacją, wyposażonego w system mapowania optycznego.
Umieść serce w specjalnie wykonanej komorze sześciokątnej i podłącz kaniulę do układu perfuzyjnego. Monitoruj ciśnienie aortalne za pomocą przetwornika ciśnienia i utrzymuj je na poziomie około 60 ± 5 mmHg, regulując szybkość przepływu pompy perfuzyjnej. Utrzymuj pH na poziomie około 7,35 ± 0,05.
Wyłączyć światło w pomieszczeniu i powoli wstrzyknąć światłoczuły roztwór zapasu BLEs statyny przez port wtryskowy w pułapce pęcherzyków powietrza znajdującej się nad kaniulą. Aby osiągnąć stężenie 10 µM BLEs statyny, powoli wstrzyknąć 0,1 ml BLEs statyny. Po każdym wstrzyknięciu dawką bolusa należy odczekać, aż ciśnienie się ustabilizuje przed kolejnym wstrzyknięciem.
Ustaw matryce fotodiod lub PDA pod trzema równomiernie rozłożonymi kątami wokół serca. Następnie, na każdej PDA, ustaw ostrość obrazu serca na matowym szkle płaszczyzny obrazu. Dostosuj położenie kaniuli w komorze sześciokątnej oraz każdej PDA, aż serce zmieści się w polu widzenia wszystkich trzech PDA.
Następnie wykonaj zdjęcie każdego obrazu po ustawieniu ostrości na szkle matowym. Powoli wstrzyknij od 10 do 20 µL roztworu stokowego D four Anep do roztworu perfuzyjnego poprzez port wtryskowy w pułapce pęcherzyków powietrza. Odczekaj trzy minuty.
Następnie ostrożnie umieść elektrodę stymulującą w wybranym miejscu. W tym przypadku została ona umieszczona w centrum serca w widoku przednim. Rozpocznij jednoczesny zapis optyczny z urządzeń PDA.
Upewnij się, że w sygnale optycznym nie występują artefakty ruchu oraz że stosunek sygnału do szumu jest wystarczający do późniejszej analizy danych. Po zakończeniu włącz oświetlenie pomieszczenia i wykonaj dokumentację fotograficzną serca, robiąc jedno zdjęcie co 10 stopni obrotu aparatem umieszczonym w miejscu jednego z PDA. Następnie przystąp do czyszczenia systemu perfuzji.
Umieść kanulowane serce w szklanej komorze i podłącz kanulę do systemu perfuzji. Przymocuj serce do silikonowego dna komory w okolicy wierzchołka komory oraz przedsionków. Aby unieruchomić serce, wyłącz światło w pomieszczeniu i powoli wstrzyknij statynę BLEs przez port wtryskowy, aby zmniejszyć ruchy powierzchni roztworu.
Umieść szklaną płytkę osłonową nad powierzchnią epicardialną. Ta część procedury jest zazwyczaj wykonywana w ciemności, lecz tutaj przeprowadzana jest przy świetle. Aby poprawić jakość obrazu wideo, przesuń system obrazowania podwójnego na wierzch serca.
Teraz ustaw ostrość obu kamer CMO na to samo pole widzenia. Następnie ustaw prowadnice świetlne dla dwóch lamp halogenowych z filtrem wzbudzenia. Przebarw serce, dodając od 10 do 20 µL barwnika wrażliwego na napięcie RH 2 37 przez port wstrzykiwania.
Następnie dodaj 200 µL roztworu 2:00 AM z onic F1 27 w mieszaninie jeden do jednego przez port pułapki pęcherzykowej. Odczekaj około 20 minut, aby umożliwić dyfuzyjną stabilizację roztworu 2:00 AM przed rozpoczęciem mapowania. Teraz wykonaj nagranie próbne.
Wyłącz pompę superfuzyjną, aby uniknąć ruchu na powierzchni roztworu. Włącz lampy halogenowe i wykonaj zapis optyczny obiema kamerami. Następnie wyłącz światło wzbudzenia.
Włącz pompę do superfuzji i sprawdź jakość sygnałów optycznych. Jeśli sygnał jest słaby, ponownie zabarw serce, stosując dodatkowy RH 2 37 i road 2:00 AM. W przypadku wystąpienia artefaktów ruchowych dodaj dodatkową statynę BLEs, aby wyeliminować ruch. Gdy wszystko będzie w porządku, przystąp do zaplanowanego eksperymentu i oczyść system.
Po zakończeniu procesu wykorzystano panoramiczny system mapowania optycznego, aby przedstawić ten widok przedni perfundowanego serca królika w układzie Langa-Endorfa. Dla porównania, rekonstrukcja geometrii serca przedstawia ten sam widok przedni. Pokazana tutaj rozwinięta powierzchnia epikardium została zakodowana kolorami według fazy.
Serce znajdowało się w epizodzie szybkiej arytmii z pięciu lokalizacji wokół rotora. Przedstawiono optyczne potencjały czynnościowe. Tutaj, na czerwono, widoczny jest front aktywacji rozprzestrzeniający się podczas cyklu stabilnej arytmii z reentry.
Front fali obraca się zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół osobliwości fazowej na przedniej powierzchni serca. Repolaryzacja jest zaznaczona przezroczystym kolorem niebieskim, aby umożliwić wizualizację frontów fal na tylnej powierzchni. Serce zostało przeanalizowane przy użyciu systemu mapowania podwójnego, aby wykazać jednoczesne mapowanie potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian poziomu wapnia.
Zbliżenie na rejestracje z jednego miejsca pokazuje potencjały czynnościowe w kolorze niebieskim, a przejściowe zmiany stężenia wapnia w kolorze czerwonym. Przedstawiono zestaw przykładowych przebiegów z grupy równomiernie rozmieszczonych punktów, zaznaczonych kropkami na tym widoku przednim. Dane te zostały zebrane przy rozdzielczości optycznej wynoszącej 200 microns na 200 microns na piksel.
Implikacje tej terapii rozszerzają terapię defibrylacją w przypadku arytmii przedsionkowych i komorowych, ponieważ możemy bezpośrednio wizualizować efekt silnych impulsów elektrycznych podczas elektroterapii. Żadna alternatywna metoda nie jest w stanie tego zapewnić. Wykorzystując tę metodę, opracowaliśmy i zwalidowaliśmy nową, bezbolesną terapię defibrylacji niskonapięciowej w migotaniu przedsionków i tachykardii komorowej.
Przegląd
W niniejszym artykule opisano procedury przeprowadzania eksperymentów z mapowaniem optycznym w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania. Badanie koncentruje się na elektrofizjologicznych właściwościach serca, w tym na przewodnictwie i gospodarce wapniowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia serca
- Techniki mapowania optycznego
- Arytmogeneza
Wstęp
- Mapowanie optyczne umożliwia jednoczesną rejestrację potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia.
- Metoda ta pozwala na uzyskanie informacji na temat funkcji serca i arytmii.
- Tradycyjne metody mogą być ograniczone przez artefakty wynikające ze stymulacji elektrycznej.
- W badaniu wykorzystano model serca królika perfundowanego metodą Langendorffa.
Cel badania
- Badanie przewodnictwa serca, repolaryzacji oraz arytmogenezy.
- Analiza gospodarki wapniowej w mięśniu sercowym.
- Dostarczenie danych ilościowych na temat dynamiki pobudzenia i repolaryzacji.
Zastosowane metody
- Izolacja i perfuzja wsteczna serca królika.
- Barwienie mięśnia sercowego napięciowo-czułymi i fluorescencyjnymi wskaźnikami wapnia.
- Rejestracja optycznych potencjałów czynnościowych przy użyciu panoramicznego systemu mapowania optycznego.
- Symultaniczne podwójne obrazowanie optycznych potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia.
Główne wyniki
- Ilościowe dane dotyczące cech przestrzennych i czasowych mięśnia sercowego.
- Wnioski dotyczące mechanizmów arytmii i chorób serca.
- Wykazanie zalet mapowania optycznego w porównaniu do tradycyjnych elektrogramów.
Wnioski
- Mapowanie optyczne jest potężnym narzędziem do badania elektrofizjologii serca.
- Technika ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad arytmią.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę w celu głębszego zrozumienia funkcji serca.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mapowanie optyczne w sercach królików perfundowanych metodą Langendorffa umożliwia wysokorozdzielczą, wolną od artefaktów wizualizację elektrofizjologii serca, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów terapeutycznych arytmii. Podejście to dostarcza ilościowych danych przestrzenno-czasowych na temat potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia, co bezpośrednio wpływa na wiarygodność prognostyczną w przedklinicznych modelach arytmii komorowych i przedsionkowych. Metoda ta łączy biologię odkrywczą z badaniami translacyjnymi, umożliwiając powtarzalną i skalowalną ocenę potencjału proarytmicznego oraz odpowiedzi terapeutycznej w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie dynamiki fal reentry oraz osobliwości fazowych podczas indukowanych arytmii.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie funkcjonalnej walidacji celów terapeutycznych dzięki jednoczesnemu obrazowaniu napięcia i poziomu wapnia w celu zmniejszenia ryzyka związanego z mechanizmami sprzężenia wzbudzenia ze skurczem.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie selekcji projektów z portfolio poprzez kwantyfikację podatności podłoża arytmogennego w kontrolowanych warunkach perfuzji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowych fenotypów elektrofizjologicznych oraz gospodarki wapniowej.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje kwestie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki kontroli perfuzji w układzie Langendorffa oraz protokołom barwienia barwnikami.
- Skalowalność: Wskazuje na gotowość do przesiewania dzięki panoramicznym i podwójnym systemom obrazowania, które umożliwiają jednoczesną rejestrację optyczną z wielu miejsc.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Wykorzystanie modelu serca królika o wykazanym podobieństwie do ludzkiego sprzężenia wzbudzenie-skurcz oraz wzorców fal arytmii.
- Ciągłość translacyjna: Powiązanie wyników badań podstawowych z walidacją przedkliniczną poprzez ilościową analizę przewodzenia, repolaryzacji i gospodarki wapniowej podczas regularnego rytmu oraz arytmii.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wsparcie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wglądu w mechanizmy indukcji, utrzymywania i przerywania arytmii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków — od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną — umożliwiając iteracyjne udoskonalanie kandydatów na leki przeciwarytmiczne w oparciu o profile elektrofizjologiczne i gospodarkę wapniową.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wizualizację dynamiki rotora oraz zależności między przejściowymi zmianami poziomu wapnia a potencjałem czynnościowym podczas arytmogenezy.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu poprzez powtarzalną akwizycję sygnału optycznego z wystarczającym stosunkiem sygnału do szumu dla analizy przestrzenno-czasowej.
- Analityka: Wskazuje na ilościowe pomiary dynamiki pobudzenia i repolaryzacji, umożliwiając porównawczą ocenę warunków.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną poprzez modele arytmii istotne dla danej choroby oraz wgląd w gospodarkę wapniową istotny w niewydolności serca i chorobach metabolicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia system mapowania optycznego jako platformę wielokrotnego użytku do oceny wielu związków lub modyfikacji genetycznych w zestandaryzowanym preparacie perfundowanego serca.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w mechanizmach arytmii.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność pomiarów elektrofizjologicznych oraz przejściowych zmian stężenia wapnia.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne w późnych fazach programów sercowo-naczyniowych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na ilościowych danych dotyczących ryzyka wystąpienia arytmii.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji serca, perfuzji w układzie Langendorffa oraz pracy z barwnikami fluorescencyjnymi.
- Wymaga systemów mapowania optycznego z matrycami fotodiod lub kamerami CMOS, źródeł światła oraz kontroli ciśnienia perfuzji.
- Wymaga standaryzacji protokołów barwienia, rozsprzęgania pobudzenia i skurczu oraz parametrów akwizycji sygnału pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji szybkości przepływu, optyki i ładowania barwnika w zależności od gatunku przy rozszerzeniu badań poza serca królicze.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak fotowyblakanie barwnika, podatność na artefakty ruchowe oraz konieczność precyzyjnego utrzymywania temperatury i pH podczas eksperymentów.
