Name: Wykorzystanie podejścia porównawczego gatunków do zbadania neurobiologii reakcji ojcowskich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Odkryj podejście porównawcze gatunków do badania neurobiologii zachowań ojcowskich u myszy Peromyscus californicus i Peromyscus maniculatus. Metoda pozwala identyfikować korelacje między immunoreaktywnością wazopresyny a opieką nad potomstwem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały sfinansowane z grantu nr 0723341 (przyznanego KGL) przez National Science Foundation. Jesteśmy również wdzięczni za wsparcie zapewnione przez program stypendialny Schapiro Undergraduate Research Fellowship oraz Katedrę Psychologii na Randolph–Macon College. Na koniec dziękujemy Craigowi Kinsleyowi za wkład w ramach współpracy przy tych badaniach oraz Amandzie Rzucidlo za pomoc w przygotowaniu laboratorium R-MC na potrzeby tego artykułu wideo.

1. Identyfikacja modelu zwierzęcego
<ol>
	<li>Mysz kalifornijska (Peromyscus californicus) jest idealnym modelem do badania odpowiedzi ojcowskich. Jak widać, mysz ta pielęgnuje młode tak samo jak samice – kuca nawet nad nimi, sprawiając wrażenie, jakby młode ssały mleko. Zachowanie myszy kalifornijskiej porównuje się z gatunkiem z tego samego rodzaju, myszą pospolitą (Peromyscus maniculatus), która wykazuje niewielkie zainteresowanie młodymi, często próbując uciec lub nawet je zaatakować. (Rysunek 1 przedstawia interakcje tych gatunków z młodymi).</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu modelu gatunkowego należy utworzyć odpowiednie grupy. W niniejszym badaniu wykorzystano biologicznych ojców, samce dziewicze bez doświadczenia w opiece oraz samce dziewicze z ograniczoną ekspozycją na młode (eksponowane na młode lub ojcowie zastępczy) obu gatunków, aby ocenić zarówno wrodzone, jak i nabyte cechy ojcowskie. W tym konkretnym badaniu wszystkie grupy poddano również ekspozycji na sztuczną mysz, aby upewnić się, że interakcje społeczne były specyficzne dla młodego osobnika, a nie stanowiły ogólnej odpowiedzi na jakikolwiek przedmiot umieszczony w klatce (Patrz Rysunek 2).</li>
	<li>Przed zbadaniem czynników neurobiologicznych istotne jest potwierdzenie, że wybrane gatunki wykazują wyraźne różnice w analizowanym zachowaniu. W tym badaniu samce umieszcza się w klatce z młodym osobnikiem na pięć minut, a do oceny zachowań, takich jak czas latencji do podejścia do młodego osobnika oraz czas kontaktu z nim, wykorzystuje się etogram zachowań ojcowskich (przykład etogramu znajduje się w Tabeli 1). W przypadku zaobserwowania reakcji agresywnych młody osobnik jest natychmiast usuwany. Sesje te są często nagrywane wideo, co pozwala na późniejszą przeprowadzenie dokładnej analizy behawioralnej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Po przeprowadzeniu standardowej perfuzji każdej myszy (protokół w załączniku), mózgi zostają usunięte, aby można było wykonać ich przekroje w konkretnym obszarze zainteresowania (pokazanie mózgu).</li>
	<li>Standardowy atlas mózgu myszy (pokazanie atlasu) jest wykorzystywany do zlokalizowania jądra przykomorowego w podwzgórzu – obszaru znanego z wysokiej zawartości komórek produkujących neuropeptyd będący przedmiotem niniejszego badania – wazopresynę (AVP).</li>
	<li>Mózg zostaje następnie zablokowany i zamocowany na uchwycie mrożącym, aby tkanka zamarzła przed pocięciem mikrotomem. Mózg jest cięty w trybie wstępnym do momentu zidentyfikowania konkretnych punktów orientacyjnych, a następnie ustawiana jest docelowa grubość przekrojów mózgu, w tym przypadku 30 µm, dla sekcji wykorzystywanych do analizy.</li>
	<li>Przekroje mózgu są ostrożnie umieszczane w płytkach wielodołkowych wypełnionych solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS); (protokół przygotowania PBS w załączniku; należy pamiętać, że jest to tylko jeden z przykładów standardowego protokołu immunocytochemicznego).</li>
</ol>
3. Immunocytochemia
<ol>
	<li>W trakcie poszczególnych etapów tego procesu (patrz załączony protokół) kluczowe jest posiadanie precyzyjnych umiejętności pipetowania, aby zapewnić dokładne pomiary odczynników i innych składników istotnych dla tej techniki (pokazanie studenta pipetującego).</li>
	<li>Pierwszym krokiem w tym procesie jest płukanie mózgów, które polega na trzykrotnej lub pięciokrotnej wymianie PBS w płytkach wielodołkowych; pomiędzy każdym płukaniem płytki są umieszczane na wytrząsarce przez 10 minut (pokazanie studenta wymieniającego PBS i umieszczającego płytki na wytrząsakach).</li>
	<li>Następnie skrawki mózgu są eksponowane na roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce (pokazanie procesu).</li>
	<li>Po kolejnym płukaniu skrawki mózgu są eksponowane na przeciwciało drugorzędowe przez jedną godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie płukane.</li>
	<li>Następnie mózgi są eksponowane na roztwór kompleksu awidyny i biotyny w celu przygotowania do wizualizacji komórek pozytywnych pod kątem neurochemicznym.</li>
	<li>W ostatnim kroku wizualizacji mózgi są eksponowane na DAB. Jest to produkt niebezpieczny i zawsze należy z nim obchodzić się ostrożnie. Jak widać tutaj, skrawki mózgu zaczynają ciemnieć na Twoich oczach (pokazanie procesu).</li>
	<li>Po ekspozycji na DAB mózgi przechodzą ostatnią serię płukań, a następnie są ostrożnie umieszczane na preparatowych szkiełkach z powłoką adhezyjną i pozostawiane do wyschnięcia przez noc (pokazanie umieszczania skrawka mózgu na szkiełku; patrz załącznik w celu zapoznania się z protokołem dla szkiełek z powłoką).</li>
	<li>Szkiełka są następnie przejrzyszczane poprzez serię płukań wodą destylowaną i alkoholem, a na koniec zanurzane w Citrosolv przed nałożeniem szkiełek zakrywowych i przechowywaniem w kasecie na preparaty w celu ich zabezpieczenia (pokazanie różnych aspektów tego procesu; patrz załącznik w celu zapoznania się z procesem przejrzyszczania).</li>
</ol>
4. Neurokwantyfikacja
<ol>
	<li>Po wyschnięciu preparatów można poddać je ocenie przy użyciu specjalistycznego oprogramowania do neurokwantyfikacji. W tym przypadku wykorzystano oprogramowanie Bioquant do ilościowego oznaczenia komórek i włókien wykazujących obecność wazopresyny w jądrze przykomorowym mózgów myszy (pokaż oprogramowanie na ekranie... oraz mikroskop).</li>
	<li>Konkretny obszar zainteresowania jest identyfikowany za pomocą opcji pomiarowych oprogramowania w celu ustalenia pola widzenia dla neurokwantyfikacji. Ważne jest, aby dla każdego zwierzęcia analizować pole widzenia o jednakowej wielkości (pokaż studenta wykonującego tę czynność).</li>
	<li>Tutaj widoczne są ciemno zabarwione, immunoreaktywne ciała komórek i włókna wazopresyny. Ze względu na trudność w liczeniu lub śledzeniu tej tkanki, specjalna funkcja tego oprogramowania wykorzystuje progowanie światła do określenia całkowitej ilości dodatnio zabarwionej tkanki w wyznaczonym obszarze zainteresowania. Progowanie to informuje, jaka część określonego obszaru zawierała tkankę wykazującą obecność wazopresyny (pokaż wartość danych na ekranie komputera).</li>
</ol>
5. Analiza behawioralna
<ol>
	<li>Jeśli nagrania wideo będą oceniane przez więcej niż jednego obserwatora, ważne jest ustalenie niezawodności międzyoceniającej (inter-rater reliability), aby upewnić się, że obserwatorzy oceniają zachowania w spójny sposób. Do właściwej sesji oceniania należy przygotować arkusz oceniania zachowań, który umożliwi łatwe zapisywanie wyników podczas sesji obserwacyjnych (przykład arkusza oceniania znajduje się w Tabeli 2).</li>
	<li>W przypadku zachowań, które nie są szybkie reakcjami epizodycznymi, analiza mikrosekwencyjna może ujawnić subtelności dotyczące przebiegu konkretnych reakcji. Na przykład zachowanie pielęgnacyjne składa się z łańcucha bardzo szybkich reakcji. Chociaż jedną z opcji jest zwykłe rejestrowanie występowania i czasu trwania pielęgnacji, inną jest dokumentowanie łańcucha zdarzeń towarzyszących tej reakcji. Korzystając z oprogramowania do mikrosekwencjonowania, obserwatorzy oceniają występowanie konkretnego zachowania w każdej sekundzie, zgodnie z poleceniami programu (pokaż oprogramowanie i wideo).</li>
	<li>Po zakończeniu zbierania danych określa się interesujące parametry i analizuje odpowiednie wyniki behawioralne. Przykładami mogą być całkowity czas spędzony w kontakcie z młodym lub liczba zakłóceń w sekwencji pielęgnacyjnej (pokaż komputer z arkuszem kalkulacyjnym z wprowadzonymi danymi dla każdego zwierzęcia).</li>
	<li>Po ocenieniu zachowania ważne jest potwierdzenie, że dwa gatunki wykazały różne strategie reakcji w odniesieniu do badanego zachowania. W tym przypadku myszy jeleniowate z Kalifornii powinny wykazywać więcej zachowań ojcowskich niż pospolite myszy jeleniowate. Dodatkowo, różne miary behawioralne można skorelować z pomiarami mózgu, aby uzyskać pełniejszy obraz istotnych wpływów.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
<ol>
	<li>Aby zwalidować model, dane powinny jasno wskazywać, że dwa gatunki wykazywały odmienne zachowania w zakresie analizowanego parametru. W tym przypadku widać, że samce P. californicus poświęcały więcej czasu na pielęgnację i kucanie nad młodymi, co stanowi dwie charakterystyczne cechy reakcji ojcowskich (patrz Rycina 4).</li>
	<li>Aby ustalić, czy analizowana zmienna neurobiologiczna jest istotna w reakcjach ojcowskich, ilościowo określono ilość tkanki pozytywnej na wazopresynę (AVP) w kilku istotnych obszarach mózgu; jak widać, u ojcowskich osobników P. californicus w kilku z tych obszarów mózgu stwierdzono więcej tkanki immunopozytywnej (patrz Rycina 5).</li>
	<li>W powiązanym badaniu z wykorzystaniem analizy mikrosekwencjonowania postawiono hipotezę, że ojcowskie myszy kalifornijskie będą wykazywać mniejszy poziom lęku niż ich odpowiedniki, które nie miały potomstwa; w konsekwencji, po wystawieniu na zapach drapieżnika, u ojców odnotowano mniej przerw w sekwencji pielęgnacyjnej niż u osobników dziewiczych (patrz Rycina 6).</li>
</ol>
<img alt="Eksperyment dotyczący zachowań opiekuńczych u myszy; obserwacja działań pielęgnacyjnych i eksploracyjnych; obecność młodych myszy." src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: (A) Samiec myszy kalifornijskiej wykazujący reakcje ojcowskie wobec obcego młodego osobnika tego samego gatunku. (B) Samiec myszy jeleniej wykazujący ostrożne podejście (postawa „stretch attend”) i reakcję unikania w obecności obcego młodego osobnika tego samego gatunku. Uwaga: W tych ocenach interakcji społecznych, jeśli samiec wykazuje agresywne reakcje wobec młodego osobnika, eksperymentatorzy natychmiast uderzają w górną część klatki, aby odwrócić uwagę samca. W tym momencie sesja zostaje zakończona, a młody osobnik jest usuwany, sprawdzany pod kątem obrażeń i oddawany matce. W naszym laboratorium rzadko obserwuje się to u samców P. californicus, lecz sporadycznie u P. maniculatus; jednak uważna obserwacja i natychmiastowa interwencja zapobiegają wyrządzeniu krzywdy zwierzętom.
<img alt="Badanie behawioralne myszy z zabawką w zamkniętym siedlisku; analiza eksperymentu z interakcją gryzoni." src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Mysz kalifornijska wchodząca w interakcję z zabawką w kształcie myszy; większość osobników próbowała gryźć te bodźce.
<img alt="Schemat badania zachowania samców: grupy obejmują ojców biologicznych, dziewicze kontrole oraz ojców zastępczych." src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Projekt eksperymentalny badania; w każdej grupie dla każdego gatunku znajdowało się około 6 zwierząt.
<img alt="Schemat pośredniej immunohistochemii w porównaniu z immunofluorescencją, białka, przeciwciała, tkanki komórkowe." src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Graficzne przedstawienie procesu immunocytochemii.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający czas trwania zachowań ojcowskich u P. californicus i P. maniculatus; reakcje obejmują zbliżanie się, pielęgnację, strAtt i kucanie." src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reakcje ojcowskie u myszy kalifornijskiej i myszy jeleniowatej; u myszy kalifornijskiej zaobserwowano więcej reakcji ojcowskich (pielęgnacja, kucanie, szybsze zbliżanie się). U myszy jeleniowatej zaobserwowano więcej zachowań typu stretch attend (reakcja stresowa).
<img alt="Wykres słupkowy immunoreaktywności AVP; włókna w PVN, SON, BNST; P. cal, P. man; analiza danych neuroendokrynnych." src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Immunoreaktywność wazopresyny w różnych obszarach mózgu u obu gatunków. U myszy kalifornijskich stwierdzono silniejsze barwienie w komórkach i włóknach PVN.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający przerwy w pielęgnacji w zależności od doświadczenia ojcowskiego u P. californicus: dziewice, PEV, ojcowie." src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Myszy kalifornijskie z doświadczeniem ojcowskim wykazywały mniej zakłóceń w sekwencjach pielęgnacji w obecności zapachu drapieżnika niż grupy wystawione na kontakt z młodymi oraz grupy dziewicze.

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
<li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li>
<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym artykule omówiono trzy kluczowe elementy uznawane za krytyczne dla pomyślnego przeprowadzenia badań w dziedzinie neuronauki behawioralnej: (1) reprezentatywny i walidacyjny model zwierzęcy; (2) dokładny i czuły protokół immunocytochemiczny oraz (3) właściwą analizę (obserwacyjną i statystyczną) danych behawioralnych oraz mózgowych. Błędy w choćby jednej z tych kategorii z pewnością wpłyną negatywnie na wyniki całego badania. Dlatego po starannym wyborze odpowiedniego modelu zwierzęcego należy poświęcić znaczną uwagę testom pilotażowym procedur behawioralnych i histologicznych, aby zapewnić rzetelną obserwację zachowań w badaniu, a następnie prawidłowe przetworzenie mózgów.
Jak wspomniano wcześniej, wykorzystanie gatunków porównawczych do identyfikacji mechanizmów neurobiologicznych konkretnej reakcji jest cennym podejściem metodologicznym, ponieważ technika ta nie wymaga inżynierii genetycznej ani bolesnych manipulacji chirurgicznych. W związku z tym podejście to pozwala na wykorzystanie zwierząt nienaruszonych i mniej zagrożonych. Wykorzystanie naturalnych wariacji zwierząt jest jednak wzmacniane przez wprowadzenie środowisk przypominających naturalne, nawet jeśli zwierzęta są przetrzymywane w laboratorium. Ponadto zaleca się wykonanie kolejnego kroku, jakim jest rozszerzenie badań laboratoryjnych na warunki terenowe w celu dalszej walidacji autentyczności różnic międzygatunkowych w badanym zachowaniu. Chociaż podejście porównawcze oferuje wiele zalet, ograniczeniem jest korelacyjny charakter danych; w konsekwencji należy zastosować dodatkowe techniki, takie jak manipulacje farmakologiczne, aby dalej potwierdzić rolę ukierunkowanych systemów neurobiologicznych w analizowanym zachowaniu.
Po upewnieniu się badaczy co do poprawności procedur behawioralnych, histologicznych i statystycznych, należy zadbać o to, aby warunki bytowe zwierząt pozostały stałe dla wszystkich grup, z wyjątkiem oczywiście manipulacji eksperymentalnej. Zmiany zmiennych takich jak harmonogramy oświetlenia, poziom hałasu, opiekunowie, poziom wilgotności i zapachy w laboratorium mogłyby mieć istotny wpływ na odpowiedzi neurobiologiczne zwierząt.
W niniejszym artykule przeciwciało pierwszorzędowe zostało wykorzystane do wykrywania wazopresyny, jednak można zastosować inne przeciwciała pierwszorzędowe dla wielu różnych interesujących neurochemikaliów. Jeśli badacz pracuje z nowym przeciwciałem, ważne jest przeprowadzenie badań miareczkowania w celu ustalenia optymalnego rozcieńczenia nowego przeciwciała. Bardzo często stosuje się zbyt dużą ilość przeciwciała (zgodnie z sugestią producenta), co skutkuje zbyt ciemnym zabarwieniem tkanki, uniemożliwiającym odróżnienie sygnału; ponadto nadmierne zużycie przeciwciał wiąże się z wysokimi kosztami. 
Wreszcie, jeśli do przedstawienia alternatywnych ujęć i interpretacji danych można zastosować więcej niż jedną analizę statystyczną, należy z nich skorzystać. W niniejszym badaniu wykorzystano ogólne modele liniowe, analizy korelacyjne oraz wielowymiarowe skalowanie, aby uzyskać najbardziej informacyjne ujęcia danych.

<table><tbody><tr><td>Binokularny mikroskop złożony</td><td>Motic</td><td>BA400</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do nauk biologicznych BIOQUANT</td><td>BioQuant Image Analysis Corporation</td><td>Wersja 8.40.20</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Microm International</td><td>HM525</td><td></td></tr><tr><td>Napęd konsolowy Masterflex Easy-Load L/S (pompa perfuzyjna)</td><td>Cole-Parmer</td><td>7518-00</td><td></td></tr><tr><td>Kasetka do hodowli komórkowej z 24 dołkami (poddana obróbce do hodowli tkanek; niepirogenny polistyren; sterylna)</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka przedmiotowe 25x75x1 mm</td><td>Globe Scientific, Inc.</td><td>1324W</td><td></td></tr><tr><td>szkiełko nakrywkowe nr 1 22x50 mm</td><td>Globe Scientific, Inc.</td><td>1414-10</td><td></td></tr><tr><td>Niesterylne graduate pipety transferowe z dużym balonem o pojemności 3 ml</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>70962-9</td><td>&amp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Proszek detergentowy Alconox</td><td>Alconox, Inc.</td><td>1104</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1kg</td><td>CAS 7647-14-5</td></tr><tr><td>Wodorofosforan sodu</td><td>Widmo</td><td>SO130</td><td>CAS 10049-21-5</td></tr><tr><td>fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30412</td><td>CAS 10028-24-7</td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Widmo</td><td>TR135</td><td>CAS 9002-93-1</td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td>CAS 108-88-3</td></tr><tr><td>Siarczan potasu i chromu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5926</td><td>CAS 7788-99-0</td></tr><tr><td>CitriSolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143975</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, butelki z polietylenu o wysokiej gęstości (HDPE), 200 proof, 24 x 1 pint</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>Normalne surowica kozia </td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Króliczy przeciwciało przeciwko wazopresynie, odczynnik specyficzny dla anality**</td><td>Immunostar, Inc.</td><td>20069</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciała anty-królicze IgG (H+L) oczyszczone metodą powinowactwa</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Elite Standard Vectastain ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw substratu peroksydazy DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Oryginalna żelatyna bezsmakowa (opakowanie 4 kopert), pudełko 1 uncja</td><td>Knox</td><td></td><td>Kupić w lokalnym sklepie spożywczym</td></tr><tr><td>3% nadtlenek wodoru </td><td>CareOne</td><td></td><td>Zakup w lokalnej aptece</td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Clorox</td><td></td><td>Kupić w lokalnym sklepie spożywczym</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie podejścia porównawczego gatunków do badania neurobiologii reakcji ojcowskich

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

Celem neuronauki behawioralnej jest zidentyfikowanie podstawowych czynników neurobiologicznych regulujących konkretne zachowania. W celu osiągnięcia tego celu, przy wykorzystaniu modeli zwierzęcych, wiele strategii metodologicznych wymaga zastosowania technik inwazyjnych w celu manipulacji intensywnością badanego zachowania (np. metodyzacja uszkodzeń, manipulacje farmakologiczne, techniki mikrodializy, genetycznie modyfikowane modele zwierzęce). Wykorzystanie podejścia gatunków porównawczych pozwala badaczom wykorzystać naturalnie występujące różnice w strategiach reakcji u blisko spokrewnionych gatunków. W naszym laboratorium wykorzystujemy dwa gatunki z rodzaju Peromyscus, które różnią się reakcjami ojcowskimi. Samiec myszy kalifornijskiej (Peromyscus californicus) wykazuje takie same reakcje rodzicielskie jak samica, podczas gdy jego krewny, mysz pręgowana (Peromyscus maniculatus), praktycznie nie wykazuje reakcji opiekuńczych/rodzicielskich w obecności młodych. Przedmiotem szczególnego zainteresowania w niniejszym artykule jest analiza czynników neurobiologicznych powiązanych z afiliacyjnymi reakcjami społecznymi wykazanymi przez ojców myszy kalifornijskiej. Ponieważ podejście neuronauki behawioralnej jest wieloaspektowe, krótko omówione zostaną następujące kluczowe elementy badania: identyfikacja odpowiednich gatunków do tego typu badań; gromadzenie danych do analizy behawioralnej; przygotowanie i sekcjonowanie mózgów; podstawowe etapy immunocytochemii w celu ilościowego oznaczenia immunoreaktywności wazopresyny; wykorzystanie oprogramowania do neuroobrazowania w celu kwantyfikacji tkanki mózgowej; zastosowanie mikrosekwencyjnej analizy wideo do oceny zachowania oraz, na koniec, odpowiednie analizy statystyczne w celu zapewnienia jak najbardziej rzetelnych interpretacji wyników badań.

Podejście oparte na porównaniu gatunków pozwala neurobiologom behawioralnym badać różne czynniki neurobiologiczne związane z określonymi zachowaniami, uznawanymi za charakterystyczne dla danego modelu zwierzęcego. Wykorzystując naturalnie występujące różnice w zachowaniu między blisko spokrewnionymi gatunkami, technika ta nie wymaga stosowania inwazyjnych metod w celu manipulacji ekspresją danego zachowania.

Wykorzystanie podejścia porównawczego gatunków do badania neurobiologii reakcji ojcowskich

Celem neuronauki behawioralnej jest zidentyfikowanie podstawowych czynników neurobiologicznych regulujących określone zachowania. Wykorzystanie modeli zwierzęcych w celu osiągnięcia...

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie podejścia porównawczego między gatunkami. Aby dowiedzieć się więcej o obszarach mózgu i neurochemicznych czynnikach związanych z zachowaniem ojcowskim, pierwszym krokiem jest zidentyfikowanie dwóch blisko spokrewnionych gatunków, które różnią się znacząco pod względem ekspresji badanego zachowania. Następnie obu gatunkom umożliwia się interakcję z młodymi, a następnie obserwuje się występowanie zachowań w ramach reakcji rodzicielskiej.Echogram etologiczny. Zachowania te są rejestrowane wideo do dalszej analizy. Następnym krokiem procedury jest pobranie próbek mózgu i analiza obecności tkanki immunoreaktywnej dla wazopresyny w obszarze docelowym.Następnie wykorzystuje się oprogramowanie do obrazowania neurologicznego, aby określić różnice specyficzne dla gatunków w wybranych obszarach mózgu. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące różnice międzygatunkowe w reakcjach ojcowskich oraz w immunoreaktywności wazopresyny w konkretnych obszarach mózgu. Główną zaletą zastosowania podejścia porównawczego w odniesieniu do innych istniejących metod, takich jak manipulacje farmakologiczne czy wykorzystanie gatunków zmodyfikowanych genetycznie, jest możliwość wykorzystania naturalnie występujących różnic między blisko spokrewnionymi gatunkami zamiast polegania na zachowaniach wywołanych w sposób sztuczny.Uznano, że metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat zachowań ojcowskich. Można ją również zastosować do innych zachowań, takich jak agresja, zachowania seksualne lub pielęgnacja. Przed testowaniem myszy z dwóch blisko spokrewnionych gatunków są dzielone na grupy testowe: biologicznych ojców bez doświadczenia w opiece nad potomstwem oraz osobników dziewiczych z ograniczoną ekspozycją na szczenięta.W pierwszej kolejności należy przygotować klatkę oraz system rejestracji wideo. Następnie w środku klatki umieszcza się szczenię. Po przygotowaniu wszystkich elementów do klatki z szczenięciem wprowadza się samca testowego i rejestruje zachowanie przez pięć minut.W przypadku zaobserwowania agresywnych reakcji należy natychmiast zabrać młodą mysz. Kalifornijska mysz jeleniowata pielęgnuje młode w ten sam sposób co matki, kucając nad nimi, tak że wygląda to, jakby młode ssały pokarm. Z kolei zwykła mysz jeleniowata wykazuje niewielkie zainteresowanie młodymi i często próbuje przed nimi uciec lub je zaatakować.Wszystkie grupy są również eksponowane na zabawkową mysz, aby upewnić się, że obserwowane interakcje społeczne są specyficzne dla szczenięcia, a nie stanowią ogólnej reakcji. Po okresie obserwacji należy przygotować arkusze oceny behawioralnej. W przypadku, gdy nagrania wideo będą oceniane przez więcej niż jednego obserwatora.Ważne jest ustalenie niezawodności międzyoceniającej. Przedstawiony tutaj program zachowań ojcowskich służy do punktowania zachowań. Przykłady obejmują kucanie nad szczeniętami, pielęgnację szczeniąt lub przejawianie zachowań lękowych, takich jak reakcje typu stretch attend.Oprogramowanie do mikrosekwencjonowania może być wykorzystane do ujawnienia subtelnych różnic między określonymi zachowaniami. W tym przypadku jako przykład posłużą dane pochodzące od myszy C57BL/6, które zostały poddane działaniu zapachu drapieżnika. Najpierw należy zredukować zachowania do stanów binarnych, tj. pielęgnacja versus brak pielęgnacji, a następnie wygenerować szereg czasowy.Na koniec oblicz stopień fluktuacji. Stosując z góry określony wzór, można przeoczyć wiele istotnych zachowań. Korzystając z powszechnych technik obserwacyjnych, najlepiej jest nagrać zachowania w formie wideo, aby móc analizować reakcje w zwolnionym tempie.W celu uzyskania dokładniejszych wyników, specjalistyczne oprogramowanie umożliwia badaczom analizę mikrosekwencji zachowań, dostarczając danych, które mogłyby zostać pominięte podczas obserwacji ludzkiej w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki behawioralnej, takie jak to, które układy neurochemiczne pośredniczą w konkretnych zachowaniach obserwowanych u zwierząt po ekspozycji na potomstwo. Należy zastosować standardowy protokół perfuzji w celu wyizolowania mózgu i zamrożenia go przed sekcjonowaniem; mózg należy sekcjonować w trybie przycinania (trim mode) aż do zidentyfikowania specyficznych punktów orientacyjnych.Do zlokalizowania jądra przykomorowego w podwzgórzu, obszaru znanego z obfitości komórek produkujących neuropeptyd wazopresynę (VP), wykorzystuje się standardowy atlas mózgu myszy. Po dotarciu do jądra przykomorowego należy wykonać przekroje o grubości 30 µm do dalszej analizy. Przekroje mózgu należy ostrożnie umieścić w płytkach wypełnionych solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Przekroje mózgu należy przemyć PBS od 3 do 5 razy, umieszczając płytki na kołysce na 10 minut po dodaniu świeżego PBS.Następnie do płytek należy dodać roztwór zawierający przeciwciało pierwszorzędowe i przechowywać je w temperaturze 4°C przez noc, z mieszaniem w dniu następnym. Przed dodaniem przeciwciała drugorzędowego należy przemyć skrawki. Próbki należy inkubować z mieszaniem przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po końcowym przemyciu skrawki mózgu poddaje się działaniu roztworu kompleksu streptawidyna-biotyna, który wspomaga wizualizację komórek neurochemicznie dodatnich.Ostatnim etapem procedury wizualizacji jest ostrożne dodanie DAB po ekspozycji na DAB. Przezmyć plastry mózgu w ostatniej serii płukań. Ostrożnie umieścić je na szkiełkach mikroskopowych z podkładem i pozostawić do wyschnięcia na noc.Po wysuszeniu należy oczyścić preparaty poprzez serię przemyć wodą destylowaną i alkoholem, a następnie zanurzyć skrawek w Citrus Solve. Na koniec należy nałożyć szkiełka nakrywki i przechowywać preparaty w pudełku w celu ich zabezpieczenia. Istnieje wiele metod prowadzenia procesu immunochemii.Kluczem do sukcesu jest opracowanie i przestrzeganie przejrzystego protokołu. Preparaty są teraz gotowe do analizy z wykorzystaniem specjalistycznego oprogramowania do kwantyfikacji neurologicznej. Oprogramowanie Bio quant jest wykorzystywane do kwantyfikacji komórek i włókien pozytywnych pod kątem wazopresyny w jądrze przykomorowym mózgów myszy.Użyj opcji pomiaru, aby zidentyfikować konkretny obszar zainteresowania i wyznaczyć pole widzenia do kwantyfikacji neurologicznej. Tutaj widoczne są ciemno barwione elementy supresora VA, immunoreaktywne ciała komórek i włókna. Skorzystaj z funkcji progowania jasności oprogramowania, aby określić całkowitą ilość tkanki wykazującej pozytywne barwienie w określonym obszarze.To progowanie informuje nas o ilości tkanki wykazującej pozytywną reakcję na wazopresynę. Jak widać tutaj, samce Californicus spędzały więcej czasu na pielęgnacji i kucaniu nad młodymi – dwóch kluczowych oznakach reakcji ojcowskich – w porównaniu do podobnego gatunku. Analiza mikrosekwencjonowania wykazuje, że ojcowskie myszy kalifornijskie wykazują mniej przerw w sekwencji pielęgnacji w porównaniu do osobników niebędących ojcami.W celu ustalenia, czy zmienne neurobiologiczne są istotne w reakcjach ojcowskich podczas ekspozycji na zapach drapieżnika, ilościowo określono zawartość tkanki pozytywnej pod kątem wazopresyny w kilku odpowiednich obszarach mózgu. Jak widać, u samców gatunku californicus wykazujących opiekę ojcowską stwierdzono więcej tkanki pozytywnej pod kątem immunologicznym w kilku z tych obszarów mózgu. Podsumowując, podejście oparte na gatunkach porównawczych pozwala zidentyfikować kluczowe układy neurobiologiczne związane z określonym, badanym zachowaniem.Jednakże charakter tych danych jest korelacyjny, dlatego ważne jest zastosowanie dodatkowych technik metodologicznych, aby w dalszym stopniu potwierdzić rolę układu neurobiologicznego oraz analizowanego zachowania.

using-comparative-species-approach-to-investigate-neurobiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zastosowanie porównawczego podejścia gatunkowego w badaniach neurobiologii reakcji ojcowskich

Różnicowa zdolność konkurencyjna plemników wśród samców Drosophila o różnych genotypach może być stwierdzona poprzez eksperymenty z podwójnym kryciem. Każdy z tych eksperymentów obejmuje jednego z interesujących samców i samca referencyjnego. Łatwe do zidentyfikowania markery w potomstwie pozwalają na wnioskowanie o frakcji osobników spłodzonych przez każdego samca.

Ocena różnic w zdolności konkurencyjnej plemników u Drosophila

Ten artykuł opisuje test behawioralny, który wykorzystuje popęd godowy samców u Drosophila melanogaster do badania motywacji. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą wykorzystać zaawansowane techniki neurogenetyczne much, aby odkryć mechanizmy genetyczne, molekularne i komórkowe, które leżą u podstaw tej motywacji.

Pomiar i zmiana popędu godowego u samca Drosophila melanogaster

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

Rola niedawno odkrytych genów związanych z chorobą w patogenezie zaburzeń neuropsychiatrycznych pozostaje niejasna. Zmodyfikowana technika obustronnej elektroporacji in utero pozwala na transfer genów w dużych populacjach neuronów i badanie przyczynowego wpływu zmian ekspresji genów na zachowania społeczne.

Rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni

Paradygmat chronicznego stresu psychospołecznego (CGS) wykorzystuje klinicznie istotne czynniki stresogenne podczas ciąży u myszy do modelowania zaburzeń psychicznych matek i niemowląt. W tym miejscu przedstawiamy procedurę krok po kroku stosowania paradygmatu CGS i dalszych ocen w celu walidacji tego modelu.

Wykorzystanie mysiego modelu stresu psychospołecznego w ciąży jako translacyjnie istotnego paradygmatu dla zaburzeń psychicznych u matek i niemowląt

Tutaj prezentujemy model interwencji matki i dziecka u naczelnych w przypadku zaburzeń karmienia piersią w obecności ojcowskiej inhibicji i zaniedbywania matki. Film z modelem mate uzupełnia edukację mającą na celu wsparcie opiekunów naczelnych i ludzi w odniesieniu do niemowląt z problemami z karmieniem piersią, takimi jak ból.

Powszechny model marmozety interwencji matki i dziecka w zaburzeniach karmienia piersią w obecności zahamowań ojcowskich i zaniedbania matki

Jednoczesny zapis aktywności autonomicznej i szczegółowego zachowania matki myszy od ciąży do laktacji został osiągnięty za pomocą systemu telemetrycznego. Metoda ta pomaga zrozumieć dynamikę cech fizjologicznych i behawioralnych u matek od ciąży do odsadzenia.

Analiza elektrokardiogramów i zachowania myszy od ciąży do okresu laktacji

Ten protokół opisuje model zwierzęcy do badania, jak przeciwności losu we wczesnym okresie życia, sprowokowane przez zubożałe środowisko i nieprzewidywalną opiekę matki we wczesnym okresie poporodowym, wpływają na rozwój mózgu i przyszłe ryzyko zaburzeń psychicznych.

Ograniczone ściółkowanie i gniazdowanie jako model przeciwności losu we wczesnym okresie życia u myszy

Prezentowany tutaj jest potok analizy wideo, który pokonuje wyzwania związane z monitorowaniem zachowań w środowiskach MRI, pozwalając na wykrywanie nieinstruowanych reakcji behawioralnych na zewnętrzne sygnały. Analiza ta ułatwi bardziej kompleksowe zrozumienie wywołanych zmian stanu wewnętrznego i aktywności całego mózgu.

Profilowanie reakcji na zachowanie matki podczas obrazowania całego mózgu

Współczesne neurobiologie muszą badać różnice między wieloma gatunkami, w tym gryzoniami laboratoryjnymi i ludźmi. Jednak trudności techniczne pojawiają się, gdy w grę wchodzą ssaki o dużym mózgu. Podejście to dotyczy zmienności międzygatunkowej populacji neuronalnych u bardzo różnych ssaków, co pozwala na porównywalne wyniki do mapowania w celu ujawnienia wzorców ewolucyjnych.

Podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków

Odkryj podejście porównawcze gatunków do badania neurobiologii zachowań ojcowskich u myszy Peromyscus californicus i Peromyscus maniculatus. Metoda pozwala identyfikować korelacje między immunoreaktywnością wazopresyny a opieką nad potomstwem.

Wykorzystanie podejścia porównawczego gatunków do badania neurobiologii reakcji ojcowskich

Przeglądaj więcej filmów