Wizualizacja wirusa dengi za pomocą znakowania Alexa Fluor

Ogólnym celem niniejszego doświadczenia jest fluorescencyjne znakowanie wirusa dengi do badań mikroskopowych. Należy przygotować niezbędne bufory i oczyścić wirusa dengi za pomocą poduszki sacharozowej, a następnie zrekonstytuować barwnik Amy React Alexa Fluor oraz wirusa dengi w buforze do znakowania. Wirus dengi zostaje znakowany przy użyciu 100 µM Alexa Fluor.

Inkubuj przez jedną godzinę, a następnie zatrzymaj reakcję znakowania za pomocą odpowiedniego odczynnika. Oczyść znakowany wirus dengue za pomocą kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego. Ponownie wyznacz miano znakowanego wirusa za pomocą testu plackowego i oszacuj stopień znakowania za pomocą testu immunofluorescencyjnego.

Witajcie, nazywam się Sam Jang z DSO National Laboratories i pracuję w laboratorium dr. Wee w programie dotyczącym nowo pojawiających się chorób zakaźnych po ukończeniu szkoły medycznej na NUS. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić znakowanie fluorescencyjne wirusa Dengue przy użyciu reaktywnego barwnika Alexa Fluor na potrzeby badań obrazowych. Barwniki Alexa Fluor charakteryzują się wyższą stabilnością i są mniej wrażliwe na pH niż powszechnie stosowane barwniki, takie jak fluoresceina i rodamina, co czyni je idealnymi do badań nad wchłanianiem komórkowym i transportem endosomalnym wirusa.

Oznakowanie wirusa dengi fluoroforem Alexa Fluor ułatwi zrozumienie patogenezy dengi. Przejdźmy zatem do realizacji. Przed reakcją znakowania należy przygotować świeży bufor do znakowania oraz odczynnik zatrzymujący zgodnie z protokołem pisemnym, a wirusa dengi oczyścić metodą poduszki sacharozowej. Do probówki do mikrowirówki należy dodać odpowiednią objętość oczyszczonego wirusa dengi do buforu do znakowania, aby uzyskać stężenie 300 milionów jednostek tworzących w ml.

Można to proporcjonalnie przeskalować. W przypadku znakowania partii wirusa, bezpośrednio przed reakcją znakowania należy zrekonstytuować liofilizowany barwnik Alexa do stężenia 1 mM w buforze do znakowania.

Od tego kroku należy zminimalizować ekspozycję na światło. W celach demonstracyjnych barwnik Alexa zostanie pozostawiony bez ochrony przed światłem. Do rozcieńczonego wirusa dengi należy dodać 800 µL 1 mM barwnika Alexa, delikatnie mieszając końcówką mikropipety.

Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem i mieszając poprzez delikatne odwracanie probówek co 15 minut. Po upływie jednej godziny krótko wirować probówki. Pobrać 800 µL zawartości, delikatnie mieszając mikropipetą, a następnie inkubować przez dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem i mieszając poprzez delikatne odwracanie co 15 minut.

W międzyczasie należy wypłukać kolumnę oczyszczającą 25 mililitrami buforu HNE. Po godzinnej inkubacji nanieś oznakowany wirus na kolumnę i rozpocznij zbieranie frakcji przepływowej. Wypełnij kolumnę buforem HNE.

Po wprowadzeniu całego znakowanego wirusa do matrycy, odrzuć pierwsze 2,5 ml przesączu i zbierz kolejne dwa ml frakcji znakowanego wirusa. Przechowuj oczyszczony znakowany wirus w temperaturze -80 °C. Wyznacz miano znakowanego wirusa za pomocą metody płytek.

W typowym doświadczeniu spadek miana wirusa nie powinien przekroczyć dziesięciokrotności. Po znakowaniu należy przeprowadzić analizę immunofluorescencyjną w celu oceny stopnia znakowania. W tym celu należy policzyć komórki wirusowe za pomocą cytometru hematologicznego i dodać odpowiednią objętość komórek do pożywki wzrostowej, aby uzyskać gęstość 50 000 komórek na mililitr.

Do każdej studniki płytki czterodotworowej zawierającej sterylną szkiełko przykrywowe nanieś jeden mililitr komórek zakażonych wirusem. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Wyjmij płytkę z inkubatora i odessać nadsącz z każdej studni, a następnie inkubuj komórki z wirusem znakowanym w stężeniu około 1 MOI w objętości 100 µL przez 10 minut w temperaturze 37 °C.

Usunąć inokulum i przemyć komórki 0,5 ml buforu PBS na każdą studzienkę. Powtórzyć tę procedurę jeszcze dwukrotnie. Utrwalić komórki za pomocą 200 µl 3% paraformaldehydu na każdą studzienkę, inkubując w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Przemyj komórki trzykrotnie 0,5 mililitrami buforu PBS na każdą studzienkę. Poddaj komórki działaniu roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Usuń szkiełko nakrywające ze studzienki za pomocą precyzyjnej pęsety.

Odsącz nadmiar płynu, przykładając papier filtracyjny do krawędzi szkiełka nakrywki. Przesuń szkiełko przeciw do białego papieru. Umieść stronę z komórkami szkiełka nakrywki.

Nanieś 25 µL przeciwciał przeciwko białku E wirusa dengue na szkiełko podstawowe. Inkubuj przez jedną godzinę w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie przenieś szkiełko nakrywkę do płytki 6-dołkowej i dodaj dwa mililitry buforu płuczącego do każdego dołka.

Odsuń nadmiar cieczy pipetą. Powtórz te etapy płukania jeszcze dwa razy po ostatnim myciu. Usuń szkiełko nakrywki z dołka za pomocą precyzyjnej pęsety.

Odsącz nadmiar płynu, przykładając krawędź szkiełka nakrywki do ręcznika papierowego. Przesuń szkiełko po ręczniku. Umieść stronę komórki pod nakrywką.

Nanieś 25 µL przeciwciała wtórnego anty-mysiego Alexa Fluor 488 na kawałek folii Parafilm. Inkubuj przez 45 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po zakończeniu inkubacji przenieś szkiełko nakrywkę do płytki 6-dołkowej i przemyj komórki trzy razy, używając 2 mL buforu do mycia na każde przemycie. Po ostatnim przemyciu wyjmij szkiełko nakrywkę z dołka i opłucz raz w wodzie jonizowanej.

Odessać nadmiar płynu, przykładając papier chłonny. Przykryć preparat szkiełkiem podstawowym, używając 8 µL łagodnego medium montującego. Pozostawić medium do utrwalenia przez noc w temperaturze 4 °C.

Próbka jest teraz gotowa do wizualizacji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego. Nanieś małą kroplę olejku imersyjnego na powierzchnię szkiełka nakrywki i przymocuj preparat do stolika mikroskopu.

Przesuń stolik, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z olejkiem immersyjnym. Aby uzyskać wyraźny obraz, wyłącz oświetlenie zewnętrzne za pomocą oprogramowania Zes Zen. Kliknij zakładkę ocular, aby przeprowadzić bezpośrednią obserwację próbki przez okular mikroskopu.

Znajdź pole z komórkami i wyreguluj ostrość. Następnie przełącz się w tryb akwizycji. Aby zminimalizować przesłuchy między fluoroforami, wybierz osobne ścieżki dla Alexa Fluor 488 i Cy5.

Barwniki i zestawy dopasowano do sekwencyjnej ekscytacji i detekcji. Dostosowano wzmocnienie (gain) oraz offset mocy lasera, aby zapewnić obraz bez prześwietleń i niedoświetleń. Przechwycono obraz i przeanalizowano obszar zainteresowania za pomocą funkcji kolokalizacji.

Współczynnik nakładania może być wykorzystany do oszacowania stopnia znakowania wirusa dengi barwnikiem Alexa Flo. Przeprowadzono prosty test immunofluorescencyjny na komórkach wirusowych, a stopień znakowania oszacowano na podstawie kolokalizacji znakowanego wirusa z przeciwciałami przeciwko białku E; wartości współczynnika nakładania barwienia przeciwciałami mieściły się w zakresie od 0,65 do 0,8, co sugeruje, że około 65 do 80% wariantów zostało znakowanych barwnikiem Alexa Flo. Aby procedura znakowania zakończyła się sukcesem, ważne jest przygotowanie buforu do znakowania oraz użycie świeżo zrekonstytuowanego barwnika Alexa Flo przed rozpoczęciem procesu znakowania.

Stężenie barwnika można dodatkowo zoptymalizować, aby dostosować je do własnych potrzeb. Tę metodę znakowania wirusa dengi w układzie horyzontalnym można potencjalnie zaadaptować do znakowania innych wirusów. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach z znakowaniem.