Name: Stężenie metabolitów ze zbiorowisk planktonowych o niskiej gęstości w metabolomice środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji metabolitów ze zbiorowisk planktonowych przy użyciu spektroskopii NMR. Technika filtracji i liofilizacji umożliwia analizę profili metabolicznych mikroorganizmów w metabolomice środowiskowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były częściowo wspierane przez granty na badania naukowe w ramach ambitnych badań eksploracyjnych (J.K.) oraz badań naukowych (A) (J.K. i S.M.) przyznane przez Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii. Dodatkowe wsparcie zapewniło stypendium RIKEN FPR (R.C.E.). Autorzy wyrażają wdzięczność dr. Eisuke Chikayamie, dr Yasuyo Sekiyamie i dr Mami Okamoto za pomoc techniczną przy analizach NMR i analizach statystycznych.

1. Przygotowanie filtra w celu usunięcia substancji wymywalnych
<ol>
 <li>Należy użyć hydrofilowych filtrów Durapore PVDF o średnicy 25 mm i wielkości porów 0,22 μm (Millipore). Filtry należy umieścić za pomocą pęsety w czystym zlewce Pyrex o pojemności 500 ml. Trzy razy przepłukać wodą destylowaną. Podczas płukania należy energicznie mieszać zawartość, aby zapobiec przywieraniu filtrów do siebie. Dodać 300 ml wody Milli-Q (Millipore) lub równoważnej wody wysokiej jakości. Autoklawować w celu zapewnienia całkowitego usunięcia substancji ekstrahowalnych z filtrów.</li>
 <li>Odlać wodę Milli-Q i ponownie trzykrotnie przepłukać filtry, tym razem wodą Milli-Q. Za pomocą pęsety umieścić poszczególne filtry na czystej, suchej powierzchni (np. folii aluminiowej) i suszyć w odpowiedniej temperaturze (np. 37 °C) lub pozostawić do wyschnięcia w powietrzu. Filtry są teraz gotowe do użycia.</li>
</ol>
2. Filtracja materiału próbnego
<ol>
 <li>Do demonstracji tego protokołu wykorzystano kolektor filtracyjny Millipore ze stali nierdzewnej z 3 miejscami, kolumny filtracyjne do mikroanalizy o średnicy 25 mm z szklanymi podkładkami oraz pompę mechaniczną. Stosując technikę aseptyczną, umieść pojedynczy filtr 25 mm na podstawie kolumny filtracyjnej, nałóż kolumnę i zaciśnij zacisk.</li>
 <li>Nalej 15 ml próbki do kolumny, otwórz zawór odcinający w kolektorze filtracyjnym i włącz pompę. Filtruj pod niewielkim ciśnieniem, aby zminimalizować rozrywanie komórek (&lt;5 kPa). Do tego protokołu można dostosować inne pompy, np. ręczną lub perystaltyczną. W przypadku próbek o niższej gęstości konieczne może być sukcesywne dodawanie wody; nie dopuszczaj do wyschnięcia filtra przez dłuższy czas pomiędzy dodaniami wody.</li>
 <li>W przypadku próbek morskich, po przefiltrowaniu próbki można przeprowadzić opcjonalne płukanie wodą słodką w celu zmniejszenia ilości pozostałych jonów paramagnetycznych w próbce i na filtrze. Może to pomóc w bardziej precyzyjnym strojeniu magnesu spektrometru. Wystarczy delikatnie dodać niewielką objętość wody i przefiltrować ją przez zebraną próbkę na koniec.</li>
 <li>Po zakończeniu filtrowania wyłącz pompę i pozostaw zawór otwarty, aby pod filtrem utrzymywało się podciśnienie. Zdejmij zacisk i kolumnę filtracyjną.</li>
 <li>Jedną ręką, używając czystej pęsety, chwyć filtr. Złóż filtr na pół, uważając, aby go nie zagnieść. Drugą ręką, wykorzystując krawędź sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, dociśnij filtr. Puść pęsetę, a następnie użyj jej do ponownego uchwycenia obu krawędzi filtra. Chwyć krawędzie pod kątem 45 ° względem zgięcia.</li>
 <li>Włóż filtr do probówki 2 ml i puść go tak, aby otworzył się stroną z próbką do wewnątrz. W ten sposób w sterylnej probówce do mikrocentryfugi 2 ml można umieścić do dwóch filtrów. W przypadku stosowania dwóch filtrów należy zadbać o to, aby nachodziły na siebie w jak najmniejszym stopniu. Natychmiast zamroź (co najmniej -30 °C).</li>
</ol>
3. Ekstrakcja metabolitów rozpuszczalnych w wodzie
<ol>
 <li>Liofilizuj próbki przez noc lub przez co najmniej 10 godzin.</li>
 <li>Po liofilizacji do każdej probówki dodaj stalowy kruszywo (Tokken). Dodaj 750 μl standaryzowanego buforu NMR fosforanowego wtlenku deuteru (2H &gt; 90%) ze standardem 2,2-dimetylu-2-silapentanu-5-sulfonianem (DSS) (KPi; 38.3 mM KH2PO4, 61.7 mM K2HPO4, DSS 0.1 mM, pH 7.0, 90% D2O)2.</li>
 <li>Poddaj próbki sonikacji przez 5 minut w temperaturze 4 °C w sonikatorze wodnym (Bioruptor, Diagenode), aby usunąć materiał komórkowy z filtra. Wyjmij filtry za pomocą czystej pęsety.</li>
 <li>Rozbij komórki za pomocą kruszarki mechanicznej (1600 rpm) przez 5 minut.</li>
 <li>Inkubuj w temperaturze 65 °C przy wstrząsaniu (1400 rpm) na inkubatorze wytrząsowym (Eppendorf) przez 15 minut.</li>
 <li>Usuń metalowy element kruszący za pomocą czystej pęsety i odwiruj próbkę przy 13,000 g przez 5 minut.</li>
 <li>Przelej nadfiltr bezpośrednio do probówki NMR do spektroskopii NMR.</li>
</ol>
4. Spektroskopia NMR i analiza danych
<ol>
 <li>Wprowadź próbkę do spektrometru NMR (w tym przypadku spektrometru Bruker DRX-500 wyposażonego w sondę TXI z gradientem trójosiowym sterowanym przez komputer z oprogramowaniem XWIN-NMR).</li>
 <li>Uzyskaj widma 1D 1H NMR, korzystając z odpowiednich, wcześniej opublikowanych metod2,15 w interfejsie XWIN-NMR. W niniejszym badaniu widma 1H NMR rejestrowano na spektrometrze DRX-500 pracującym z częstotliwością 500,03 MHz w temperaturze 298 K. Sygnały resztkowej wody tłumiono za pomocą sekwencji impulsów Watergate z czasem repetycji 1,2 s. Zebrano 128 skanów, aby uzyskać 32 000 punktów danych na widmo.</li>
 <li>Przenieś katalogi danych NMR na komputer z zainstalowanym oprogramowaniem NMRPipe16. Przetwórz surowe dane, ustaw DSS jako referencję 0 ppm, a następnie ręcznie skoryguj fazę widm. Zdigitalizuj dane spektralne do zestawu wartości dyskretnych poprzez ich całkowanie lub „binowanie” za pomocą oprogramowania takiego jak rNMR, Automics lub korzystając z ogólnodostępnego pakietu FT2B ze strony internetowej ECOMICS (<a href="https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/</a>)3,17. W tym przykładzie widma całkowano w zakresie od 0,5 do 10,5 ppm w regionach całkowania o szerokości 0,032 ppm przy użyciu ECOMICS, a następnie znormalizowano je do DSS lub całkowitej intensywności sygnału. Wyeksportowane dane można teraz wykorzystać do dalszych analiz statystycznych, takich jak analiza głównych składowych (PCA), przy użyciu bezpłatnych pakietów oprogramowania, np. R18.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład widm 1H NMR uzyskanych za pomocą powyższych metod przedstawiono na Rysunku 1. Próbki te, pobrane w dwóch punktach czasowych z eksperymentu w mikrokosmosie, wykazują wyraźne różnice wynikające z aktywności metabolicznej glonów. Widmo z 4. dnia wykazuje znacznie większą liczbę sygnałów, szczególnie w zakresie 3-4 ppm, w porównaniu z próbką z 1. dnia. Sygnały te można przypisać cukrom produkowanym przez kwitnące okrzemki wewnątrz mikrokosmosu. W podobnym eksperymencie porównującym wzrost naturalnych społeczności planktonowych w sztucznej lub naturalnej wodzie morskiej, podejścia statystyczne, takie jak wykres wyników analizy głównych składowych (PCA) wyprowadzony z binned NMR spectra, mogą być wykorzystane do wykazania wyraźnych różnic metabolicznych między dwiema grupami traktowania (Rys. 2), podczas gdy wykresy ładunków (loading plots) pozwalają zidentyfikować sygnały w widmach, które kształtują rozkład danych. Takie wyniki można porównać z danymi z innych poziomów omicznych, np. z metod genomicznego fingerprintingu (Rys. 3). Poszczególne sygnały NMR można sprawdzać indywidualnie (np. w BMRB; <a href="http://www.bmrb.wisc.edu/">http://www.bmrb.wisc.edu/</a>)19, natomiast całe widma można analizować statystycznie (np. za pomocą SpinAssign w <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search</a>)2. W tym przykładzie różnice między grupami wynikały z obfitości sygnałów w obszarze cukrów (3,39 ppm do 4,04 ppm) w widmach metabolitów naturalnej społeczności planktonowej, a kilka sygnałów charakterystycznych dla społeczności z sztucznej wody morskiej zostało wstępnie zidentyfikowane jako mleczan i mrówczan przy użyciu programu SpinAssign.
<img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig1.jpg" alt="Widma NMR wykazujące zmiany przesunięć chemicznych w ciągu 4 dni; metoda analizy przesunięcia protonów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywne widma 1H NMR uzyskane z próbek przetworzonych zgodnie z opisaną procedurą. Próbki z mikrokosmosów pobrano przed (dzień 1) i w trakcie (dzień 4) intensywnego zakwitu okrzemek. Eksperymenty NMR przeprowadzono na aparacie Bruker DRX-500, a sygnały znormalizowano do wysokości piku standardu wewnętrznego (DSS; 0 ppm).
<img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig2.jpg" alt="Wykres analizy głównych składowych; rozkład danych PC1 vs PC2; analiza statystyczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wykres wyników analizy głównych składowych (PCA) dla pogrupowanych widm NMR metabolomów pochodzenia naturalnego z mikrobiologicznych społeczności planktonicznych hodowanych w mikrokosmosach z naturalną (otwarte romby) lub sztuczną (czarne kropki) wodą morską. Na wykresie rozrzutu można zaobserwować wyraźne różnice metaboliczne. Wykres ładunków z takiej analizy może być następnie wykorzystany do zidentyfikowania istotnych, charakterystycznych pików w systemie; piki te mogą być w razie potrzeby analizowane dalej.
<img src="/files/ftp_upload/3163/3163fig3.jpg" alt="Wykres analizy głównych składowych; porównanie danych eukariotów i bakterii; wykres rozrzutu PC1 vs PC2." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przykład analizy multiomicznej łączącej NMR z danymi genomicznymi. Skład zbiorowisk oparty na elektroforezie w żelu z gradientem denaturującym genów rRNA 18S (lewo) i 16S (prawo) z tych samych próbek, które analizowano na Rysunku 2, wykazuje również wyraźne różnice w strukturze zbiorowisk mikrobiologicznych pomiędzy naturalnymi (otwarte romby) a sztucznymi (czarne koła) mikrokosmosami wody morskiej. Taka zgodność między metabolomem a genomem w systemach naturalnych wykazuje użyteczność tego podejścia.

<ol><li>Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+metabolomics%3A+a+critical+review+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives.</a> Metabolomics. 5, 3-21 (2008).</li>
<li>Chikayama, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+indices+for+simultaneous+large-scale+metabolite+detections+for+a+single+NMR+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum.</a> Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).</li>
<li>Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rNMR%3A+open+source+software+for+identifying+and+quantifying+metabolites+in+NMR+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Chem%22%5BJournal%5D)">rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra.</a> Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+gut+microbes+modulate+human+metabolic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).</li>
<li>Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+exploration+of+metabolic+and+genomic+diversity+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice.</a> BMC Genomics. 10, 568(2009).</li>
<li>Fukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacteria+can+protect+from+enteropathogenic+infection+through+production+of+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate.</a> Nature. 469, 543-547 (2011).</li>
<li>Kikuchi, J., Hirayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+stable+isotope+labeling+of+higher+plants+for+a+hetero-nuclear+multi-dimensional+NMR-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics.</a> Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).</li>
<li>Martin, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+top-down+systems+biology+view+of+microbiome-mammalian+metabolic+interactions+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model.</a> Mol. Syst. Biol. 3, 112(2007).</li>
<li>Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+approach+to+lipid+profiling+of+mycobacteria+using+2D+HSQC+NMR+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps.</a> J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).</li>
<li>Fukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+characterization+of+bacterial+metabolic+dynamics+with+a+novel+profiling+technique%2C+real-time+metabolotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping.</a> PloS ONE. 4, e4893(2009).</li>
<li>Date, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+monitoring+approach+for+metabolic+dynamics+in+microbial+ecosystems+using+stable-isotope-labeling+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies.</a> J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).</li>
<li>Nakanishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+omics+approach+identifies+nutrition-mediated+microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions.</a> J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).</li>
<li>Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogeochemical+controls+and+feedbacks+on+ocean+primary+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production.</a> Science. 281, 200-207 (1998).</li>
<li>Viant, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+aquatic+organisms%3A+the+new+%27omics%27+on+the+block%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Ecol.+Prog.+Ser%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of aquatic organisms: the new 'omics' on the block.</a> Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).</li>
<li>Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+semipolar+solvent+system+as+a+step+toward+heteronuclear+multidimensional+NMR-based+metabolomics+for+13C-labeled+bacteria%2C+plants%2C+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals.</a> Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).</li>
<li>Delaglio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMRPipe%3A+A+multidimensional+spectral+processing+system+based+on+UNIX+pipes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes.</a> J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automics%3A+an+integrated+platform+for+NMR-based+metabonomics+spectral+processing+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis.</a> BMC Bioinformatics. 10, 83(2009).</li>
<li>The R Project for Statistical Computing. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> (2010).</li>
<li>Eldon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioMagResBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BioMagResBank.</a> Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).</li>
<li>Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+polar+and+semipolar+plant+metabolites+throughout+extraction+processes+using+a+combined+solution-state+and+high-resolution+magic+angle+spinning+NMR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach.</a> Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda filtracji i ekstrakcji metabolitów pozwala na zgromadzenie biomasy planktonicznej mikroorganizmów w ilości wystarczającej do analizy metabolomicznej NMR. Choć zaprezentowano jedynie ekstrakcję metabolitów rozpuszczalnych w wodzie przy użyciu KPi oraz 1D 1H NMR, możliwe jest zastosowanie innych rozpuszczalników ekstrakcyjnych i podejść spektroskopowych. Przydatnym przykładem jest użycie deuterowanego metanolu jako rozpuszczalnika półpolarnego, który – jak wykazano – pozwala na uzyskan...

<table><tbody><tr><td>Hydrofilowe filtry Durapore PVDF 0,22 &amp;mu;m, 25 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>GVWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do filtrów do mikroanaliz, 25 mm, z podkładką ze spiekanego szkła</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002500</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor 3-miejscowy, 47 mm, ze stali nierdzewnej</td><td>EMD Millipore</td><td>XX2504735</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek deuteru, &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H &amp;gt; 90%</td><td>Campridge Isotope Laboratoties</td><td>DLM-4</td><td></td></tr><tr><td>DSS</td><td>Fluka</td><td>92754</td><td></td></tr><tr><td>Automill</td><td>Tokken</td><td>TK-AM4</td><td>W zestawie kruszarki ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Odparowarka próżniowa</td><td>EYELA</td><td>CVE-3100</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td>Bruker Corporation</td><td>DRX-500 z sondą 5 mm-TXI</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do binningu widma</td><td>Własne opracowanie</td><td>FT2DB</td><td>&lt;a href=&quot;https://database.riken.jp/ecomics/">https://database.riken.jp/ecomics/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Narzędzie do adnotacji i baza danych metabolitów</td><td>Własne opracowanie</td><td>SpinAssign</td><td>&lt;a href=&quot;http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search">http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

koncentracja metabolitów z planktonicznych zbiorowisk o niskiej gęstości do metabolomiki środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Metabolomika środowiskowa to rozwijająca się dziedzina, która pozwala na nowe zrozumienie sposobów, w jakie organizmy reagują i oddziałują ze środowiskiem oraz ze sobą nawzajem na poziomie biochemicznym1. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest jedną z kilku technologii, obok chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas (GC-MS), wykazującą znaczny potencjał w tego typu badaniach. Zaletą NMR jest jego przydatność do analiz nietargetowanych, dostarczanie informacji strukturalnych oraz możliwość ilościowego i statystycznego analizowania widm w oparciu o niedawno udostępnione bazy danych widm poszczególnych metabolitów2,3. Ponadto dane spektralne NMR można łączyć z danymi z innych poziomów omicznych (np. transkryptomiki, genomiki), aby uzyskać bardziej kompleksowe zrozumienie odpowiedzi fizjologicznych taksonów na oddziaływania między nimi oraz ze środowiskiem4,5,6. Jednak NMR jest mniej czuły niż inne techniki metabolomiczne, co utrudnia jego zastosowanie w naturalnych układach mikrobiologicznych, w których populacje próbek mogą być rzadkie, a stężenia metabolitów niskie w porównaniu do metabolitów pochodzących z dobrze zdefiniowanych i łatwo ekstrahowalnych źródeł, takich jak całe tkanki, płyny ustrojowe czy hodowle komórkowe. W konsekwencji nieliczne przeprowadzone do tej pory bezpośrednie badania metabolomiczne mikroorganizmów środowiskowych ograniczały się do ekosystemów opartych na hodowlach lub łatwo zdefiniowanych układów o wysokiej gęstości, takich jak systemy gospodarz-symbiont, skonstruowane kokultury lub manipulacje środowiskiem jelitowym, gdzie dodatkowo można zastosować znakowanie izotopami stabilnymi w celu wzmocnienia sygnałów NMR7,8,9,10,11,12. Brakuje metod ułatwiających zagęszczanie i gromadzenie metabolitów środowiskowych do stężeń odpowiednich dla NMR. Ponieważ w ostatnim czasie zwrócono uwagę na metabolomikę środowiskową organizmów w środowisku wodnym, gdzie znaczna część przepływu energii i materii jest mediowana przez społeczność planktonową13,14, opracowaliśmy metodę zagęszczania i ekstrakcji metabolitów całej społeczności z planktonicznych układów mikrobiologicznych poprzez filtrację. Komercyjnie dostępne hydrofilowe filtry z poli-1,1-difluoroetylenu (PVDF) są specjalnie traktowane w celu całkowitego usunięcia substancji ekstrahowalnych, które w przeciwnym razie mogłyby pojawić się jako zanieczyszczenia w późniejszych analizach. Przetraktowane filtry są następnie wykorzystywane do filtrowania badanych próbek środowiskowych lub eksperymentalnych. Filtry zawierające wilgotny materiał próbkowy są liofilizowane, a metabolity rozpuszczalne w wodzie są ekstrahowane bezpośrednio do konwencjonalnej spektroskopii NMR przy użyciu zestandaryzowanego buforu ekstrakcyjnego fosforanu potasu2. Dane uzyskane za pomocą tych metod mogą być analizowane statystycznie w celu zidentyfikowania istotnych wzorców lub integrowane z innymi poziomami omicznymi dla kompleksowego zrozumienia funkcjonowania społeczności i ekosystemu.

Przedstawiono metodę ekstrakcji metabolitów z planktonicznych społeczności drobnoustrojów. Pobieranie próbek całej społeczności realizowane jest poprzez filtrację na specjalnie przygotowanych filtrach. Po liofilizacji ekstrahowane są metabolity rozpuszczalne w wodzie. Podejście to umożliwia zastosowanie metabolomiki środowiskowej w badaniach trans-omicznych naturalnych lub eksperymentalnych społeczności drobnoustrojów.

Koncentracja metabolitów z planktonicznych zbiorowisk o niskiej gęstości do metabolomiki środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Metabolomika środowiskowa to rozwijająca się dziedzina, która przyczynia się do nowego zrozumienia sposobów, w jakie organizmy reagują na środowisko i wchodzą z nim w interakcje, a także z każdym...

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego oferuje kilka istotnych zalet w badaniach nad metabolomiką środowiskową, jednak w tej procedurze charakteryzuje się stosunkowo niską czułością. Przedstawiono metodę filtracji służącą do zagęszczania i ekstrakcji metabolitów całej społeczności z układów planktonicznych, odpowiednią do analiz NMR. Jest to osiągane poprzez uprzednie specjalne przygotowanie filtrów do poboru próbek poprzez usunięcie substancji ekstrahowalnych.Drugim krokiem procedury jest filtrowanie próbki, naturalnej lub eksperymentalnej, na filtrach. Trzecim krokiem procedury jest liofilizacja materiału próbki i ekstrakcja metabolitów. Ostatnim krokiem procedury jest analiza próbek przy użyciu spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego i odpowiednia integracja danych.Ostatecznie, dzięki zastosowaniu metabolomiki i podejścia transams, można uzyskać wyniki obrazujące zmiany metaboliczne w próbkach naturalnych wzdłuż gradientów środowiskowych lub w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie, jest możliwość pobrania próbek z całej społeczności oraz możliwość zastosowania większych objętości próbek w przypadku materiałów o niskiej gęstości. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad środowiskowymi mieszaninami metali, na przykład w kwestii tego, jak wzrost mikroorganizmów reaguje na zmiany środowiskowe. Procedura zostanie zaprezentowana na przykładach z mojego laboratorium.Rozpocznij procedurę od umieszczenia pęsetą filtrów w czystym 500 mililitrowym naczyniu Pyrex. Zalej filtry wodą destylowaną, aby je wstępnie wypłukać, i energicznie zamieszaj, zapobiegając sklejaniu się filtrów. Odlej wodę i powtórz płukanie dwukrotnie.Po ostatnim płukaniu do zlewki należy dodać 300 mililitrów wody Milli Q i wysterylizować filtry w autoklawie. Po autoklawowaniu filtrów należy odlać wodę Milli Q i trzykrotnie przepłukać filtry w ten sam sposób co wcześniej, lecz z zastosowaniem wody Milli Q.Za pomocą pęsety umieść poszczególne filtry na czystej, suchej powierzchni, np. na folii aluminiowej, a następnie wysusz w odpowiedniej temperaturze. Na przykład w 37 °C lub poprzez suszenie na powietrzu; filtry są teraz gotowe do użycia w celu zademonstrowania tego protokołu. Z zastosowaniem technik aseptycznych wykorzystuje się trzystanowiskowy stalowy kolektor filtracyjny Millipore, wyposażony w 25 mm kolumny filtracyjne do mikroanalizy z szklanymi podkładkami oraz pompę mechaniczną.Umieść pojedynczy filtr o średnicy 25 milimetrów na podstawie kolumny filtrującej. Nałóż kolumnę i zaciśnij aparat za pomocą zacisku. Nałóż na kolumnę 15 mililitrów próbki uzyskanej z mikrokosmosu o wysokiej zawartości składników odżywczych.Otwórz zawór odcinający w kolektorze filtracyjnym i włącz pompę filtrującą pod niewielkim ciśnieniem, aby zminimalizować rozrywanie komórek. W przypadku próbek o niższej gęstości może być konieczne sukcesywne dodawanie wody. Należy zadbać o to, aby filtr nie pozostawał suchy przez dłuższy czas pomiędzy poszczególnymi dodaniami wody.Następnie można przeprowadzić redukcję pozostałych soli paramagnetycznych z próbek morskich oraz opcjonalne płukanie wodą słodką. Po zakończeniu filtrowania należy wyłączyć pompę i pozostawić zawór otwarty, aby pod filtrem nadal utrzymywało się podciśnienie. Jedną ręką należy zdjąć zacisk i wyjąć kolumnę filtrującą.Używając czystej pęsety, chwyć filtr. Złóż filtr na pół, uważając, aby go nie zagnieść drugą ręką. Wykorzystaj krawędź sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, aby przytrzymać filtr.Umieść filtr w probówce o pojemności dwóch mililitrów i zwolnij go tak, aby otworzył się stroną z próbką do wnętrza. Natychmiast zamroź w ciekłym azocie, aby wyekstrahować rozpuszczalne metabolity wodne. Najpierw liofilizuj próbki przez noc lub przez co najmniej 10 godzin; po liofilizacji dodaj do każdej probówki stalowy kruszywo.Dodaj 750 µL zestandaryzowanego buforu fosforanowego potasu oraz tlenku deuteru ze standardem DSS. Próbki poddaj sonikacji przez pięć minut w temperaturze 4 °C w kąpieli sonikacyjnej, aby usunąć materiał komórkowy z filtra. Usuń filtry za pomocą czystej pęsety.Rozbić komórki za pomocą kruszarki kulowej przy 1600 RPM przez pięć minut. Następnie inkubować w temperaturze 65 °C. Całość wstrząsać na wstrząsarce laboratoryjnej przez 15 minut.Po inkubacji wyjmij metalowy kruszył za pomocą czystej pęsety. Odwiruj próbkę przy 13 000 G przez pięć minut. Po wirowaniu pobierz nadsącz i przelej go bezpośrednio do probówki NMR w celu przeprowadzenia spektroskopii NMR.W tym miejscu wprowadź próbkę do spektrometru NMR. Próbki są analizowane na spektrometrze Bruker DRX 500 wyposażonym w sondę TXI z gradientem trójosiowym, pracującym w temperaturze 298 Kelvin. Wykonaj blokadę pola (lock), strojenie (tune) oraz shimowanie magnesu.Należy uzyskać jednowymiarowe widma NMR protonowego (1D proton NMR), korzystając z interfejsu TopSpin i wcześniej opisanych metod lub z innego oprogramowania interfejsu spektrometru, zależnie od potrzeb. W niniejszym przypadku widma pozyskano z tłumieniem sygnałów resztkowej wody za pomocą sekwencji impulsów Watergate, przy czasie repetycji wynoszącym 1,2 sekundy. W obecnym przykładzie dla każdej próbki zebrano 128 sygnałów (transients).Przenieś katalogi z danymi NMR na komputer osobisty z zainstalowanym oprogramowaniem NMR pipe. Przetwórz surowe dane, ustaw sygnał DSS jako punkt odniesienia 0 PPM, a następnie ręcznie przeprowadź korekcję fazową widm. Przeprowadź digitalizację danych widmowych poprzez binowanie, korzystając z ogólnodostępnego pakietu FT two B ze strony internetowej eCommerce.Do analizy bin.Bin. można wykorzystać również inne programy użytkowe, takie jak RNMR lub Atomics. Dane można znormalizować względem sygnału całkowitego lub sygnału DSS, aby przedstawić proporcjonalne zmiany sygnału między próbkami. Uzyskane dane mogą teraz posłużyć do dalszych analiz statystycznych, takich jak analiza głównych składowych (PCA) z wykorzystaniem bezpłatnych pakietów oprogramowania, na przykład programu R.Oto przykład widm protonowego NMR uzyskanych przy użyciu zaprezentowanej procedury. Widma pochodzą z dwóch punktów czasowych eksperymentu w mikrokosmosie i wykazują wyraźne różnice wynikające z aktywności metabolicznej alg. Widmo z czwartego dnia wykazuje znacznie większą liczbę pików, szczególnie w zakresie od 3 do 4 ppm, w porównaniu z próbką z pierwszego dnia.Piki te można przypisać cukrom produkowanym przez kwitnące okrzemki wewnątrz mikrokosmosu. W podobnym eksperymencie wykorzystano wykres wyników PCA wygenerowany w programie Mr.Spectra, przedstawiający dwie pierwsze składowe główne, aby porównać wzrost naturalnych społeczności planktonowych w sztucznej i naturalnej wodzie morskiej. To podejście statystyczne redukuje dane wielowymiarowe do prostszego formatu – w tym przypadku dwuwymiarowego – i pozwala w prosty sposób ujawnić strukturę w analizowanych punktach danych.Każda z osi lub obie osie są tutaj bardziej zbliżone. Widoczne są wyraźne różnice metaboliczne między dwiema grupami traktowania. Dane z tego eksperymentu zostały wykorzystane do przeprowadzenia analizy multiomowej.Połączenie NMR z danymi genomicznymi dotyczącymi składu społeczności, opartymi na elektroforezie w żelu z gradientem denaturującym genów 18 S oraz 16 S-R-R-N-A, wykazuje również wyraźne wzorce społeczności mikroorganizmów pomiędzy mikrokosmami naturalnej i sztucznej wody morskiej. Taka zgodność między metabolomem a genomem w systemach naturalnych wykazuje przydatność tego podejścia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu odpowiedniej techniki w celu zminimalizowania kontaminacji po przeprowadzeniu tej procedury.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób, w jaki mikrobiom koreluje z określonymi metabolitami, można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza korelacyjna na poziomach omicznych.

concentration-metabolites-from-low-density-planktonic-communities-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Stężenie metabolitów z planktonowych społeczności o niskiej gęstości dla metabolomiki środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii rezonansowej magnetycznej jąder

Opisano procedurę progresywnej kolonizacji w celu dalszej oceny jej wpływu na metabolizm wątroby gospodarza. Kolonizację monitoruje się nieinwazyjnie poprzez ocenę wydalania z moczem mikrobiologicznych ko-metabolitów za pomocą profilowania metabolicznego opartego na NMR, natomiast metabolizm wątrobowy ocenia się za pomocą profilowania NMR w technice High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) nienaruszonych próbek biopsji.

Ocena zmian metabolicznych w wątrobie podczas postępującej kolonizacji myszy wolnych od mikroorganizmów za pomocą spektroskopii 1H NMR

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Tutaj spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) o wysokiej rozdzielczości 1H i 13C została użyta jako szybkie i niezawodne narzędzie do ilościowej i jakościowej analizy kapsułkowanych suplementów oleju rybnego.

Spektroskopia NMR jako solidne narzędzie do szybkiej oceny profilu lipidowego suplementów oleju rybnego

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Ten artykuł przedstawia zastosowanie PSYCHE i SAPPHIRE-PSYCHE w profilowaniu metabolicznym roślin i zawiera szczegółowe procedury przygotowania próbek i optymalnego zapisu widm NMR Pure Shift. Omówiono przykłady, dzięki którym przyrost rozdzielczości osiągnięty przez rozprzęganie homojądrowe pozwala na pełniejsze zrozumienie systemu.

Magnetyczny rezonans jądrowy z czystym przesunięciem: nowe narzędzie do metabolomiki roślin

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) służy do wykrywania dysregulacji metabolitów u pacjentów z różnymi chorobami. Technika ta pozwala na ilościowe określenie zaburzonych metabolitów, odkrywając patofizjologiczne wglądy. W tym miejscu opisujemy krok po kroku procedurę podejścia opartego na NMR w celu charakterystyki metabolicznej pacjentów.

Identyfikacja i kwantyfikacja metabolitów zaburzonych u pacjentów w stanie krytycznym przy użyciu metabolomiki opartej na NMR

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Poznaj metodę ekstrakcji metabolitów ze zbiorowisk planktonowych przy użyciu spektroskopii NMR. Technika filtracji i liofilizacji umożliwia analizę profili metabolicznych mikroorganizmów w metabolomice środowiskowej.

Stężenie metabolitów ze zbiorowisk planktonowych o niskiej gęstości w metabolomice środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Wideo) | JoVE Journal

Koncentracja metabolitów z planktonicznych zbiorowisk o niskiej gęstości do metabolomiki środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Przeglądaj więcej filmów