Koncentracja metabolitów z planktonicznych zbiorowisk o niskiej gęstości do metabolomiki środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego
7 kwietnia 2012
Przedstawiono metodę ekstrakcji metabolitów z planktonicznych społeczności drobnoustrojów. Pobieranie próbek całej społeczności realizowane jest poprzez filtrację na specjalnie przygotowanych filtrach. Po liofilizacji ekstrahowane są metabolity rozpuszczalne w wodzie. Podejście to umożliwia zastosowanie metabolomiki środowiskowej w badaniach trans-omicznych naturalnych lub eksperymentalnych społeczności drobnoustrojów.
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego oferuje kilka istotnych zalet w badaniach nad metabolomiką środowiskową, jednak w tej procedurze charakteryzuje się stosunkowo niską czułością. Przedstawiono metodę filtracji służącą do zagęszczania i ekstrakcji metabolitów całej społeczności z układów planktonicznych, odpowiednią do analiz NMR. Jest to osiągane poprzez uprzednie specjalne przygotowanie filtrów do poboru próbek poprzez usunięcie substancji ekstrahowalnych.
Drugim krokiem procedury jest filtrowanie próbki, naturalnej lub eksperymentalnej, na filtrach. Trzecim krokiem procedury jest liofilizacja materiału próbki i ekstrakcja metabolitów. Ostatnim krokiem procedury jest analiza próbek przy użyciu spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego i odpowiednia integracja danych.
Ostatecznie, dzięki zastosowaniu metabolomiki i podejścia transams, można uzyskać wyniki obrazujące zmiany metaboliczne w próbkach naturalnych wzdłuż gradientów środowiskowych lub w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wirowanie, jest możliwość pobrania próbek z całej społeczności oraz możliwość zastosowania większych objętości próbek w przypadku materiałów o niskiej gęstości. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad środowiskowymi mieszaninami metali, na przykład w kwestii tego, jak wzrost mikroorganizmów reaguje na zmiany środowiskowe. Procedura zostanie zaprezentowana na przykładach z mojego laboratorium.
Rozpocznij procedurę od umieszczenia pęsetą filtrów w czystym 500 mililitrowym naczyniu Pyrex. Zalej filtry wodą destylowaną, aby je wstępnie wypłukać, i energicznie zamieszaj, zapobiegając sklejaniu się filtrów. Odlej wodę i powtórz płukanie dwukrotnie.
Po ostatnim płukaniu do zlewki należy dodać 300 mililitrów wody Milli Q i wysterylizować filtry w autoklawie. Po autoklawowaniu filtrów należy odlać wodę Milli Q i trzykrotnie przepłukać filtry w ten sam sposób co wcześniej, lecz z zastosowaniem wody Milli Q.
Za pomocą pęsety umieść poszczególne filtry na czystej, suchej powierzchni, np. na folii aluminiowej, a następnie wysusz w odpowiedniej temperaturze. Na przykład w 37 °C lub poprzez suszenie na powietrzu; filtry są teraz gotowe do użycia w celu zademonstrowania tego protokołu. Z zastosowaniem technik aseptycznych wykorzystuje się trzystanowiskowy stalowy kolektor filtracyjny Millipore, wyposażony w 25 mm kolumny filtracyjne do mikroanalizy z szklanymi podkładkami oraz pompę mechaniczną.
Umieść pojedynczy filtr o średnicy 25 milimetrów na podstawie kolumny filtrującej. Nałóż kolumnę i zaciśnij aparat za pomocą zacisku. Nałóż na kolumnę 15 mililitrów próbki uzyskanej z mikrokosmosu o wysokiej zawartości składników odżywczych.
Otwórz zawór odcinający w kolektorze filtracyjnym i włącz pompę filtrującą pod niewielkim ciśnieniem, aby zminimalizować rozrywanie komórek. W przypadku próbek o niższej gęstości może być konieczne sukcesywne dodawanie wody. Należy zadbać o to, aby filtr nie pozostawał suchy przez dłuższy czas pomiędzy poszczególnymi dodaniami wody.
Następnie można przeprowadzić redukcję pozostałych soli paramagnetycznych z próbek morskich oraz opcjonalne płukanie wodą słodką. Po zakończeniu filtrowania należy wyłączyć pompę i pozostawić zawór otwarty, aby pod filtrem nadal utrzymywało się podciśnienie. Jedną ręką należy zdjąć zacisk i wyjąć kolumnę filtrującą.
Używając czystej pęsety, chwyć filtr. Złóż filtr na pół, uważając, aby go nie zagnieść drugą ręką. Wykorzystaj krawędź sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml, aby przytrzymać filtr.
Umieść filtr w probówce o pojemności dwóch mililitrów i zwolnij go tak, aby otworzył się stroną z próbką do wnętrza. Natychmiast zamroź w ciekłym azocie, aby wyekstrahować rozpuszczalne metabolity wodne. Najpierw liofilizuj próbki przez noc lub przez co najmniej 10 godzin; po liofilizacji dodaj do każdej probówki stalowy kruszywo.
Dodaj 750 µL zestandaryzowanego buforu fosforanowego potasu oraz tlenku deuteru ze standardem DSS. Próbki poddaj sonikacji przez pięć minut w temperaturze 4 °C w kąpieli sonikacyjnej, aby usunąć materiał komórkowy z filtra. Usuń filtry za pomocą czystej pęsety.
Rozbić komórki za pomocą kruszarki kulowej przy 1600 RPM przez pięć minut. Następnie inkubować w temperaturze 65 °C. Całość wstrząsać na wstrząsarce laboratoryjnej przez 15 minut.
Po inkubacji wyjmij metalowy kruszył za pomocą czystej pęsety. Odwiruj próbkę przy 13 000 G przez pięć minut. Po wirowaniu pobierz nadsącz i przelej go bezpośrednio do probówki NMR w celu przeprowadzenia spektroskopii NMR.
W tym miejscu wprowadź próbkę do spektrometru NMR. Próbki są analizowane na spektrometrze Bruker DRX 500 wyposażonym w sondę TXI z gradientem trójosiowym, pracującym w temperaturze 298 Kelvin. Wykonaj blokadę pola (lock), strojenie (tune) oraz shimowanie magnesu.
Należy uzyskać jednowymiarowe widma NMR protonowego (1D proton NMR), korzystając z interfejsu TopSpin i wcześniej opisanych metod lub z innego oprogramowania interfejsu spektrometru, zależnie od potrzeb. W niniejszym przypadku widma pozyskano z tłumieniem sygnałów resztkowej wody za pomocą sekwencji impulsów Watergate, przy czasie repetycji wynoszącym 1,2 sekundy. W obecnym przykładzie dla każdej próbki zebrano 128 sygnałów (transients).
Przenieś katalogi z danymi NMR na komputer osobisty z zainstalowanym oprogramowaniem NMR pipe. Przetwórz surowe dane, ustaw sygnał DSS jako punkt odniesienia 0 PPM, a następnie ręcznie przeprowadź korekcję fazową widm. Przeprowadź digitalizację danych widmowych poprzez binowanie, korzystając z ogólnodostępnego pakietu FT two B ze strony internetowej eCommerce.
Do analizy bin.Bin. można wykorzystać również inne programy użytkowe, takie jak RNMR lub Atomics. Dane można znormalizować względem sygnału całkowitego lub sygnału DSS, aby przedstawić proporcjonalne zmiany sygnału między próbkami. Uzyskane dane mogą teraz posłużyć do dalszych analiz statystycznych, takich jak analiza głównych składowych (PCA) z wykorzystaniem bezpłatnych pakietów oprogramowania, na przykład programu R.
Oto przykład widm protonowego NMR uzyskanych przy użyciu zaprezentowanej procedury. Widma pochodzą z dwóch punktów czasowych eksperymentu w mikrokosmosie i wykazują wyraźne różnice wynikające z aktywności metabolicznej alg. Widmo z czwartego dnia wykazuje znacznie większą liczbę pików, szczególnie w zakresie od 3 do 4 ppm, w porównaniu z próbką z pierwszego dnia.
Piki te można przypisać cukrom produkowanym przez kwitnące okrzemki wewnątrz mikrokosmosu. W podobnym eksperymencie wykorzystano wykres wyników PCA wygenerowany w programie Mr.Spectra, przedstawiający dwie pierwsze składowe główne, aby porównać wzrost naturalnych społeczności planktonowych w sztucznej i naturalnej wodzie morskiej. To podejście statystyczne redukuje dane wielowymiarowe do prostszego formatu – w tym przypadku dwuwymiarowego – i pozwala w prosty sposób ujawnić strukturę w analizowanych punktach danych.
Każda z osi lub obie osie są tutaj bardziej zbliżone. Widoczne są wyraźne różnice metaboliczne między dwiema grupami traktowania. Dane z tego eksperymentu zostały wykorzystane do przeprowadzenia analizy multiomowej.
Połączenie NMR z danymi genomicznymi dotyczącymi składu społeczności, opartymi na elektroforezie w żelu z gradientem denaturującym genów 18 S oraz 16 S-R-R-N-A, wykazuje również wyraźne wzorce społeczności mikroorganizmów pomiędzy mikrokosmami naturalnej i sztucznej wody morskiej. Taka zgodność między metabolomem a genomem w systemach naturalnych wykazuje przydatność tego podejścia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu odpowiedniej techniki w celu zminimalizowania kontaminacji po przeprowadzeniu tej procedury.
W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak sposób, w jaki mikrobiom koreluje z określonymi metabolitami, można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza korelacyjna na poziomach omicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę ekstrakcji metabolitów z planktonicznych społeczności drobnoustrojów z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Procedura obejmuje filtrację na specjalnie przygotowanych filtrach, liofilizację oraz następującą po niej ekstrakcję metabolitów rozpuszczalnych w wodzie, co ułatwia prowadzenie badań w zakresie metabolomiki środowiskowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Metabolomika środowiskowa
- Ekologia mikroorganizmów
- Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego
Wprowadzenie
- Ekstrakcja metabolitów jest kluczowa dla badania społeczności mikrobowych.
- Spektroskopia rezonansu magnetycznego jądra pozwala na poznanie składu metabolitów.
- Metody filtracji zwiększają stężenie metabolitów w próbkach.
- Podejście to można zastosować zarówno do naturalnych, jak i eksperymentalnych systemów mikrobowych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody ekstrakcji metabolitów z planktonicznych społeczności mikrobiologicznych.
- Umożliwienie szczegółowej analizy metabolitów przy użyciu spektroskopii NMR.
- Rozwój dziedziny metabolomiki środowiskowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie filtrów w celu usunięcia substancji wymywalnych.
- Filtracja próbek mikrobiologicznych na przygotowane filtry.
- Liofilizacja materiału z próbek.
- Ekstrakcja metabolitów rozpuszczalnych w wodzie do analizy.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie zagęszcza i ekstrahuje metabolity z populacji drobnoustrojów.
- Spektroskopia NMR pozwala na efektywną analizę wyekstrahowanych metabolitów.
- Podejście to jest możliwe do zastosowania zarówno w przypadku próbek naturalnych, jak i eksperymentalnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia profili metabolicznych populacji drobnoustrojów.
Wnioski
- Metoda ta usprawnia badania w dziedzinie metabolomiki drobnoustrojów.
- Stanowi ona podstawę dla przyszłych badań z zakresu metabolomiki środowiskowej.
- Dalsze zastosowania mogą pozwolić na lepsze zrozumienie interakcji i funkcji mikroorganizmów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metabolomika środowiskowa napotyka problemy z czułością podczas badania rzadkich społeczności mikrobiologicznych, co ogranicza zastosowanie NMR w początkowych etapach procesów odkrywczych. Ta metoda zagęszczania oparta na filtracji umożliwia niecelowane profilowanie metabolitów w systemach planktonicznych, wspierając formułowanie hipotez w ekologii mikroorganizmów oraz poszukiwanie translacyjnych biomarkerów. Dzięki poprawie wykrywalności metabolitów podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i minimalizacji ryzyka mechanistycznego w zastosowaniach związanych ze zdrowiem środowiska.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez rejestrację zmian metabolomicznych w całej społeczności mikroorganizmów w odpowiedzi na bodźce środowiskowe.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane protokoły przygotowania filtrów i lizy w celu zmniejszenia zmienności technicznej podczas ekstrakcji metabolitów.
- Wartość strategiczna: Wspiera selekcję portfolio dzięki powtarzalnemu wykrywaniu biomarkerów metabolicznych powiązanych ze stresem mikrobiologicznym lub szlakami adaptacyjnymi.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego screeningu NMR poprzez zagęszczanie metabolitów rozpuszczalnych w wodzie z próbek o niskiej gęstości.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację analizy poprzez liofilizację i ekstrakcję buforem fosforanowym potasu, co poprawia powtarzalność między poszczególnymi seriami pomiarów.
- Wartość strategiczna: Zwiększa gotowość do screeningu w badaniach nad efektem związków w modelach kokultur drobnoustrojów lub syntetycznych społeczności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia modelowanie systemów istotnych dla chorób poprzez umożliwienie korelacji metabolomu z genomem w naturalnych i sztucznych mikrokosmosach wody morskiej.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość translacyjną dzięki integracji multiomiki, łącząc widma metabolitów z danymi o składzie genomicznym społeczności.
- Wartość strategiczna: Pomaga w podejmowaniu decyzji o rozwoju w oparciu o analizę ryzyka poprzez identyfikację spójnych sygnatur metabolicznych w obrębie gradientów środowiskowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, umożliwiając weryfikację hipotez w systemach mikrobiologicznych, przechodzi do fazy przesiewowej poprzez standaryzowaną ekstrakcję metabolitów i wspiera badania translacyjne dzięki dopasowaniu danych multiomicznych.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wykrywanie zmian w metabolitach w społecznościach planktonicznych poddanych manipulacjom eksperymentalnym.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy i wyniki ilościowe poprzez pomiar stężeń metabolitów wykrywalnych metodą NMR po filtracji i lizie.
- Analityka: Generuje dane spektralne odpowiednie do analizy statystycznej, takiej jak PCA, umożliwiając porównanie warunków i rozpoznawanie wzorców.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez odpowiedniość metabolomu i genomu w systemach naturalnych, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę filtracji i ekstrakcji, którą można zastosować w różnych wodnych modelach mikrobiologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w odpowiedziach metabolitów drobnoustrojów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki wstępnej obróbce filtrów oraz zautomatyzowanym etapom lizy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go poprzez dostarczanie powtarzalnych profili metabolitów służących do biologicznej redukcji ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki wykrywalnym przesunięciom metabolitów powiązanym z fenotypami wzrostu lub stresu drobnoustrojów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach filtracji, liofilizacji oraz przygotowywania próbek do NMR w celu uniknięcia kontaminacji i zapewnienia odzysku metabolitów.
- Zależy od dostępu do spektrometrów NMR z funkcją tłumienia sygnału wody oraz oprogramowania do przetwarzania i binowania widm.
- Wymaga standaryzacji obsługi filtrów, buforów ekstrakcyjnych i protokołów normalizacji danych pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania procedur do różnej gęstości próbek, co może wymagać sekwencyjnych filtracji lub korekt objętości w przypadku społeczności o niskiej liczebności.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak interferencje pozostałych soli paramagnetycznych w próbkach morskich, co wymaga opcjonalnych etapów płukania w celu utrzymania jakości widma.
