Stężenie metabolitów ze zbiorowisk planktonowych o niskiej gęstości w metabolomice środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Przedstawiono metodę ekstrakcji metabolitów z mikrobiologicznych zbiorowisk planktonowych. Pobieranie próbek z całej społeczności odbywa się poprzez filtrację do specjalnie przygotowanych filtrów. Po liofilizacji ekstrahuje się metabolity rozpuszczalne w wodzie. Podejście to pozwala na zastosowanie metabolomiki środowiskowej do badań transomicznych naturalnych lub eksperymentalnych zbiorowisk drobnoustrojów.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego oferuje kilka wyraźnych zalet w badaniach metabolomiki środowiskowej, ale jest stosunkowo niewrażliwa w tej procedurze. Podano metodę filtracji służącą do zagęszczania i ekstrakcji metabolitów w całej społeczności z systemów platońskich odpowiednich dla NMR. Osiąga się to poprzez uprzednie specjalne przygotowanie filtrów do pobierania próbek poprzez usunięcie substancji ekstrahowalnych.

Drugim etapem procedury jest przefiltrowanie próbki, naturalnej lub eksperymentalnej na filtry. Trzecim etapem procedury jest życiodajna zawartość materiału próbki i ekstrakcja metabolitów. Ostatnim etapem procedury jest analiza próbek za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego i integracja danych w razie potrzeby.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmiany metaboliczne w naturalnych próbkach w gradientach środowiskowych lub w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne za pomocą metabolomiki i transamów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie, jest to, że można pobrać próbki z całej społeczności, a w przypadku próbek o małej gęstości możliwe są większe objętości próbek. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie środowiskowej mieszanki metali, takie jak to, w jaki sposób mikrowzrost reaguje na zmiany środowiskowe, Demonstracja procedury będzie etapem i z mojego laboratorium.

Rozpocznij ten protokół, umieszczając filtry w czystym 500-mililitrowym głośniku Pyrex za pomocą pęsety. Przykryj filtr wodą destylowaną, aby wstępnie wypłukać, dobrze zawiruj, aby zapobiec sklejaniu się filtrów. Odlej wodę i powtórz płukanie dwukrotnie.

Po ostatnim płukaniu dodaj 300 mililitrów wody Milli Q do zlewki i przelej filtry w autoklawie. Po autoklawowaniu filtrów. Odlej wodę milli Q i trzykrotnie wypłucz filtry jak poprzednio, z wyjątkiem użycia wody Milli Q.

Umieść poszczególne filtry na czystej, suchej powierzchni, takiej jak folia aluminiowa, za pomocą pęsety wysusz w rozsądnej temperaturze. Na przykład, w temperaturze 37 stopni lub suchym powietrzu, filtry są teraz gotowe do użycia w celu zademonstrowania tego protokołu. Trzymiejscowy kolektor filtracyjny ze stali nierdzewnej miliporowej wyposażony w 25-milimetrową mikroanalizę Kolumny filtracyjne ze szklanymi wspornikami i pompą mechaniczną są stosowane przy użyciu techniki aseptycznej.

Umieść pojedynczy filtr o średnicy 25 milimetrów na podstawie kolumny filtra. Nałożyć kolumnę i zacisnąć urządzenie razem. Załaduj do kolumny 15 mililitrów próbki uzyskanej z mikrokosmosu o wysokiej zawartości składników odżywczych.

Otwórz zawór odcinający na kolektorze filtra i włącz filtr pompy pod delikatnym ciśnieniem, aby zminimalizować pęknięcie ogniwa. W przypadku próbek o mniejszej gęstości może być konieczne kolejne dodawanie wody. Uważając, aby filtr nie wyschł przez dłuższy czas między dodatkami wody.

Po drugie, zredukuj resztki soli paramagnetycznych z próbek morskich i opcjonalnie można przeprowadzić płukanie słodką wodą. Po zakończeniu filtrowania wyłącz pompę i pozostaw zawór otwarty, aby pod filtrem nadal było podciśnienie. Zdejmij clamp i kolumnę filtra jedną ręką.

Użyj czystej pęsety, aby chwycić filtr. Złóż filtr w poprzek, ale nie zagnieżdżaj się drugą ręką. Użyj krawędzi sterylnej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej, aby przytrzymać filtr.

Umieść filtr w dwumililitrowej rurce i zwolnij go tak, aby się otworzył Stroną z próbką skierowaną do wewnątrz. Natychmiast zamrozić w ciekłym azocie w celu ekstrakcji metabolitów rozpuszczalnych w wodzie. Najpierw żywyć próbki przez noc lub przez co najmniej 10 godzin po liofilizacji, dodaj kruszarkę ze stali nierdzewnej do każdej cienkiej rurki.

Dodać 750 mikrolitrów standaryzowanego buforu fosforanu potasu i tlenku deuteru ze wzorcem DSS. Sonikować próbki przez pięć minut w temperaturze czterech stopni w wodzie, aby usunąć materiał komórkowy z filtra. Wyjmij filtry czystą pęsetą.

Rozbij komórki za pomocą kruszarki młyna o prędkości 1600 obr./min przez pięć minut. Następnie inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Trząsł się na wytrząsarce stołowej przez 15 minut.

Po inkubacji wyjmij metalową kruszarkę czystą pęsetą. Odwirować próbkę o sile 13 000 G przez pięć minut. Po odwirowaniu odciągnąć natynkę SUP i przenieść bezpośrednio do probówki NMR w celu spektroskopii NM r.

Załaduj próbkę do spektrometru NMR tutaj. Próbki są badane na spektrometrze Bruker DRX 500 wyposażonym w sondę TXI z potrójnym gradientem osiowym pracującym przy 298 kelwinach. Zablokuj, dostrój i podkładkuj magnes.

Uzyskaj widma 1D protonów NMR za pomocą interfejsu górnego spinu i wcześniej opisanych metod lub w razie potrzeby użyj innego oprogramowania interfejsu spektrometru. W tym przypadku widma zostały uzyskane z tłumieniem szczątkowych sygnałów wodnych przez sekwencję impulsów Watergate z czasem powtarzania 1,2 sekundy. W niniejszym przykładzie dla każdej próbki zebrano 128 stanów nieustalonych.

Przenieś katalogi danych NMR do komputera osobistego z zainstalowanym oprogramowaniem potoku NMR. Przetwarzaj surowe dane, ustaw sygnał DSS jako zerowe odniesienie PPM, a następnie ręcznie fazuj widma. Digitalizuj dane spektralne według kosza tutaj, korzystając z publicznie dostępnego pakietu FT two B ze strony eCommerce.

Inne narzędzia programowe, takie jak RNMR lub Atomics, mogą być również używane do bin. Bin. Dane można znormalizować do sygnału całkowitego lub sygnału DSS, aby pokazać proporcjonalne zmiany sygnału między próbkami. Dane wyjściowe mogą być teraz wykorzystywane do dalszych analiz statystycznych, takich jak analiza głównych komponentów lub PCA przy użyciu bezpłatnych pakietów oprogramowania, takich jak pokazany R.

Oto przykład widm NMR protonów uzyskanych przy użyciu zademonstrowanej procedury. Widma pochodzą z dwóch punktów czasowych eksperymentu mikrokosmicznego i wykazują wyraźne różnice wynikające z aktywności metabolicznej glonów. Widmo dnia czwartego wykazuje znaczną obfitość szczytów, szczególnie w zakresie od 3 do 16:00 w porównaniu z próbką z pierwszego dnia.

Szczyty te można przypisać cukrom wytwarzanym przez kwitnące okrzemki w mikrokosmosie. W podobnym eksperymencie wykres wyniku PCA uzyskany z zagięcia w Mr.Spectra, pokazujący pierwsze dwa główne składniki, został wykorzystany do porównania wzrostu naturalnych zbiorowisk planktonu w sztucznej i naturalnej wodzie morskiej. To podejście statystyczne redukuje dane wielowymiarowe do prostszego formatu, dwuwymiarowego i po prostu ujawnia strukturę w podstawowych punktach danych znajdujących się poniżej.

Każda lub obie osie są tutaj bardziej podobne. Można zauważyć wyraźne różnice metaboliczne między tymi dwoma zabiegami. Dane z tego eksperymentu wykorzystano do przeprowadzenia analizy multiomicznej.

Połączenie NMR z kompozycją społeczności danych genomicznych opartą na denaturującej gradientowej elektroforezie żelowej genów 18 s i 16 genów S-R-R-N-A pokazuje również wyraźne wzorce społeczności drobnoustrojów między naturalnymi i sztucznymi mikrokosmosami wody morskiej. Taka zgodność między metabolomem a genomem z systemów naturalnych pokazuje przydatność tego podejścia. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o użyciu techniki przedmiotowej, aby zminimalizować zanieczyszczenie Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak analiza tworzenia z poziomami omicznymi, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak korelacja mikrobiomu z niektórymi metabolitami.