Name: Wizualizacja wirusa dengi za pomocą etykietowania Alexa Fluor (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego etykietowania wirusa dengi za pomocą Alexa Fluor do mikroskopowych badań interakcji wirus-komórka. Technika ta umożliwia wizualizację wczesnych etapów infekcji wirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez National Medical Research Council w Singapurze.

1. Znakowanie wirusa dengi barwnikami Alexa Fluor
<ol>
	<li>Przed reakcją znakowania należy oczyścić wirusa dengue za pomocą poduszki sacharozowej oraz przygotować niezbędne odczynniki i sprzęt zgodnie z opisem w protokole.</li>
	<li>Bezpośrednio przed znakowaniem należy przygotować świeży bufor wodorowęglanowy 0,2M o pH 8,5 (bufor do znakowania) oraz bufor hydroksyloaminowy 1,5M o pH 8,3 (odczynnik zatrzymujący), a następnie poddać je sterylizacji przez filtrowanie za pomocą filtrów strzykawkowych 0,2μm.</li>
	<li>W probówce o pojemności 2ml należy rozcieńczyć około 3x108 jednostek tworzących plak (pfu) oczyszczonego wirusa dengue w 1ml buforu do znakowania. W przypadku znakowania wirusa w większych partiach można proporcjonalnie zwiększyć skalę procesu.</li>
	<li>Bezpośrednio przed reakcją znakowania liofilizowane estry succinimidylowe Alexa Fluor 594 (AF594) należy zrekonstytuować do stężenia 1mM w buforze do znakowania. W zależności od potrzeb można zastosować inne fluorochromy z serii barwników Alexa Fluor. Od tego momentu należy zminimalizować ekspozycję na światło.</li>
	<li>Do rozcieńczonego wirusa należy dodać 100μl barwnika AF594 o stężeniu 1mM, delikatnie mieszając końcówką pipety.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną do znakowania należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 1hr w ciemności. Co 15mins należy mieszać próbkę poprzez delikatne odwracanie probówki.</li>
	<li>Probówkę należy krótko wirować w wirówce laboratoryjnej, a następnie do mieszaniny reakcyjnej dodać 100μl odczynnika zatrzymującego, delikatnie mieszając końcówką pipety.</li>
	<li>Próbkę należy inkubować w temperaturze pokojowej przez kolejną godzinę w ciemności. Co 15mins należy mieszać przez delikatne odwracanie probówki.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie wirusa dengi znakowanego barwnikiem Alexa Fluor
<ol>
	<li>W międzyczasie przeprowadź równoważenie kolumny oczyszczającej wybranym buforem. W tym doświadczeniu kolumnę PD-10 równoważy się przed użyciem 25ml buforu HNE (5mM Hepes, 150mM NaCl, 0.1mM EDTA), pH 7.4.</li>
	<li>Nanieś oznakowany wirus na górę kolumny i rozpocznij zbieranie frakcji przepływowej w momencie, gdy oznakowany wirus wejdzie w macierz. Po całkowitym wniknięciu oznakowanego wirusa w macierz wypełnij kolumnę buforem HNE. Odrzuć pierwsze 2.5ml frakcji przepływowej i zbierz kolejne 2ml frakcji z oznakowanym wirusem.</li>
	<li>Rozdziel oczyszczonego, oznakowanego AF594 wirusa dengi na alikwoty i przechowuj w temperaturze -80°C, chroniąc przed źródłem światła.</li>
</ol>
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną alikwot i oznaczyć miano znakowanego wirusa za pomocą testu plackowego przed użyciem partii znakowanego wirusa.</li>
	<li>Dzień przed infekcją wysiać 5x104 komórek Vero na dołek w płytce 4-dołkowej z zakryweką na dnie dołka, hodując je w pożywce wzrostowej M-199.</li>
	<li>Usunąć nadsącz z dołka i zainfekować komórki znakowanym wirusem z wielokrotnością infekcji (MOI) równą 1 w objętości 100μl (rozcieńczonej w pożywce utrzymującej M-199 zgodnie z potrzebami) przez 10min w 37°C.</li>
	<li>Usunąć inokulaty i dwukrotnie przemyć zakrywki w 1xPBS.</li>
	<li>Utrwalić komórki w 3% paraformaldehydzie przez 30mins.</li>
	<li>Przemyć zakrywki 3 razy w 1xPBS.</li>
	<li>Przeprowadzić permeabilizację komórek za pomocą roztworu do permeabilizacji zawierającego 0,1% saponiny i 5% BSA w 1xPBS przez 30mins.</li>
	<li>Inkubować komórki z nierozcieńczonym, oczyszczonym przez wirowanie nadsączem z hodowli hybridomy przeciwciała monoklonalnego 3H5 przez 1hr w komorze wilgotnościowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Przemyć zakrywki 3 razy w buforze do mycia (1xPBS zawierającym 1mM chlorku wapnia, 1mM chlorku magnezu i 0,1% saponiny).</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałem AF488 anty-mysie IgG, rozcieńczonym 1:100 w roztworze do permeabilizacji, przez 45mins w komorze wilgotnościowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Przemyć zakrywki 3 razy w buforze do mycia i raz opłukać w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Osuszyć krawędź zakrywki ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wody, i zamontować na szkiełku przedmiotowym za pomocą 8μl Mowiol 4-88 zawierającego 2,5% Dabco.</li>
	<li>Pozostawić medium montażowe do utwardzenia przez noc w 4°C przed obserwacją przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss. Pozyskiwanie obrazów należy przeprowadzać sekwencyjnie, wzbudzając po jednym fluoroforze naraz i jednocześnie przełączając detektory.</li>
	<li>Obrazy analizuje się następnie pod kątem kolokalizacji barwienia przeciwciałami przeciwko białku E ze znakowanym wirusem przy użyciu oprogramowania Zeiss LSM Zen, aby oszacować stopień znakowania.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Przykład wydajności wirusa dengi znakowanego barwnikiem AF594 przedstawiono na rysunku 2. Zazwyczaj po udanym znakowaniu spadek miana w stosunku do wartości początkowej nie powinien przekraczać 10-krotności. Należy jednak zauważyć, że aby znakowanie przebiegło pomyślnie, wszystkie bufory muszą być przygotowane na świeżo, a estry succinimidylowe Alexa Fluor należy wykorzystać natychmiast po reconstitution, ponieważ w roztworach wodnych hydrolizują one do niereaktywnych wolnych kwasów8.
Następnie, przed wykorzystaniem w eksperymentach, należy sprawdzić, czy znakowany wirus wykazuje wystarczającą fluorescencję. Przeprowadzono prosty test immunofluorescencji na komórkach Vero, a stopień znakowania oszacowano na podstawie ko-lokalizacji znakowanego wirusa z barwieniem przeciwciałami przeciwko białku E. Zbadano kilka komórek, a typowy obraz konfokalny przedstawiono na Rysunku 3. Analiza ko-lokalizacji obrazów z wykorzystaniem oprogramowania LSM Zen wykazała współczynniki nakładania w zakresie od 0,65 do 0,8, co sugeruje, że około 65 do 80% wirionów zostało znakowanych barwnikiem.
<img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="Proces znakowania wirusa dengi; obejmuje znakowanie barwnikiem Alexa Fluor, analizę fluorescencji i mikroskopię." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólny schemat procedury znakowania wirusa dengi barwnikiem Alexa Fluor. W pierwszej kolejności przygotowuje się odpowiednie bufory oraz oczyszczonego wirusa dengi. Barwnik Alexa Fluor zostaje zrekonstytuowany i dodany do wirusa dengi rozcieńczonego w buforze do znakowania. Reakcję zatrzymuje się po 1 godzinie poprzez dodanie odczynnika stopującego. Następnie znakowany wirus jest oczyszczany za pomocą kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego w celu usunięcia wolnego barwnika. Na koniec znakowany wirus jest ponownie miareczkowany za pomocą metody plackowej i testowany pod kątem fluorescencji.
<img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="Analiza miana wirusa; wykres słupkowy; przed i po traktowaniu; miano pfu/ml; porównanie ładunku wirusowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Średnia liczba żywych wirionów (pfu/ml) określona za pomocą metody plackowej przed i po znakowaniu AF594. Alikwot wirusa dengi znakowanego AF594 zostaje rozmrożony i ponownie poddany mianowaniu metodą plackową, co zazwyczaj wykazuje spadek miana poniżej 10-krotności miana początkowego. Słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe dla pomiarów powtórzonych.
<img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna białka E z oznakowaniem AF594; trzyczęściowy schemat przedstawiający lokalizację białka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Kolokalizacja znaczników AF594 z białkami E wirusa dengi w komórkach Vero. Komórki hodowane na szkiełkach osłonowych dzień wcześniej zainfekowano wirusem dengi oznakowanym AF594 przy MOI wynoszącym 1 przez 10 minut w temperaturze 37°C. Następnie komórki utrwalono i oznakowano przeciwciałami anty-E, a następnie zbadano kolokalizację białka E (zielony) i oznakowania AF594 (czerwony). Sygnały fluorescencyjne wizualizowano przy powiększeniu 63X przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 710. Pasek skali wynosi 10μm. Kolor żółty wskazuje obszary kolokalizacji, co pokazano na powiększeniu.

<ol><li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &amp, Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Protein+Color+Palette%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li>
<li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+dengue+virus%3A+implications+for+flavivirus+organization%2C+maturation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li>
<li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li>
<li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Alexa+Fluor+Succinimidyl+Esters+%28Molecular+Probes%22">Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes</a>. , Invitrogen. (2009).</li>
<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li>
<li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Mimo że w niniejszym raporcie zastosowano barwnik AF594, dostępna jest szeroka gama fluoroforów z serii estrów succinimidylowych Alexa Fluor o podobnej chemii znakowania. Mogłoby to rozszerzyć zastosowania znakowania poza obrazowanie. Cytometria przepływowa może być wykorzystana jako alternatywa dla mikroskopii konfokalnej do szacowania stopnia znakowania fluoroforów, które mogą być wzbudzane i wykrywane przez aparat FACS.
Barwniki Alexa Fluor to małe cząsteczki reagujące z wolnymi grupami ami...

<table><tbody><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Hydroksamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Estry succinimidylowe AF594</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A20004</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>M-199</td><td>Invitrogen</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 4-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Krywinki</td><td>Einst</td><td>0111520</td><td></td></tr><tr><td>Przeszkiełko mikroskopowe</td><td>Sail Brand</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Hybrydoma 3H5</td><td>ATCC</td><td>HB46</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td>BUF-2040-10X1L</td><td>1st Base</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15,812-7</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D27802</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka nakładkowa</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Aby przygotować pożywkę wzrostową M-199, do 500 ml M-199 dodać 50 ml FBS, 5 ml pirogronianu sodu oraz 5 ml nieistotnych aminokwasów, a następnie przefiltrować sterylnie.</td></tr><tr><td colspan="4">Aby przygotować pożywkę podtrzymującą M-199, do 500 ml M-199 dodać 15 ml FBS, 5 ml pirogronianu sodu oraz 5 ml nieistotnych aminokwasów, a następnie przefiltrować sterylnie.</td></tr></tbody></table>

wizualizacja wirusa dengi za pomocą znakowania alexa fluor

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Wczesne zdarzenia w interakcji między wirusem a komórką mogą mieć głęboki wpływ na wynik infekcji. Określenie czynników wpływających na tę interakcję mogłoby prowadzić do lepszego zrozumienia patogenezy choroby, a tym samym wpłynąć na projektowanie szczepionek lub terapii. W związku z tym użyteczne byłoby opracowanie metod pozwalających badać tę interakcję. Niedawne postępy w rozwoju fluoroforów1-3 oraz technologii obrazowania4 mogą zostać wykorzystane do poszerzenia naszej obecnej wiedzy na temat patogenezy dengi, co utoruje drogę do ograniczenia milionów infekcji tym wirusem występujących corocznie.

Otoczka wirusa dengi składa się z zewnętrznego rusztowania utworzonego przez 90 dimerów glikoproteiny otoczki (E), które chronią skorupę nukleokapsydu zawierającą pojedynczą dodatnią nić RNA genomu5. Identyczne podjednostki białkowe na powierzchni wirusa mogą zatem zostać oznakowane barwnikiem reaktywnym wobec grup aminowych i zwizualizowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Przedstawiamy tutaj prostą metodę znakowania wirusa dengi barwnikiem Alexa Fluor z estrem succinimidylowym, rozpuszczonym bezpośrednio w buforze wodorowęglanowym sodu, która pozwoliła na uzyskanie wysoce żywotnych wirusów po znakowaniu. Nie istnieje ustandaryzowana procedura znakowania żywych wirusów, a istniejące protokoły producentów dotyczące znakowania białek zazwyczaj wymagają rozpuszczenia barwnika w dimetylosulfoksydzie. Obecność dimetylosulfoksydy, nawet w śladowych ilościach, może blokować produktywną infekcję wirusem oraz indukować cytotoksyczność komórkową6. Wykluczenie zastosowania dimetylosulfoksydy w niniejszym protokole zredukowało zatem tę możliwość. Barwniki Alexa Fluor charakteryzują się doskonałą fotostabilnością i są mniej wrażliwe na pH niż powszechnie stosowane barwniki, takie jak fluoresceina i rodamina2, co czyni je idealnymi do badań nad pobieraniem komórkowym i transportem endosomalnym wirusa. Koniugacja z barwnikiem Alexa Fluor nie wpłynęła na rozpoznawanie znakowanego wirusa dengi przez specyficzne przeciwciała przeciwwirusowe oraz jego domniemane receptory w komórkach gospodarza7. Metoda ta może znaleźć przydatne zastosowania w badaniach wirologicznych.

Wykorzystując postępy w opracowywaniu fluoroforów oraz technologii obrazowania, opracowano prostą metodę znakowania wirusa dengi barwnikami Alexa Fluor w celu wizualizacji wczesnych oddziaływań między wirusem a komórką.

Wizualizacja wirusa dengi za pomocą znakowania Alexa Fluor

Wczesne etapy interakcji między wirusem a komórką mogą mieć głęboki wpływ na wynik infekcji. Określenie czynników, które...

Ogólnym celem niniejszego doświadczenia jest fluorescencyjne znakowanie wirusa dengi do badań mikroskopowych. Należy przygotować niezbędne bufory i oczyścić wirusa dengi za pomocą poduszki sacharozowej, a następnie zrekonstytuować barwnik Amy React Alexa Fluor oraz wirusa dengi w buforze do znakowania. Wirus dengi zostaje znakowany przy użyciu 100 µM Alexa Fluor.Inkubuj przez jedną godzinę, a następnie zatrzymaj reakcję znakowania za pomocą odpowiedniego odczynnika. Oczyść znakowany wirus dengue za pomocą kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego. Ponownie wyznacz miano znakowanego wirusa za pomocą testu plackowego i oszacuj stopień znakowania za pomocą testu immunofluorescencyjnego.Witajcie, nazywam się Sam Jang z DSO National Laboratories i pracuję w laboratorium dr. Wee w programie dotyczącym nowo pojawiających się chorób zakaźnych po ukończeniu szkoły medycznej na NUS. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić znakowanie fluorescencyjne wirusa Dengue przy użyciu reaktywnego barwnika Alexa Fluor na potrzeby badań obrazowych. Barwniki Alexa Fluor charakteryzują się wyższą stabilnością i są mniej wrażliwe na pH niż powszechnie stosowane barwniki, takie jak fluoresceina i rodamina, co czyni je idealnymi do badań nad wchłanianiem komórkowym i transportem endosomalnym wirusa.Oznakowanie wirusa dengi fluoroforem Alexa Fluor ułatwi zrozumienie patogenezy dengi. Przejdźmy zatem do realizacji. Przed reakcją znakowania należy przygotować świeży bufor do znakowania oraz odczynnik zatrzymujący zgodnie z protokołem pisemnym, a wirusa dengi oczyścić metodą poduszki sacharozowej. Do probówki do mikrowirówki należy dodać odpowiednią objętość oczyszczonego wirusa dengi do buforu do znakowania, aby uzyskać stężenie 300 milionów jednostek tworzących w ml.Można to proporcjonalnie przeskalować. W przypadku znakowania partii wirusa, bezpośrednio przed reakcją znakowania należy zrekonstytuować liofilizowany barwnik Alexa do stężenia 1 mM w buforze do znakowania.Od tego kroku należy zminimalizować ekspozycję na światło. W celach demonstracyjnych barwnik Alexa zostanie pozostawiony bez ochrony przed światłem. Do rozcieńczonego wirusa dengi należy dodać 800 µL 1 mM barwnika Alexa, delikatnie mieszając końcówką mikropipety.Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem i mieszając poprzez delikatne odwracanie probówek co 15 minut. Po upływie jednej godziny krótko wirować probówki. Pobrać 800 µL zawartości, delikatnie mieszając mikropipetą, a następnie inkubować przez dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem i mieszając poprzez delikatne odwracanie co 15 minut.W międzyczasie należy wypłukać kolumnę oczyszczającą 25 mililitrami buforu HNE. Po godzinnej inkubacji nanieś oznakowany wirus na kolumnę i rozpocznij zbieranie frakcji przepływowej. Wypełnij kolumnę buforem HNE.Po wprowadzeniu całego znakowanego wirusa do matrycy, odrzuć pierwsze 2,5 ml przesączu i zbierz kolejne dwa ml frakcji znakowanego wirusa. Przechowuj oczyszczony znakowany wirus w temperaturze -80 °C. Wyznacz miano znakowanego wirusa za pomocą metody płytek.W typowym doświadczeniu spadek miana wirusa nie powinien przekroczyć dziesięciokrotności. Po znakowaniu należy przeprowadzić analizę immunofluorescencyjną w celu oceny stopnia znakowania. W tym celu należy policzyć komórki wirusowe za pomocą cytometru hematologicznego i dodać odpowiednią objętość komórek do pożywki wzrostowej, aby uzyskać gęstość 50 000 komórek na mililitr.Do każdej studniki płytki czterodotworowej zawierającej sterylną szkiełko przykrywowe nanieś jeden mililitr komórek zakażonych wirusem. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Wyjmij płytkę z inkubatora i odessać nadsącz z każdej studni, a następnie inkubuj komórki z wirusem znakowanym w stężeniu około 1 MOI w objętości 100 µL przez 10 minut w temperaturze 37 °C.Usunąć inokulum i przemyć komórki 0,5 ml buforu PBS na każdą studzienkę. Powtórzyć tę procedurę jeszcze dwukrotnie. Utrwalić komórki za pomocą 200 µl 3% paraformaldehydu na każdą studzienkę, inkubując w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Przemyj komórki trzykrotnie 0,5 mililitrami buforu PBS na każdą studzienkę. Poddaj komórki działaniu roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Usuń szkiełko nakrywające ze studzienki za pomocą precyzyjnej pęsety.Odsącz nadmiar płynu, przykładając papier filtracyjny do krawędzi szkiełka nakrywki. Przesuń szkiełko przeciw do białego papieru. Umieść stronę z komórkami szkiełka nakrywki.Nanieś 25 µL przeciwciał przeciwko białku E wirusa dengue na szkiełko podstawowe. Inkubuj przez jedną godzinę w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie przenieś szkiełko nakrywkę do płytki 6-dołkowej i dodaj dwa mililitry buforu płuczącego do każdego dołka.Odsuń nadmiar cieczy pipetą. Powtórz te etapy płukania jeszcze dwa razy po ostatnim myciu. Usuń szkiełko nakrywki z dołka za pomocą precyzyjnej pęsety.Odsącz nadmiar płynu, przykładając krawędź szkiełka nakrywki do ręcznika papierowego. Przesuń szkiełko po ręczniku. Umieść stronę komórki pod nakrywką.Nanieś 25 µL przeciwciała wtórnego anty-mysiego Alexa Fluor 488 na kawałek folii Parafilm. Inkubuj przez 45 minut w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po zakończeniu inkubacji przenieś szkiełko nakrywkę do płytki 6-dołkowej i przemyj komórki trzy razy, używając 2 mL buforu do mycia na każde przemycie. Po ostatnim przemyciu wyjmij szkiełko nakrywkę z dołka i opłucz raz w wodzie jonizowanej.Odessać nadmiar płynu, przykładając papier chłonny. Przykryć preparat szkiełkiem podstawowym, używając 8 µL łagodnego medium montującego. Pozostawić medium do utrwalenia przez noc w temperaturze 4 °C.Próbka jest teraz gotowa do wizualizacji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego. Nanieś małą kroplę olejku imersyjnego na powierzchnię szkiełka nakrywki i przymocuj preparat do stolika mikroskopu.Przesuń stolik, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z olejkiem immersyjnym. Aby uzyskać wyraźny obraz, wyłącz oświetlenie zewnętrzne za pomocą oprogramowania Zes Zen. Kliknij zakładkę ocular, aby przeprowadzić bezpośrednią obserwację próbki przez okular mikroskopu.Znajdź pole z komórkami i wyreguluj ostrość. Następnie przełącz się w tryb akwizycji. Aby zminimalizować przesłuchy między fluoroforami, wybierz osobne ścieżki dla Alexa Fluor 488 i Cy5.Barwniki i zestawy dopasowano do sekwencyjnej ekscytacji i detekcji. Dostosowano wzmocnienie (gain) oraz offset mocy lasera, aby zapewnić obraz bez prześwietleń i niedoświetleń. Przechwycono obraz i przeanalizowano obszar zainteresowania za pomocą funkcji kolokalizacji.Współczynnik nakładania może być wykorzystany do oszacowania stopnia znakowania wirusa dengi barwnikiem Alexa Flo. Przeprowadzono prosty test immunofluorescencyjny na komórkach wirusowych, a stopień znakowania oszacowano na podstawie kolokalizacji znakowanego wirusa z przeciwciałami przeciwko białku E; wartości współczynnika nakładania barwienia przeciwciałami mieściły się w zakresie od 0,65 do 0,8, co sugeruje, że około 65 do 80% wariantów zostało znakowanych barwnikiem Alexa Flo. Aby procedura znakowania zakończyła się sukcesem, ważne jest przygotowanie buforu do znakowania oraz użycie świeżo zrekonstytuowanego barwnika Alexa Flo przed rozpoczęciem procesu znakowania.Stężenie barwnika można dodatkowo zoptymalizować, aby dostosować je do własnych potrzeb. Tę metodę znakowania wirusa dengi w układzie horyzontalnym można potencjalnie zaadaptować do znakowania innych wirusów. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach z znakowaniem.

visualizing-dengue-virus-through-alexa-fluor-labeling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wizualizacja wirusa dengi za pomocą oznaczania Alexa Fluor

Konstrukcje typu Function-Spacer-Lipid (FSL) pozwalają na modyfikację charakterystyki powierzchni żywych komórek i wirionów bez utraty ich żywotności. Metoda ta wymaga jedynie prostego kontaktu roztworu konstrukcji FSL z komórką lub wirionem, co prowadzi do spontanicznej i stabilnej inkorporacji w powierzchnię.

Konstrukcje FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Źródło: Zaeck, L., et al. Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem. J. Vis. exp. (2019).  Ten film pokazuje proces przygotowania i obrazowania tkanki mózgowej myszy zakażonej wirusem wścieklizny (RABV) w celu oceny postępu infekcji. Przedstawiono w nim kluczowe etapy, w tym barwienie tkanek za pomocą markerów fluorescencyjnych, odwodnienie, oczyszczanie i montaż do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej,...

Trójwymiarowa wizualizacja zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej myszy

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Wirusy lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były wychwytywane immunologicznie za pomocą nanocząsteczek magnetycznych 15 nm sprzężonych z przeciwciałami rozpoznającymi antygeny powierzchniowe. Uchwycone wiriony lub pęcherzyki znakowano fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko innym antygenom powierzchniowym. Powstałe kompleksy rozdzielono w silnym polu magnetycznym i przeanalizowano za pomocą konwencjonalnych cytometrów przepływowych wyzwalanych fluorescencją.

Wirometria przepływowa do analizy widm antygenowych wirionów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj prezentujemy czułą, szybką i dyskryminującą metodę barwienia po żelu do obrazowania RNA oznaczonych aptamerami RNA Mango I, II, III lub IV, przy użyciu natywnych lub denaturujących żeli do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Po uruchomieniu standardowych żeli PAGE, RNA znakowane mango można łatwo wybarwić TO1-Biotyną, a następnie przeanalizować za pomocą powszechnie dostępnych czytników fluorescencji.

Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Tutaj opisujemy prostą metodę, która łączy fluorescencję RNA hybrydyzację in situ (RNA-FISH) z immunofluorescencją w celu wizualizacji RNA koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2). Protokół ten może zwiększyć zrozumienie charakterystyki molekularnej interakcji RNA-gospodarz SARS-CoV-2 na poziomie pojedynczej komórki.

Wizualizacja SARS-CoV-2 za pomocą hybrydyzacji immuno RNA-fluorescencji in situ

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Poznaj metodę fluorescencyjnego etykietowania wirusa dengi za pomocą Alexa Fluor do mikroskopowych badań interakcji wirus-komórka. Technika ta umożliwia wizualizację wczesnych etapów infekcji wirusowej.

Wizualizacja wirusa dengi za pomocą znakowania Alexa Fluor

Przeglądaj więcej filmów