Metylacja DNA: modyfikacja i analiza wodorosiarczynów

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie analizy metylacji DNA dinukleotydów CPG poprzez sekwencjonowanie genomu DNA przekształconego w siarczyny. Osiąga się to poprzez pierwszą denaturację dwuniciowego DNA, dzięki czemu może zajść reakcja konwersji wodorosiarczynu. Drugim krokiem jest przekształcenie wszystkich niemetylowanych cytozyn w genomowym DNA w uracyl przez deaminację bisiarczynów.

Ta reakcja składa się z trzech faz. Pierwszym z nich jest zasiarczenie reszty cytozyny przez dodanie siarczynu B do pięciu sześciu podwójnych wiązań. Po drugie, hydrauliczna deaminacja cytozyny przez pochodną siarczynu wytwarza SSL przez pochodną siarczynu, a po trzecie, usunięcie grupy sulfonianowej przez traktowanie alkaliami powoduje powstanie reszty SSL.

Następnie region docelowy jest amplifikowany przez startery specyficzne dla konwersji bisiarczynów i amplifikację PCR. Ostatnim krokiem jest klonowanie i sekwencjonowanie produktu PCR w celu uzyskania rozdzielczości pojedynczego nukleotydu do metylacji w cząsteczce DNA. Ostatecznie wyniki wskazują na metylację dinukleotydów CPG w genomowym DNA poprzez wykorzystanie zwiększonej wrażliwości cytokin w porównaniu z pięcioma cytozynami metylowymi na deaminację dwusiarczanową w warunkach kwaśnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza krwi południowej, jest to, że może ona umożliwić rozdzielczość metylacji d w postaci pojedynczego nukleotydu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak rola metylacji DNA w chorobach ludzkich, takich jak rak. Aby przygotować próbki DNA do konwersji bisiarczynu, najpierw inkubuj dwa mikrogramy genomowego DNA z bisiarczynem, buforem do lizy DNA i całkowitą objętością 18 mikrolitrów przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie denaturacja genomowego DNA poprzez dodanie dwóch mikrolitrów świeżo przygotowanego trzymolowego wodorotlenku sodu do końcowego stężenia 0,3 molowego. Próbki inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w łaźni wodnej, a następnie inkubować w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez dwie minuty. W bloku grzewczym natychmiast umieść probówki na lodzie na pięć minut, odwiruj probówki przez 10 sekund do 10 000 G, aby upewnić się, że DNA znajduje się na dnie probówki, próbki DNA denaturacji są teraz gotowe do deaminacji walki komórek B, która zostanie zademonstrowana w następnej kolejności.

Przed reakcjami zasiarczania i deaminacji hydrolitycznej należy przygotować świeże roztwory 10-milimolowego chinolu i nasyconego meta sodu przez siarczyn o pH 5,0. Ponieważ meta sodu przez siarczyn jest roztworem nasyconym, małe grudki mogą pozostać nierozpuszczone. Dodaj meta sodu przez siarczyn 208 mikrolitrów i chinol 12 mikrolitrów do denaturacji DNA 20 mikrolitrów w końcowej objętości 240 mikrolitrów.

Wiruj probówki i wiruj przez 10 sekund, aby upewnić się, że wszystkie kropelki znajdują się na dnie probówki. Na próbki nałożyć olej mineralny. Próbki należy inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez cztery do 16 godzin, w zależności od ilości i jakości DNA, które ma zostać przekształcone.

Ważne jest, aby konwersja wodorosiarczynu odbywała się w ciemności, aby uniknąć utleniania. Pod koniec odpowiedniego czasu inkubacji należy krótko obrócić probówki w mikrowirówce, aby upewnić się, że cała ciecz znajduje się na dnie probówki. Następnie ostrożnie odpipetować roztwór DNA z dna probówki, nie pobierając oleju mineralnego.

W kolejnych krokach nasze laboratorium korzysta z systemu oczyszczania DNA promega wizard. Dodaj jeden mililitr żywicy do próbek DNA, odwróć probówkę, aby wymieszać, a następnie pipetuj roztwór do strzykawki podłączonej do kolumny odsalającej. Na koniec, aby usunąć wszelkie wolne jony bisiarczynowe, przepuść DNA potraktowane bi-siarczynem przez kolumnę odsalającą i wlej 50 mikrolitrów wody Milli Q.

Następnym krokiem jest usunięcie strychu wodorosiarczynowego z pierścienia uracylowego poprzez odsalanie. Aby to osiągnąć, dodaj 5,5 mikrolitra świeżo przygotowanego trzymolowego wodorotlenku sodu do każdej próbki DNA poddanej działaniu wodorosiarczynu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,3 mola. Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Krótko odwirować próbki, a następnie dodać jeden mikrolitr TRNA do każdej próbki. Zneutralizować roztwór, dodając octan amonu do końcowego stężenia trzech molowych. Następnie etanol wytrąca DNA.

Dodaj lodowato zimny, 100% etanol 330 mikrolitrów i dobrze wymieszaj przez odwrócenie. Pozostaw w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na godzinę do nocnego wirowania w temperaturze 14 000 GS przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń wszystkie ślady supernatantu i wysusz wytrącone DNA na powietrzu przez około 20 minut.

Po wysuszeniu na powietrzu prawie niemożliwe jest ponowne zawieszenie osadu DNA w 50 mikrolitrach 0,1 XTE lub pozostawienie wody w temperaturze pokojowej na około dwie godziny w tym czasie, od czasu do czasu wiruj probówki, aby upewnić się, że DNA się rozpuści, a następnie szybko wiruj. Po rozpuszczeniu DNA może być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres od jednego do 10 lat, w zależności od ilości i jakości DNA lub może być natychmiast zużyte. W przypadku amplifikacji PCR optymalizacja startera jest najtrudniejszym aspektem tej procedury.

W związku z tym przedstawiono następujące wytyczne, aby zapewnić pomyślne zaprojektowanie podkładu. Aby zilustrować te wytyczne, sekwencja docelowa została przekształcona przez siarczyny, tak że po zapisaniu przekształcone cytozyny pojawiają się jako niebieskie T, a nieprzekształcone miejsca CPG pojawiają się jako czerwone startery CGS powinny mieć długość od 24 do 30 par zasad, aby zapewnić swoistość. Startery powinny mieć podobnie przewidywaną TM powyżej 50 stopni Celsjusza i nie różnić się o więcej niż jeden do dwóch stopni Celsjusza.

Startery powinny zawierać wiele zasad o sile około 25% C do T, aby zapewnić specyficzność konwersji. Ostateczna zasada, zgodnie z którą trzy główne końce powinny być C do T, aby zapewnić amplifikację przekształconych dinukleotydów D-N-A-C-P-G, powinna być unikana w sekwencji startera, aby uniknąć potencjalnego odchylenia w kierunku metylowanych niemetylowanych lub nieprzekształconych matryc. Jeśli jednak jest to nieuniknione, cytozyna w miejscu CPG powinna zostać zastąpiona literą Y, aby zapewnić bezstronną amplifikację przekształconego DNA.

Na koniec zaprojektuj zagnieżdżone lub częściowo zagnieżdżone zestawy starterów, aby zapewnić specyficzność lub czułość reakcji PCR, jeśli jest to wymagane. Przygotować mieszaniny reakcyjne amplifikacji PCR w podwielokrotnościach 25 mikrolitrów w celu optymalizacji. Każda reakcja zawiera przetworzone siarczynami genomowe DNA DPS startery, chlorek magnezu, chlorek potasu, trichlorowodorek potasu, polimerazę anac pH 8,3 do badania odchylenia amplifikacji materiału metylowanego lub niemetylowanego.

Użyj 50 50 metylowanej, niemetylowanej, w pełni przekształconej bisiarczynu próbki kontrolnej do zbadania proporcjonalnej amplifikacji PCR z konwersją bisiarczynu. Specyficzne startery i mieszanina reakcyjna PCR w termocyklerze z gradientem temperatury ustawiają reakcję przebiegową w gradiencie plus minus trzy stopnie Celsjusza od TM startera na osiem do 10 probówek, wirują probówki i krótko wirują w mikrowirówce przed umieszczeniem ich w termocyklerze. Ten rysunek przedstawia agrożel z profilem amplifikacji PCR w gradiencie temperatury z mieszaniny 50% metylowanego i niemetylowanego DNA.

Amplikony i linie PCR oznaczone pasami T dwa, pięć i osiem zostały potraktowane enzymem restrykcyjnym, który będzie trawił tylko metylowane DNA, optymalne warunki amplifikacji PCR powinny amplifikować metylowane i niemetylowane amplikony proporcjonalnie i bez odchylenia, co daje równą ilość pociętego i niepociętego produktu PCR, jak pokazano tutaj. Optymalne warunki termocyklingu dla nieobciążonego wzmocnienia to 55,6 stopni Celsjusza. Całkowita konwersja bisiarczynowego DNA może być analizowana przez trawienie za pomocą enzymu specyficznego dla miejsca cytozyny, który trawi tylko nieprzekształcone pasy DNA trzecie, szóste i dziewiąte.

Na pełną konwersję dwusiarczynowego DNA wskazuje tutaj brak przeciętego DNA na wszystkich trzech liniach, pasach trzecim, szóstym i dziewiątym. Ten wykres dysocjacji w czasie rzeczywistym pokazuje równą proporcję zmieszanego i niemetylowanego DNA czerwono-pomarańczowej linii 50 50 w porównaniu z amplifikacją kontrolną w pełni zmetylowanej różowej linii m i niemetylowanej, zielonej linii DNA U, które dysocjują odpowiednio w temperaturze 82,9 stopni Celsjusza i 86,9 stopni Celsjusza. Oznacza to, że nie ma odchylenia amplifikacji w oparciu o temperaturę, w której różne cząsteczki będą dysocjować.

Powstałe fragmenty PCR z amplifikacji próbek poddanych działaniu bisiarczynu można uwidocznić za pomocą elektroforezy w żelu agros i sekwencjonować. Bezpośrednio pokazany tutaj jest ślad sekwencji z trzech różnych linii komórkowych z miejscami CPG zaznaczonymi na żółto, linia komórkowa X wykazuje 100% metylację we wszystkich trzech miejscach CPG, gdzie linie komórkowe Y i Z wykazują różne stopnie metylacji, co widać po nakładających się sygnałach GA pokazanych tutaj. Rysunek czwarty A to ślad sekwencji z trzech różnych linii komórkowych z miejscami CPG zaznaczonymi na żółto.

Po bezpośrednim sekwencjonowaniu poszczególnych klonów, stan metylacji poszczególnych cząsteczek można przedstawić w tabeli na mapie bisiarczynów. Aby zobrazować niejednorodność metylacji, gęstość metylacji w poszczególnych miejscach CPG jest pokazana na czerwono. Na tej reprezentatywnej mapie bisiarczynów wysokoprzepustowa ilościowa analiza metylacji próbki.

Korzystając z technologii sequenome epi typer, można uzyskać określone spektrum zależne od obecności metylowanych cytozyn, jak pokazano w tym przykładzie Rysunek piąty A.Podsumowanie proporcji w próbce można następnie ekstrapolować w postaci epigramu rysunek piąty B. Ten przykład pokazuje procent metylacji DNA w każdym miejscu CPG dla czterech różnych linii komórkowych. Wreszcie, wykres podsumowania metylacji rysunek piąty C można wyprowadzić z fraszki Po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się epigenetyką do zbadania metylacji DNA i jej roli w chorobach człowieka.