Wizualizacja wirusa dengi za pomocą etykietowania Alexa Fluor
July 9th, 2011
Korzystając z postępu w rozwoju technologii fluoroforów i obrazowania, opracowano prostą metodę znakowania wirusa dengi za pomocą Alexy Fluor, aby zobrazować wczesne interakcje między wirusem a komórką.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest fluorescencyjne znakowanie wirusa dengi do badań mikroskopowych. Przygotuj niezbędne i oczyść wirusa dengi za pomocą poduszki sacharozy, rozpuść barwnik przepływowy Amy React Alexa i wirusa dengi w buforze do znakowania. Oznacz wirusa dengi za pomocą stu mikromolów przepływu Alexa.
Umrzeć na godzinę i zatrzymać reakcję etykietowania za pomocą odczynnika. Oczyść etykietę wirusa dengi za pomocą kolumny wykluczania rozmiaru. Ponownie miareczkować znakowanego wirusa za pomocą testu płytki nazębnej i oszacować stopień znakowania za pomocą testu immunofluorescencyjnego.
Cześć, nazywam się Sam Jang z Narodowych Laboratoriów DSO i pracuję w laboratorium Dr.Wee w programie pojawiających się chorób zakaźnych po ukończeniu szkoły medycznej NUS. Dzisiaj pokażę Ci, jak fluorescencyjnie znakować wirusa Denki za pomocą barwnika grypy Amy Reactive Alexa do badań obrazowych. Alexa, grypa umiera, mają lepszą stabilność i są mniej wrażliwe na pH niż zwykła dieta, taka jak fluoresceina i żwacza, co czyni je idealnymi do badań nad wychwytem komórkowym i endosomalnym transportem wirusa.
Wirus dengi oznaczony jako Alexa ułatwi zrozumienie patogenezy dengi. Więc zacznijmy. Przed reakcją znakowania należy przygotować świeży bufor do znakowania i zatrzymać odczynnik zgodnie z pisemnym protokołem i oczyścić wirusa dengi za pomocą poduszki sacharozy, dodać odpowiednią objętość oczyszczonego wirusa dengi do buforu znakującego w mikroprobówce wirówkowej, aby osiągnąć stężenie 300 milionów jednostek tworzących na mililitr.
Można to proporcjonalnie zwiększyć. Do etykietowania partii wirusa. Rozpuść liofilizowany barwnik podłogowy Alexa do jednego milimola w buforze etykietującym tuż przed reakcją znakowania.
Począwszy od tego etapu, zminimalizuj ekspozycję na światło. W celach demonstracyjnych barwnik podłogowy Alexa pozostanie niezabezpieczony przed światłem 800 mikrolitrów jednego milimola. Alexa flow die do rozcieńczonego wirusa dengi, delikatnie mieszając końcówką micro pipet.
Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem zmieszanym przez delikatne inwersje co 15 minut po jednej godzinie, krótko odwirować probówki. 800 mikrolitrów subregionu, delikatnie wpatrując się mikropipetą, inkubować przez dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej. Chroniony przed światłem sprawia, że delikatne inwersje co 15 minut.
W międzyczasie utożsamia kolumnę oczyszczającą z 25 mililitrami buforu HNE. Po godzinnej inkubacji nałóż znakowanego wirusa na kolumnę i zacznij zbierać przepływ. Wypełnij kolumnę buforem HNE.
Gdy cały znakowany wirus dostanie się do matrycy, odrzuć pierwsze 2,5 mililitra przepływu i zbierz kolejne dwa mililitry znakowanej frakcji wirusa. Ecor i zobaczył oczyszczonego, oznakowanego wirusa w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Określ tytuł znakowanego wirusa za pomocą testu płytki nazębnej.
W typowym eksperymencie należy zaobserwować mniej niż dziesięciokrotny spadek tytułu wirusa. Po znakowaniu należy przeprowadzić test immunofluorescencyjny w celu oceny stopnia znakowania. W tym celu należy zliczyć komórki wirusa za pomocą hemocytometru i odpowiedniej objętości komórek do pożywki wzrostowej, aby osiągnąć gęstość 50 000 komórek na mililitr.
Zobacz jeden mililitr komórek wirusa na studzienkę w czterodołkowej płytce zawierającej sterylną szklaną osłonę. Spać. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Wyjąć płytkę z inkubatora i odessać supinator ze studni, w rzeczywistości komórek z około jednym MOI znakowanego wirusa w objętości stu mikrolitrów przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Usunąć inokulum i przemyć komórki 0,5 mililitra buforu PBS na studzienkę. Spirytus dis i powtórz tę procedurę jeszcze dwa razy. Przymocuj komórki za pomocą 200 mikrolitrów 3% na wielokrotną wysokość na studzienkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
Umyj komórki trzykrotnie 0,5 mililitra buforu PBS na studzienkę. Aliuj komórki roztworem izacyjnym w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Zdejmij pokrywę do spania ze studni za pomocą cienkich kleszczy.
Spuść nadmiar płynu, przesuwając krawędź pokrywy. Poślizgnij się na białym papierze. Umieść stronę komórki okładki.
Prześpij się na 25 mikrolitrach przeciwciała białkowego denga e na kawałku perfum. Inkubować przez godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem. Następnie przenieś szkiełko nakrywkowe na płytkę sześciodołkową i dodaj dwa mililitry buforu do płukania na olej.
Zassać supinat. Powtórz te kroki prania jeszcze dwa razy po ostatnim praniu. Usuń szkiełko nakrywkowe ze studzienki za pomocą drobnego fp.
Spuść nadmiar płynu, zanurzając krawędź pokrowca. Poślizgnij się na papierowej chusteczce. Umieść stronę komórki okładki.
Prześpij się na 25 mikrolitrach podłogi Alexa na osiem osiem wtórnych przeciwciał przeciw myszy na kawałku perfum. Inkubować przez 45 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem po zakończeniu inkubacji, przenieść sen pokrywy na płytkę sześciodołkową i umyć komórki trzykrotnie dwoma mililitrami buforu do płukania po ostatnim myciu. Usuń szkiełko nakrywkowe ze studzienki i spłucz raz w zjonizowanej wodzie.
Odcedź nadmiar płynu, zanurzając go w papierze. Wytrzyj, zamontuj szkiełko nakrywkowe na lampie mikroskopowej za pomocą ośmiu mikrolitrów łagodnego roztworu montażowego. Pozwól, aby roztwór montażowy ustawił powietrze w nocy o cztery stopnie Celsjusza.
Próbka jest teraz gotowa do wizualizacji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego. Umieść małą kroplę olejku immersyjnego na powierzchni pokrowca do spania i zamocuj mikroskop. Przesuń do stolika mikroskopu.
Dostosuj stolik, aż obiektyw mikroskopu zetknie się z olejkiem immersyjnym. Aby uzyskać wyraźny obraz, wyłącz światła otoczenia za pomocą oprogramowania Zes Zen. Kliknij na kran oczny, aby bezpośrednio obserwować próbkę przez okular mikroskopu.
Znajdź wypełnienie komórkami i dostosuj fokus. Teraz przejdź do trybu akwizycji. Aby zminimalizować przesłuchy między opadami kwiatów, wybierz osobne ścieżki dla podłogi Alexa 4 8 8 i skończonej czwórki.
Barwniki i akwizycje zestawów do sekwencyjnego wzbudzania i wykrywania. Dostosuj wzmocnienie mocy lasera i przesunięcie, aby upewnić się, że obraz nie jest prześwietlony lub niedoświetlony. Przechwyć obraz i przeanalizuj obszar zainteresowania za pomocą funkcji kolokalizacji.
Współczynnik nakładania się można wykorzystać do oszacowania stopnia oznakowania wirusa dengi przez barwnik Alexa Flo. Przeprowadzono prosty test immunofluorescencyjny na komórkach wirusa, a stopień znakowania można oszacować na podstawie kolokalizacji znakowanego wirusa W przypadku białka anty e, współczynnik nakładania się barwienia przeciwciałami anty waha się od 0,65 do 0,8, co sugeruje, że około 65 do 80% wariancji zostało oznaczonych barwnikiem podłogowym Alexa. Aby procedura etykietowania zakończyła się sukcesem, ważne jest, aby przygotować bufor do etykietowania i rozpocząć szalenie na świeżo oraz odtworzyć traw podłogowy Alexa przed etykietowaniem.
Stężenie barwnika do użycia można dodatkowo zoptymalizować w zależności od potrzeb. Ta metoda znakowania horyzontalnego wirusa dengi może być potencjalnie zaadaptowana do znakowania innych wirusów. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie z etykietowaniem.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowaniu wirusa dengi przy użyciu Alexa Fluor do analizy mikroskopowej. Podejście to pozwala na wizualizacje wczesnych interakcji między wirusem a komórkami gospodarzami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirologia
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Biologia komórki
Tło
- Wirus dengi jest istotnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie.
- Rozumienie interakcji wirus-komórka jest kluczowe dla opracowania strategii przeciwwirusowych.
- Fluorescencyjne znakowanie poprawia wizualizacje tych interakcji.
- Postępy w technologiach obrazu umożliwiają szczegółowe badania.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody znakowaniu wirusa dengi.
- Wizualizacja interakcji między wirusem dengi a komórkami gospodarzami.
- Poprawa zrozumienia wczesnych etapów infekcji wirusowej.
Stosowane metody
- Przygotowanie niezbędnych buforów do znakowaniu.
- Oczyszczanie wirusa dengi za pomocą poduszki sacharozowej.
- Rekonstytucja barwnika Alexa Fluor w buforze do znakowaniu.
- Znakowanie wirusa konkretnym stężeniem barwnika.
Główne wyniki
- Sukcesywne fluorescencyjne znakowanie wirusa dengi.
- Wizualizacja interakcji wirus-komórka pod mikroskopem.
- Ocenienie efektywności znakowaniu poprzez test immunofluorescencyjny.
- Ponowne titrowanie znakowanego wirusa za pomocą testu płytkowego.
Wnioski
- Metoda zapewnia prosty i skuteczny sposób znakowaniu wirusa dengi.
- Fluorescencyjne znakowanie pomaga w badaniu interakcji wirus-gospodarz.
- Ta technika może być zastosowana do innych badań nad wirusami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct fluorescent labeling of dengue virus with Alexa Fluor enables precise visualization of virus-cell interactions, supporting early-stage mechanistic studies in infectious disease research. This capability enhances predictive confidence in target validation and informs translational strategies for antiviral and vaccine development. The method's compatibility with live virus and quantitative imaging strengthens its value across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of virus entry and trafficking mechanisms in host cells.
- Supports biological de-risking by clarifying early infection events relevant to pathogenesis.
- Facilitates functional target validation through visualization of labeled virus interactions.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized approach for preparing fluorescently labeled virus for imaging-based assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of labeling efficiency via immunofluorescence and plaque assays.
- Enables scalable batch labeling suitable for high-content screening platforms.
- Supports reliable evaluation of antiviral compound effects on virus-cell entry and trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by preserving virus infectivity post-labeling.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of intervention strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative imaging readouts.
- Facilitates biomarker alignment through colocalization analysis of viral and cellular markers.
Pipeline & Workflow Integration
This labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis-driven studies, assay development, and translational research on viral pathogenesis.
- Discovery Biology: Advances mechanistic understanding of virus-host interactions through direct visualization and quantitative colocalization.
- Screening: Delivers reproducible, labeled virus preparations for imaging-based screening of antiviral candidates.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as overlap coefficients and infectivity titers for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains functional virus for use in disease-relevant cellular models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable protocol for labeling other enveloped viruses in diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage virology research.
- Operational Value: Standardizes virus labeling and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and vaccine candidates based on quantitative imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to high-quality imaging platforms and analytical software for colocalization studies.
- Demands rigorous buffer preparation and dye handling to ensure reproducibility and minimize cytotoxicity.
- Adaptable to other enveloped viruses with protocol optimization for specific viral systems.
- Dependent on maintaining virus viability and labeling efficiency for downstream applications.
