Wieloparametryczne mapowanie optyczne serca królika z perfuzją Langendorffa
13 września 2011
Ten artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika z perfuzją Langendorffa przy użyciu systemu obrazowania panoramicznego oraz metody obrazowania dualnego (napięcie i wapń).
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie właściwości elektrofizjologicznych serca, takich jak przewodzenie, repolaryzacja, arytmogeneza i obchodzenie się z wapniem, przy użyciu technik mapowania optycznego w sercu królika z perfuzją langora. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie i wsteczne perfuzję nienaruszonego serca królika przez aortę. Kolejnym etapem zabiegu jest odsłonięcie powierzchni serca, zniesienie skurczów serca, zastosowanie skurczu wzbudzenia na statynie Coler BLE oraz prawidłowe barwienie mięśnia sercowego za pomocą wskaźników fluorescencyjnych wrażliwych na napięcie i wapniowych.
Następnie wykonuje się zapisy optycznych potencjałów czynnościowych z dużej części nasierdzia komorowego za pomocą panoramicznego systemu mapowania optycznego. Sygnały optyczne są następnie odwzorowywane na zrekonstruowaną geometrię 3D powierzchni nasierdzia serca. Na tym etapie optyczny potencjał czynnościowy i stan nieustalony wapnia mogą być rejestrowane jednocześnie za pomocą niepanoramicznego systemu podwójnego obrazowania.
Procedura ta dostarcza danych ilościowych dotyczących przestrzennego i skroniowego mięśnia sercowego, pobudzenia i repolaryzacji, a także przystających cech obchodzenia się z wapniem, które można analizować podczas regularnego rytmu, a także arytmii przedsionkowej i komorowej. Cześć, nazywam się Dr.Iger Eov. Jestem profesorem inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis.
Technika optyczna, którą dziś prezentujemy, jest unikalną technologią, która ma szereg zalet w porównaniu z tradycyjnymi mikro i mikroelektrogramami, ponieważ jest w stanie rejestrować dziesiątki, dziesiątki tysięcy potencjałów czynnościowych i stanów nieustalonych wapnia jednocześnie. Co więcej, technologia ta jest odporna na artefakty prezentowane przez stymulację elektryczną i defibrylację, które silnie zniekształcają potencjały czynnościowe rejestrowane przez dowolne elektrogramy. Co więcej, stany przejściowe wapnia można było rejestrować tylko za pomocą tej techniki.
Po prostu nie ma alternatywy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu elektrofizjologii serca, takie jak mechanizmy indukcji, utrzymywania i zakończenia zagrażających życiu arytmii przedsionkowych i komorowych, a także modelowanie funkcji w sprzężeniu przewodzenia oraz wzbudzenia i budowy w chorobach takich jak wrodzona wada serca, choroba metaboliczna i niewydolność serca. Po przygotowaniu do operacji poddaj królika eutanazji koktajlem pentobarbitalu sodu i heparyny.
Gdy tylko królik nie zareaguje na odruch bólowy, otwórz klatkę piersiową i wytnij serce i płuca. Wykonaj nacięcie na górnym końcu aorty wstępującej, zanim wszystkie gałęzie łuku aorty włączą pompę, aby rozpocząć przepływ roztworu Tyro w nierecyrkulacyjnym systemie perfuzyjnym LRF. Szybko zamontuj serce do kaniuli aorty o rozmiarze 16 połączonej z systemem perfuzyjnym LOR.
Wypłucz powietrze z aorty i zawiąż kaniulę aorty po całkowitym perfuzji. Nie trać czasu na rozcinanie osierdzia. Następnie usuń tłuszcz tchawicy płuc otaczający serce i tkanki łączne.
Bardzo ważne jest, aby zapobiec gromadzeniu się płynu w lewej komorze, co mogłoby spowodować niedokrwienie. Włóż więc silikonową rurkę drenacyjną przez żyłę płucną i zastawkę mitralną do lewej komory. Teraz przenieś serce z kaniulą do recyrkulacyjnego systemu perfuzyjnego lang Andorf wyposażonego w optyczny system mapowania.
Umieść serce w specjalnie wykonanej sześciokątnej komorze i podłącz kaniulę do systemu perfuzyjnego. Monitoruj ciśnienie w aorcie za pomocą przetwornika ciśnienia i utrzymuj je na poziomie około 60 plus minus pięć milimetrów słupa rtęci, regulując natężenie przepływu pompy perfuzyjnej. Utrzymuj pH około 7,35 plus minus 0,05.
Wyłącz światło w pomieszczeniu i powoli wstrzyknij światłoczuły roztwór podstawowy statyn BLE przez otwór iniekcyjne w pułapce pęcherzyków powietrza znajdującej się nad kaniulą. Aby osiągnąć stężenie 10 mikromolowych BLEs, statyny powoli wstrzykuj 0,1 mililitra BLEs statyny. Przy każdym wstrzyknięciu w bolusie należy odczekać, aż ciśnienie się ustabilizuje, przed kolejnym wstrzyknięciem.
Ustaw matryce fotodiod lub PDA pod trzema równomiernie rozmieszczonymi kątami wokół serca. Następnie na każdym palmtopie skoncentruj obraz serca na matowym szkle płaszczyzny obrazu. Dostosuj położenie kaniuli w komorze sześciokątnej i każdego PDA, aż serce zmieści się w polu widzenia wszystkich trzech PDA.
Następnie zrób zdjęcie każdego wyostrzonego obrazu na matowym szkle. Powoli wstrzyknąć od 10 do 20 mikrolitrów roztworu podstawowego D four Anep do roztworu perfuzyjnego przez otwór iniekcyjne w pułapce pęcherzyków powietrza. I poczekaj trzy minuty.
Następnie delikatnie umieść elektrodę stymulującą w żądanym miejscu. Tutaj znajduje się w centrum przedniego widoku serca. Rozpocznij jednoczesne nagrywanie optyczne z urządzeń PDA.
Upewnij się, że w sygnale optycznym nie ma żadnych artefaktów ruchu i że stosunek sygnału do szumu jest wystarczający do późniejszej analizy danych. Po zakończeniu włącz światła w pomieszczeniu i zrób fotograficzny zapis serca, wykonując jedno zdjęcie na każde 10 stopni obrotu z kamery umieszczonej w miejscu, w którym znajduje się jeden z PDA. Następnie przystąp do czyszczenia systemu perfuzyjnego.
Umieść kaniulowane serce w niegrzecznej szklanej komorze i podłącz kaniulę do systemu perfuzyjnego. Przypnij serce do silikonowego dna komory na wierzchołku komory i przedsionkach. Aby unieruchomić serce, wyłącz światło w pomieszczeniu i powoli wstrzykuj statynę BLE przez port iniekcji, aby zmniejszyć ruch powierzchni roztworu.
Umieść szklaną osłonę okienną nad powierzchnią nasierdzia. Ta część procedury jest zwykle wykonywana w ciemności, ale jest wykonywana w świetle. Aby poprawić jakość obrazu, należy przesunąć podwójny system obrazowania na serce.
Teraz ustaw ostrość dwie kamery CMO na tym samym polu widzenia. Następnie ustaw światłowody dla dwóch lamp halogenowych z filtrem wzbudzenia. Zabarwić serce, dodając od 10 do 20 mikrolitrów barwnika wrażliwego na napięcie RH 2 37 przez port iniekcyjny.
Następnie dodaj 200 mikrolitrów drogi 2:00 AM z onic F1 27 w mieszaninie jeden do jednego przez port pułapek bąbelkowych. Odczekaj około 20 minut, aby umożliwić DS yfikację drogi o godzinie 2:00 przed rozpoczęciem mapowania. Teraz wykonaj nagranie testowe.
Wyłączyć pompę superfuzyjną, aby uniknąć ruchu na powierzchni roztworu. Włącz lampy halogenowe i wykonaj zapis optyczny z obu kamer. Następnie wyłącz lampkę wzbudzenia.
Włącz pompę superfuzyjną i sprawdź jakość sygnałów optycznych. Jeśli sygnał jest słaby, odciąż serce dodatkową RH 2 37 i drogą 2:00 AM. Jeśli występuje artefakt ruchu, dodaj dodatkowe statyny BLEs, aby usunąć ruch ze wszystkim w porządku. Kontynuuj zaplanowany eksperyment i oczyść system.
Po zakończeniu prac wykorzystano panoramiczny system mapowania optycznego, aby pokazać ten przedni widok serca królika z perfuzją Lang Endorf. Dla porównania, rekonstrukcja geometrii serca pokazuje ten sam widok przedni. Pokazana tutaj nieopakowana powierzchnia nasierdzia jest oznaczona kolorem według fazy.
Serce przechodziło epizod lepkiej arytmii z pięciu miejsc wokół wirnika. Przedstawiono optyczne potencjały czynnościowe. Tutaj na czerwono znajduje się czoło fali aktywacyjnej rozchodzące się podczas cyklu stabilnej arytmii reran.
Czoło fali obraca się zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół osobliwości fazowej na przedniej powierzchni serca. Repolaryzacja odbywa się w kolorze przezroczystym niebieskim, aby umożliwić wizualizację frontów fal na tylnej powierzchni. Serce analizowano przy użyciu systemu podwójnego mapowania, aby pokazać jednoczesne mapowanie potencjałów czynnościowych i stanów przejściowych wapnia.
Zbliżenie nagrań z jednego miejsca pokazuje, że potencjały czynnościowe są zaznaczone na niebiesko, a przejściowe na czerwono. Pokazano szereg śladów próbek z szeregu równomiernie rozmieszczonych miejsc, jak pokazano za pomocą kropek w tym widoku z przodu. Dane te zostały zebrane w rozdzielczości optycznej 200 mikronów na 200 mikronów na piksel.
Implikacje terapii rozszerzają terapię defibrylacyjną w przypadku przedsionkowych i komorowych zaburzeń rytmu serca 10 K, ponieważ możemy bezpośrednio uwidocznić efekt silnych bodźców elektrycznych podczas elektroterapii. Żadna alternatywna metoda nie jest w stanie tego zrobić. Korzystając z tej metody, opracowujemy i walidujemy nową, bezbolesną terapię deflacyjną niskiego napięcia w migotaniu przedsionków i częstoskurczu komorowym.
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedury przeprowadzania eksperymentów z mapowaniem optycznym w sercu królika perfundowanym zgodnie z metodą Langendorffa przy użyciu panoramicznego systemu obrazowania. Badanie koncentruje się na właściwościach elektrofizjologicznych serca, w tym przewodzeniu i obsłudze wapnia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia serca
- Techniki mapowania optycznego
- Arytmogeneza
Tło
- Mapowanie optyczne pozwala na jednoczesne rejestrowanie potencjałów czynnościowych i przejściowych stężeń wapnia.
- Ta metoda zapewnia wgląd w funkcjonowanie serca i arytmie.
- Tradycyjne metody mogą być ograniczone przez artefakty pochodzące od stymulacji elektrycznej.
- Badanie wykorzystuje model królika serca perfundowanego zgodnie z metodą Langendorffa.
Cel badania
- Zbadanie przewodzenia sercowego, repolaryzacji i arytmogelazy.
- Analiza obsługi wapnia w mięśniu sercowym.
- Dostarczenie ilościowych danych na temat dynamiki wzbudzenia i repolaryzacji.
Stosowane metody
- Izolacja i perfuzyjna perfuzyjna wstecznie serca królika.
- Barwienie mięśnia sercowego za pomocą napięcioczułych i wapniowych wskaźników fluorescencyjnych.
- Rejestrowanie optycznych potencjałów czynnościowych za pomocą panoramicznego systemu mapowania optycznego.
- Jednoczesne podwójne obrazowanie optycznych potencjałów czynnościowych i przejściowych stężeń wapnia.
Główne wyniki
- Ilościowe dane dotyczące przestrzennych i czasowych charakterystyk mięśnia sercowego.
- Wgląd w mechanizmy arytmii i chorób serca.
- Wykazanie zalet mapowania optycznego nad tradycyjnymi elektrogramami.
Wnioski
- Mapowanie optyczne jest potężnym narzędziem do badania elektrofizjologii serca.
- Ta technika może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad arytmią.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do głębszego wglądu w funkcjonowanie serca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Optical mapping in Langendorff-perfused rabbit hearts enables high-resolution, artifact-free visualization of cardiac electrophysiology, supporting mechanistic de-risking in arrhythmia target validation. This approach provides quantitative spatial-temporal data on action potentials and calcium transients, directly informing predictive confidence in preclinical models of ventricular and atrial arrhythmias. The method bridges discovery biology and translational research by enabling reproducible, scalable assessment of pro-arrhythmic liability and therapeutic response in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping reentrant wave dynamics and phase singularities during induced arrhythmias.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous voltage and calcium imaging to de-risk excitation-contraction coupling mechanisms.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying arrhythmogenic substrate vulnerability under controlled perfusion conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline electrophysiological and calcium handling phenotypes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through Langendorff perfusion control and dye-staining protocols.
- Scalability: Highlights screening readiness via panoramic and dual imaging systems capable of simultaneous multi-site optical recording.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses rabbit heart model with demonstrated similarity to human excitation-contraction coupling and arrhythmia wave patterns.
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through quantitative analysis of conduction, repolarization, and calcium handling during regular rhythm and arrhythmia.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing mechanistic insights into arrhythmia induction, maintenance, and termination.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment, enabling iterative refinement of antiarrhythmic candidates based on electrophysiological and calcium handling profiles.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing rotor dynamics and action potential calcium transient relationships during arrhythmogenesis.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible optical signal acquisition with sufficient signal-to-noise ratio for spatial-temporal analysis.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of excitation and repolarization dynamics, enabling comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via disease-relevant arrhythmia models and calcium handling insights relevant to heart failure and metabolic disease.
- Enterprise Reuse: Frames the optical mapping system as a reusable platform for assessing multiple compounds or genetic modifications in a standardized perfused heart preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in arrhythmia mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of electrophysiological and calcium transient measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative arrhythmia liability data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac isolation, Langendorff perfusion, and fluorescent dye handling.
- Needs optical mapping systems with photo diode arrays or CMOS cameras, light sources, and perfusion pressure control.
- Demands cross-team standardization of staining protocols, excitation-contraction uncoupling, and signal acquisition parameters.
- Involves adaptation considerations for species-specific flow rates, optics, and dye loading when extending beyond rabbit hearts.
- Includes practical limitations such as dye photobleaching, motion artifact susceptibility, and the need for precise temperature and pH maintenance during experiments.
