Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie analizy metylacji DNA dinukleotydów CpG poprzez sekwencjonowanie genomiczne DNA konwertowanego siarczynem. Osiąga się to najpierw poprzez denaturację dwuniciowego DNA, aby umożliwić zajście reakcji konwersji siarczynowej. Drugim krokiem jest konwersja wszystkich niemetylowanych cytozyn w DNA genomicznym do uracylu poprzez deacetylację siarczynową.

Reakcja ta składa się z trzech etapów. Pierwszym jest sulfatowanie reszty cytozyny poprzez przyłączenie siarczynu B do wiązania podwójnego między piątym a szóstym atomem węgla. Po drugie, hydrolityczna deaminacja cytozyny przez pochodną siarczynu prowadzi do powstania SSL pochodnej siarczynowej, a po trzecie, usunięcie grupy sulfonowej za pomocą obróbki alkalicznej skutkuje powstaniem reszty SSL.

Następnie region docelowy jest amplifikowany za pomocą specyficznych starterów do konwersji pirosiarczynowej oraz reakcji PCR. Ostatnim etapem jest klonowanie i sekwencjonowanie produktu PCR, aby uzyskać rozdzielczość pojedynczego nukleotydu dla metylacji w całej cząsteczce DNA. Ostatecznie wyniki wykazują metylację DNA dinukleotydów CpG w genomowym DNA poprzez wykorzystanie zwiększonej wrażliwości cytozyny w porównaniu do 5-metylocytozyny na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwaśnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza Southern blot krwi, jest możliwość uzyskania rozdzielczości pojedynczych nukleotydów w badaniu metylacji DNA. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak rola metylacji DNA w chorobach ludzkich, na przykład w nowotworach. Aby przygotować próbki DNA do konwersji pirosiarczynowej, należy najpierw inkubować 2 µg genomowego DNA z pirosiarczynem, buforem do lizy DNA, do uzyskania całkowitej objętości 18 µL, przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.

Następnie przeprowadź denaturację DNA genomowego, dodając 2 µL świeżo przygotowanego 3 M wodorotlenku sodu do uzyskania stężenia końcowego 0,3 M. Inkubuj próbki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie w temperaturze 90 °C przez dwie minuty. Po wyjęciu z bloku grzewczego natychmiast umieść probówki na lodzie na pięć minut, a następnie odwiruj je przez 10 sekund przy 10 000 G, aby upewnić się, że DNA znajduje się na dnie probówki; zdenaturowane próbki DNA są teraz gotowe do deaminacji limfocytów B, co zostanie zaprezentowane w dalszej części.

Przed przeprowadzeniem reakcji sulfatacji i deaminacji hydrolitycznej przygotuj świeże roztwory 10 mM chinolu oraz nasycony roztwór pirosiarczynu sodu o pH 5,0. Ponieważ roztwór pirosiarczynu sodu jest nasycony, mogą pozostać nierozpuszczone niewielkie grudki. Dodaj 208 µL pirosiarczynu sodu i 12 µL chinolu do 20 µL zdenaturowanego DNA, tak aby końcowa objętość wynosiła 240 µL.

Wymieszaj zawartość probówek na wortexie, a następnie wiruj przez 10 sekund, aby upewnić się, że wszystkie kropelki znajdują się na dnie probówki. Przykryj próbki olejem mineralnym. Inkubuj próbki w kąpieli wodnej w temperaturze 55 °C przez od 4 do 16 godzin, w zależności od ilości i jakości DNA przeznaczonego do konwersji.

Ważne jest, aby konwersja pirosiarczynowa odbywała się w ciemności, aby uniknąć utleniania. Po upływie odpowiedniego czasu inkubacji krótko wiruj probówki w mikrowirówce, aby upewnić się, że cała ciecz znajduje się na dnie probówki. Następnie ostrożnie odpipetuj roztwór DNA z dna probówki, nie pobierając żadnej ilości oleju mineralnego.

W kolejnych krokach nasze laboratorium wykorzystuje system oczyszczania DNA Promega Wizard. Do próbek DNA dodaj 1 mL żywicy, odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość, a następnie pipetą przenieś roztwór do strzykawki podłączonej do kolumny odsolającej. Na koniec, aby usunąć wolne jony pirosyczynu, przeprowadź DNA traktowane pirosyczynem przez kolumnę odsolającą i eluuj w 50 µL wody Milli-Q.

Kolejnym krokiem jest usunięcie grupy bisulfitowej z pierścienia uracylu poprzez odsalanie. W tym celu do każdej próbki DNA poddanej działaniu bisulfitu należy dodać 5,5 µL świeżo przygotowanego 3 M wodorotlenku sodu, aby uzyskać stężenie końcowe 0,3 M. Następnie próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.

Próbki należy krótko odwirować, a następnie do każdej z nich dodać 1 µL TRNA. Roztwór należy zneutralizować, dodając octan amonu do stężenia końcowego 3 M. Następnie DNA należy wytrącić etanolem.

Dodaj 330 µL lodowatego, 100% etanolu i dokładnie wymieszaj poprzez odwracanie probówki. Pozostaw w temperaturze -20 °C od jednej godziny do całej nocy, a następnie odwiruj przy 14 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie usuń wszystkie ślady nadsączu i odparuj wytrącone DNA przez około 20 minut.

Po wysuszeniu na powietrzu osad jest prawie niewidoczny; należy zawiesić osad DNA w 50 µL 0,1 XTE lub wody i pozostawić w temperaturze pokojowej przez około dwie godziny. W tym czasie należy sporadycznie wierzgać probówki, aby upewnić się, że DNA uległo rozpuszczeniu, a następnie krótko wirować. Po rozpuszczeniu DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C od jednego do 10 lat, w zależności od ilości i jakości DNA, lub użyć natychmiast. W przypadku amplifikacji PCR najtrudniejszym aspektem tej procedury jest optymalizacja starterów.

W związku z tym przygotowano następujące wytyczne, aby pomóc zapewnić sukces w projektowaniu starterów. Aby zilustrować te wytyczne, sekwencja docelowa została poddana konwersji siarczynowej, tak że w zapisie konwertowane cytozyny pojawiają się jako niebieskie T, a niekonwertowane miejsca CpG jako czerwone cg. Startery powinny mieć długość od 24 do 30 par zasad, aby zapewnić swoistość. Startery powinny mieć podobną przewidywaną wartość TM powyżej 50 °C i nie powinny różnić się od siebie o więcej niż jeden do dwóch stopni Celsjusza.

Startery powinny zawierać wiele zasad C oraz T (w przybliżeniu 25%), aby zapewnić specyficzność konwersji. Ostatnia zasada na końcu 3' powinna być C lub T, aby zapewnić amplifikację konwertowanego D-N-A. Należy unikać obecności dinukleotydów CPG w sekwencji startera, aby uniknąć potencjalnego błędu w kierunku matryc zmetylowanych, niezmetylowanych lub niekonwertowanych. Jeśli jednak jest to nieuniknione, cytozynę w miejscu CpG należy zastąpić zasadą Y, aby pomóc zapewnić bezstronną amplifikację konwertowanego DNA.

Na koniec, jeśli jest to wymagane, zaprojektuj zestawy starterów zagnieżdżonych lub półzagnieżdżonych, aby zapewnić specyficzność lub czułość reakcji PCR. Przygotuj mieszaniny reakcyjne do amplifikacji PCR w alikwotach 25 µL w celu optymalizacji. Każda reakcja zawiera genomowe DNA przekształcone siarczynem, startery DPS, chlorek magnezu, chlorek potasu, TRIS-HCl pH 8,3 oraz polimerazę w celu przetestowania błędu amplifikacji materiału zmetylowanego lub niezmetylowanego.

Użyj kontrolnej próbki zawierającej 50% DNA zmetylowanego i 50% niezmetylowanego, w pełni przekształconej metodą konwersji bisulfitowej, aby przetestować proporcjonalność amplifikacji PCR po konwersji bisulfitowej. Przy użyciu specyficznych starterów i mieszaniny reakcyjnej PCR w termocyklerze z gradientem temperaturowym, ustaw reakcję w gradiencie plus lub minus 3 °C względem TM startera w 8–10 probówkach; wymieszaj probówki w wortexie i krótko wiruj w mikrowirówce przed umieszczeniem ich w termocyklerze. Rysunek przedstawia żel agarozowy z profilem amplifikacji PCR w gradiencie temperaturowym dla mieszaniny 50% zmetylowanego i niezmetylowanego DNA.

Amplikonami PCR są pasma oznaczone literą T w ścieżkach drugiej, piątej i ósmej, które poddano działaniu enzymu restrykcyjnego trawiącego wyłącznie zmetylowane DNA; optymalne warunki amplifikacji PCR powinny pozwolić na amplifikację amplikonów zmetylowanych i niezmetylowanych proporcjonalnie i bez stronniczości, co skutkuje równą ilością pociętego i niepociętego produktu PCR, tak jak widać tutaj. Optymalne warunki termocyklingu dla nieobciążonej amplifikacji wynoszą 55,6 °C. Stopień konwersji DNA poddanego działaniu pirosiarczynu można przeanalizować poprzez trawienie specyficznym dla cytozyny enzymem, który trawi jedynie niekonwertowane DNA w ścieżkach trzeciej, szóstej i dziewiątej.

Pełna konwersja DNA pirosiarczynem jest tutaj wskazana przez brak pociętego DNA we wszystkich trzech ścieżkach: trzeciej, szóstej i dziewiątej. Ten wykres dysocjacji w czasie rzeczywistym pokazuje równą proporcję zmetylowanego i niezmetylowanego DNA (pomarańczowa linia, mieszanina 50:50) w porównaniu do amplifikacji kontrolnej w pełni zmetylowanego DNA (różowa linia m) i niezmetylowanego DNA (zielona linia U), które dysocjują odpowiednio w 82,9 °C i 86,9 °C. Wskazuje to na brak błędu amplifikacji wynikającego z temperatury, w której dysocjują poszczególne cząsteczki.

Powstałe fragmenty PCR z amplifikacji próbek poddanych traktowaniu pirosiarczynem można zwizualizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i poddać sekwencjonowaniu. Przedstawiono tutaj ślad sekwencyjny z trzech różnych linii komórkowych z zaznaczonymi na żółto miejscami CpG; linia komórkowa X wykazuje 100% metylacji we wszystkich trzech miejscach CpG, podczas gdy linie komórkowe Y i Z wykazują różny stopień metylacji, co widać po nakładających się sygnałach G i A. Rysunek 4A przedstawia ślad sekwencyjny z trzech różnych linii komórkowych z zaznaczonymi na żółto miejscami CpG.

Po bezpośrednim sekwencjonowaniu poszczególnych klonów stan metylacji pojedynczych cząsteczek można przedstawić w formie tabeli na mapie bisulfitowej. Aby zwizualizować heterogeniczność metylacji, gęstość metylacji w poszczególnych miejscach CpG zaznaczono kolorem czerwonym. Na tej reprezentatywnej mapie bisulfitowej przedstawiono wysokoprzepustową ilościową analizę metylacji próbki.

Zastosowanie technologii sequenome epi typer pozwala na uzyskanie specyficznego widma zależnego od obecności zmetylowanych cytozyn, co przedstawiono w przykładzie na rysunku 5A. Podsumowanie proporcji w próbce może następnie zostać wyekstrapolowane w formie epigramu na rysunku 5B. Ten przykład pokazuje procent metylacji DNA w każdym miejscu CpG dla czterech różnych linii komórkowych. Na koniec, po opracowaniu epigramu, można wyprowadzić wykres podsumowujący metylację na rysunku 5C. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny epigenetyki do zgłębiania metylacji DNA i jej roli w chorobach ludzi.