Name: Ładowanie cięte: przydatne narzędzie do badania zakresu sprzężenia znacznika połączenia szczelinowego między neuronami siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj metodę ładowania ciętego do badania sprzężenia szczelinowego między neuronami siatkówki. Technika ta pozwala analizować wpływ warunków oświetlenia na komunikację neuronalną w tkance siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była finansowana z grantów NIH EY005102 dla S.C.M. oraz EY018640 dla C.P.R.

1. Przygotowanie nienaruszonej siatkówki nerwowej u złotej rybki, myszy i królika
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie poniższe kroki, w tym te opisane w punkcie „2) Cut-loading”, w warunkach stałego oświetlenia otoczenia (tła). Należy zauważyć, że na potrzeby niniejszego protokołu procedury opisano jako wykonane w całkowitej ciemności (tj. w warunkach bardzo ciemnych (tzw. „skotopowych”) ≤ 0,0001 lux) przy użyciu gogli noktowizyjnych na podczerwień, jednak w celu określenia wpływu innych poziomów oświetlenia otoczenia na sprzęganie znakera w złączach szczelinowych można zastosować inne, wyższe poziomy stałego oświetlenia tła.</li>
	<li>Adaptuj zwierzę doświadczalne (złotą rybkę, mysz lub królika) do ciemności przez co najmniej 1 hr przed operacją.</li>
	<li>Zgodnie z wcześniejszym opisem7, poddaj głębokiej narkozie złote rybki, umieszczając je w roztworze metansylowianu tricainy (MS222; 150 mg/L w buforowanej (zawierającej wodorowęglan sodu) wodzie z akwarium), a myszy poddaj głębokiej narkozie kwasem ketaminą (100 mg/kg, i.p.) i rompunem (10 mg/kg, i.p.). Króliki poddaj głębokiej narkozie uretanem (dawka nasycająca: 2,0 g/kg, i.p.) oraz zastosuj miejscową znieczulenie okołopodbitkowe (2% Xylocaine), zgodnie z wcześniejszym opisem8. Wszystkie procedury eksperymentalne dotyczące opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi federalnymi oraz zostać przejrzane i zatwierdzone przez lokalne uczelniane komisje ds. opieki i wykorzystania zwierząt. (Uwaga: W opisanych tutaj eksperymentach wszystkie procedury dotyczące opieki i wykorzystania ryb, myszy i królików zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH i zostały przejrzane oraz zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu stanowego Ohio).</li>
	<li>W przypadku ryb, myszy i królików, po enukleacji usuń przednią część każdego gałki ocznej. Następnie połóż kawałek papieru filtracyjnego na górnej części tylnego odcinka oka i odwróć papier filtracyjny wraz z okiem tak, aby papier znalazł się pod tylnym odcinkiem oka. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, wypreparuj nienaruszoną siatkówkę nerwową z tylnej części oka, delikatnie oddzielając nabłonek pigmentowy/naczyniówkę/twardówkę, które są ze sobą połączone, od siatkówki nerwowej przymocowanej do papieru filtracyjnego. Podczas tej czynności przetnij nerw wzrokowy za pomocą precyzyjnych nożyczek sprężynowych. Siatkówka nerwowa, zorientowana stroną fotoreceptorów do góry, powinna być teraz przymocowana do papieru filtracyjnego i oddzielona od reszty oka.</li>
</ol>
2. Załadunek z nacięciem
<ol>
	<li>Zanurz siatkówki w napowietrzonym roztworze Ringera (Tabela 1) w płytce 6-dołkowej (~5 mL/dołek) na 30 min przy stałym oświetleniu otoczenia (tła) (np. w warunkach bardzo ciemnych, tj. „skotopowych”), z dodatkiem leku testowego lub bez niego. Siatkówki ryb utrzymuj w napowietrzonym (5% CO2 /95% O2) roztworze Ringera na bazie wodorowęglanów w temperaturze 22°C, uszczelniając płytkę 6-dołkową parafilmem, natomiast siatkówki myszy i królika utrzymuj w temperaturze 36°C w inkubatorze z 5% CO2 /95% O2. W przypadku zastosowania leku testowego, powinien on być obecny podczas wszystkich kolejnych etapów aż do momentu fiksacji.</li>
	<li>Przygotuj roztwór znacznika (zwykle 100 μL), rozpuszczając neurobiotynę (0,5%), cząsteczkę biotynilowaną, w roztworze Ringera bezpośrednio przed wykonaniem cięcia siatkówki. Należy pamiętać, że do roztworu można dodać 0,5% dekstranu rodaminowego (o wysokiej masie cząsteczkowej &gt; 10 000 MW). Ze względu na wysoką masę cząsteczkową dekstran rodaminowy nie przenika przez połączenia szczelinowe i znakuje jedynie komórki uszkodzone w wyniku cięcia. Jak pokazano na Rys. 3, jest to przydatny sposób na odróżnienie komórek, które zgromadziły neurobiotynę z powodu uszkodzenia, od tych, które zgromadziły znacznik w drodze dyfuzji przez połączenia szczelinowe.</li>
	<li>Umieść roztwór neurobiotyny na szklanej (lub plastikowej) szalce Petriego, osusz papier filtracyjny, do którego przymocowana jest siatkówka, uderzając nim o ręcznik papierowy w celu usunięcia nadmiaru roztworu Ringera, zanurz ostrze żyletki (lub inne ostre ostrze) w roztworze neurobiotyny, a następnie wykonaj cięcie radialne przez siatkówkę i papier filtracyjny. W razie potrzeby można zastosować dystanse, tak aby cięcie przeszło przez siatkówkę, ale nie przez papier filtracyjny. Cięcie powinno być skierowane prostopadle do powierzchni siatkówki. Ponownie zanurz ostrze żyletki w roztworze neurobiotyny i przetnij siatkówkę po raz drugi. Powtórz tę czynność do 4 cięć na siatkówkę (patrz Rys. 1). Podczas wykonywania cięć żyletką w siatkówkach myszy i innych małych zwierząt należy używać mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Jak pokazano na Rys. 1, ponownie zanurz siatkówkę w świeżym medium Ringera, z lekiem testowym lub bez niego, używając płytki 6-dołkowej (5 mL roztworu Ringera/dołek). Inkubuj siatkówkę przez 15 min, aby umożliwić załadowanie i dyfuzję znacznika.</li>
	<li>Przemyj trzy razy po 5 min świeżym medium Ringera, z lekiem testowym lub bez niego.</li>
	<li>Ufiksuj siatkówkę w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M buforze fosforanowym (PBS, pH 7,4) przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemywaj w 0,1 M PBS przez noc w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Następnego dnia inkubuj z 2% streptawidyną-Alexa 488 (stężenie końcowe 10 μg/mL) w 0,1 M PBS + 0,3% Triton X-100 i przechowuj przez noc w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Przemyj trzy razy po 10 min w 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W PBS oddziel siatkówkę od papieru filtracyjnego, a następnie, używając cienkiego pędzla, umieść siatkówkę na szkiełku, orientując ją stroną fotoreceptorów do góry.</li>
	<li>Delikatnie zamontuj, używając medium montażowego Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA).</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego (np. Zeiss 510 META) przy tym samym powiększeniu, rozdzielczości i ustawieniach dla każdego warunku eksperymentalnego, aby umożliwić porównanie wpływu różnych warunków (np. leków testowych, warunków oświetlenia) na zakres sprzężenia znacznika w połączeniach szczelinowych (Rys. 2A-C oraz Rys. 4A-C). Chociaż pojedynczy obraz może zawierać wszystkie znakowane komórki, zaleca się zebranie stosu obrazów z (z-stack) obszaru zainteresowania i spłaszczenie go do jednego obrazu.</li>
</ol>
3. Ilościowe oznaczenie sprzęgania znacznika przy użyciu programu ImageJ
<ol>
	<li>W przeglądarce obrazów LSM otwórz obraz, kliknij EXPORT i zapisz zdjęcie jako niekompresowany plik TIF-16 bit. Pasek skali powinien być zawarty w tym obrazie TIF.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania NIH ImageJ zmierz intensywność fluorescencji neurobiotyny znakowanej Alexa-488 na obrazach o niskim powiększeniu całych preparatów siatkówki. Otwórz plik TIF w programie ImageJ, a następnie narysuj linię prostą odpowiadającą paskowi skali. Przejdź do ANALYSE, SET SCALE i wprowadź znaną odległość oraz jednostkę długości, a następnie kliknij OK. Teraz wyniki pomiarów mogą być przedstawione w jednostkach skalibrowanych, takich jak milimetry.</li>
	<li>Wybierz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia prostokątnego zaznaczenia. Szczyt fluorescencji powinien znajdować się przy lewej krawędzi zaznaczenia. Upewnij się, że w pobliżu prawej krawędzi nie ma sygnału fluorescencyjnego. Jeśli tak jest, obróć aktywny obraz (IMAGE, następnie ROTATE).</li>
	<li>Kliknij ANALYSE i PLOT PROFILE. Powinna pojawić się krzywa z wykładniczym spadkiem od lewej do prawej strony.</li>
	<li>Kliknij COPY w wyskakującym oknie i wklej zawartość do programu EXCEL. Pojawią się dwie kolumny przedstawiające odległość od cięcia (lewa kolumna) oraz intensywność fluorescencji jako funkcję odległości od cięcia (prawa kolumna).</li>
	<li>Podziel każdą surową wartość fluorescencji przez maksymalną wartość fluorescencji, aby uzyskać względną intensywność fluorescencji.</li>
	<li>Skopiuj dwie kolumny odpowiadające odległości od cięcia (X) i względnej intensywności fluorescencji (Y), a następnie wklej je do oprogramowania Origin.</li>
	<li>Dopasuj dane za pomocą funkcji EXPONENTIAL DECAY #1 (Ryc. 2D i Ryc. 4D), która ma postać: 
	Y = Y0 + Ymax*exp(-x/λ) 
	gdzie Y to względna intensywność fluorescencji, Yo to fluorescencja tła, Ymax to maksymalna względna fluorescencja, λ to stała przestrzenna (długości), a x to odległość od cięcia.</li>
	<li>Porównaj wartości stałej przestrzennej (λ) dla różnych warunków eksperymentalnych za pomocą testu t lub ANOVA (Ryc. 2E i Ryc. 4E). Należy zauważyć, że alternatywne techniki kwantyfikacji zostały opisane przez innych autorów13,14.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne przykłady sprzężenia znakera w komórkach fotoreceptorów, określone metodą ładowania przez cięcie (cut-loading), przedstawiono na Rysunkach 2 i 3 (ryba) oraz na Rysunku 4 (królik). Obrazy konfokalne wykonano przy użyciu tych samych ustawień w celu porównania (Rys. 2A-C i Rys. 4A-C), a natężenie fluorescencji wykreślono jako funkcję odległości od miejsca cięcia i dopasowano do funkcji wykładniczej opisanej w punkcie 3.8 powyżej (Rys. 2D i Rys. 4D). Wartości stałej przestrzennej dla każdego stanu przedstawiono na Rysunkach 2E i 4E, co ilustruje, że zakres sprzężenia znakera poprzez połączenia szczelinowe może być ilościowo określony przy użyciu techniki ładowania przez cięcie. Dodatkowo wyniki są wysoce powtarzalne. Zastosowanie techniki ładowania przez cięcie jako sposobu ilościowego określania zakresu sprzężenia znakera poprzez połączenia szczelinowe jest również potwierdzone przez fakt, że we wszystkich badanych przypadkach natężenie fluorescencji maleje wykładniczo jako funkcja odległości od miejsca cięcia7,8 (patrz także Rys. 2D i 4D), co wskazuje, że neurobiotyna wniknęła do fotoreceptorów poprzez cięcie żyletką, a nie z innych obszarów siatkówki. Ponadto jakościowo podobna różnica między dniem a nocą w sprzężeniu znakera w komórkach fotoreceptorów, zaobserwowana u złotej rybki przy wstrzykiwaniu znakera do pojedynczych czopków oraz przy ładowaniu przez cięcie7, potwierdza, że ładowanie przez cięcie jest stosunkowo dokładną metodą pomiaru zakresu sprzężenia fotoreceptorów.
Technikę cut-loading można również wykorzystać do badania innych rodzajów synaps elektrycznych w siatkówce. Na przykład Rysunek 5 ilustruje, że króliki typu A (Rys. 5A) i typu B (Rys. 5B) komórki poziome wykazują homologiczne sprzężenie znacznika po zastosowaniu metody cut-loading i dyfuzji neurobiotyny w warunkach adaptacji do ciemności.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Związek</td>
			<td>Ryby</td>
			<td>Mysz</td>
			<td>Królik</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>130</td>
			<td>120</td>
			<td>117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO33</td>
			<td>20</td>
			<td>25</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl22</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4-7H2O</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamina</td>
			<td>-</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl22</td>
			<td>0.7</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład roztworów Ringera dla siatkówek złotej rybki, myszy i królika. Stężenia podano w mM. Roztwory Ringera są napowietrzane mieszanką 5% CO2 /95% O2 i utrzymywane w temperaturze 22 °C (ryby) lub 36 °C (ssaki). „-” : składnik nieobecny w roztworze Ringera dla danego gatunku.
<img alt="Proces izolacji siatkówki nerwowej, schemat z konfiguracją mikroskopową, barwienie neurobiotyną, etapy obrazowania." src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1">
Rycina 1.: Schemat przedstawiający procedurę ładowania znaczników poprzez nacięcia. Po wyizolowaniu nienaruszonej siatkówki nerwowej wykonano kilka nacięć radialnych za pomocą ostrza, które uprzednio zanurzono w 0,5% roztworze neurobiotyny. Siatkówkę inkubowano w celu załadowania i dyfuzji znacznika, a następnie przemyto przed utrwaleniem w 4% paraformaldehydzie (PFA) w 0,1M buforze fosforanowym (PB). Sprzęganie znacznika zbadano przy użyciu streptawidyny sprzężonej z Alexa-488.
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej w równowadze statycznej; dopasowanie krzywej intensywności fluorescencji w funkcji odległości." src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2">
Rysunek 2. Różnica między dniem a nocą w sprzężeniu znacznika w fotoreceptorach u złotej rybki, wykazana za pomocą techniki ładowania poprzez cięcie. Sprzężenie poprzez połączenia szczelinowe komórek fotoreceptorów z użyciem znacznika neurobiotyny było rozległe w nocy (B) oraz w dzień po zastosowaniu spiperonu (10 μM), selektywnego antagonisty receptorów dopaminergicznych D2 (C), lecz nie występowało w dzień w warunkach kontrolnych (A). D) Znormalizowana względna intensywność fluorescencji w funkcji odległości od cięć (oznaczonych strzałkami na A-C). E) Wartości stałej przestrzennej uzyskane z danych w D oraz z innych eksperymentów (n = 4). ***P &lt; 0,001.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna z użyciem neurobiotyny i rodaminy, interakcja białek; schemat, widok po nałożeniu obrazów, skala 200μm." src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3">
Rysunek 3. Reprezentatywny przykład wykazujący fluorescencję w warstwie komórek fotoreceptorów siatkówki złotej rybki przystosowanej do ciemności w nocy, po wprowadzeniu roztworu neurobiotyny i dekstranu rodaminowego metodą nacięcia (cut-loading). Dekstran rodaminowy (zaznaczony na czerwono), który nie dyfunduje przez otwarte kanały połączeń szczelinowych ze względu na wysoką masę cząsteczkową (&gt; 10 000 MW), znakował jedynie komórki w pobliżu nacięcia. W przeciwieństwie do niego, neurobiotyna (zaznaczona na zielono) dyfundowała przez połączenia szczelinowe i jest widoczna w komórkach fotoreceptorów oddalonych od nacięcia. Miejsce nacięcia jest wskazane strzałką na każdym panelu. Pasek skali: 200 μm.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek fotoreceptorów; wykresy przedstawiają intensywność fluorescencji i wartości λ." src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4">
Rycina 4. Różnica między dniem a nocą w sprzężeniu znacznika fotoreceptorów w siatkówce królika ujawniona za pomocą techniki ładowania przez cięcie (cut-loading). Sprzężenie znacznika neurobiotyny w połączeniach szczelinowych komórek fotoreceptorowych było rozległe w nocy (B) oraz w dzień po zastosowaniu spiperonu (10 μM) (C), ale nie występowało w dzień w warunkach kontrolnych (A). Na obrazach A-C przedstawiono widoki prostopadłe rekonstrukcji 3D fotoreceptorów królika w pobliżu miejsca cięcia. D) Znormalizowana względna intensywność fluorescencji w funkcji odległości od miejsc cięcia. E) Wartości stałej przestrzennej uzyskane z danych w D oraz z innych eksperymentów (n = 3). ***P &lt; 0.001.
<img alt="Obraz mikroskopowy sieci neuronalnych; fluorescencja podkreśla złożone struktury komórkowe." src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5">
Rysunek 5. Metoda cut-loading wykazuje, że ciemnoadaptowane komórki poziome królika są sprzężone za pomocą znacznika. Zarówno komórki poziome typu A (A), jak i typu B (B) w ciemnoadaptowanych siatkówkach królika wykazały homologiczną sprzężenie znacznika neurobiotyny.

<ol><li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li>
<li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li>
<li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li>
<li>Bloomfield, S. A., Völgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li>
<li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Brain.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li>
<li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li>
<li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li>
<li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li>
<li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Mol.+Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li>
<li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Commun.+Adhes%22%5BJournal%5D)">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li>
<li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li>
<li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li>
<li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda ładowania przez cięcie (cut-loading) jest użyteczną i prostą techniką służącą do określania zakresu sprzęgania markerów poprzez połączenia szczelinowe między neuronami siatkówki w różnych warunkach oświetlenia oraz o różnych porach dnia i nocy. Do zalet tej techniki należy możliwość ilościowego określenia zakresu sprzęgania markerów poprzez połączenia szczelinowe między neuronami w nienaruszonej tkance siatkówki w różnych warunkach oświetlenia w ciągu dnia i nocy, a także możliwość przeprowadzenia takiej analizy dla sprzężonych neuronów o małej średnicy ciał komórkowych. Ograniczenia tej techniki w badaniu połączeń szczelinowych w nienaruszonej tkance dzielą się na dwie ogólne kategorie. Po pierwsze, dyfuzja markera przez otwarte połączenia szczelinowe może być stosunkowo trudna do zaobserwowania ze względu na a) małą średnicę lub ładunek związany z otwartymi kanałami oraz b) względne objętości sprzężonych przedziałów komórkowych1,14,15. Oznacza to, że dyfuzja markera z małej komórki do większej komórki lub grupy komórek sprzężonych, w porównaniu do dyfuzji markera z większej komórki do mniejszej, może być trudniejsza do wykrycia ze względu na rozcieńczenie markera. Po drugie, w niektórych warunkach fizjologicznych zakres dyfuzji markera przez połączenia szczelinowe w nienaruszonej tkance może nie odzwierciedlać dokładnie siły przewodnictwa połączeń szczelinowych ze względu na różnice w przewodnictwie małych jonów przenoszących prąd elektryczny w porównaniu do przepuszczalności stosunkowo dużych cząsteczek markerów1,14,15. Ogólnie rzecz biorąc, dowody na sprzęganie markerów silnie sugerują obecność funkcjonujących, otwartych kanałów połączeń szczelinowych, jednak w niektórych warunkach fizjologicznych dyfuzja markera może nie zachodzić lub nie być obserwowalna, mimo że rejestracje elektrofizjologiczne wskazują na obecność funkcjonujących, otwartych połączeń szczelinowych.
Wydaje się prawdopodobne, że technikę ładowania przez cięcie można wykorzystać również do badania zakresu sprzężenia znakowników poprzez połączenia szczelinowe między neuronami w nienaruszonej tkance z innych obszarów ośrodkowego układu nerwowego.

<table><tbody><tr><td>Metanosulfonian tricainy (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>150 mg/L buforowanej wody w akwariach rybnych</td></tr><tr><td>Uretan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>dawka nasycająca 2 g/kg</td></tr><tr><td>Gogle noktowizyjne z podwójną tubą</td><td>Night Optics USA</td><td>D-221</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny, stopień nr 4</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004-090</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna, Dumont nr 5, biologiczna, długość 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki precyzyjne, z pod sprężyną, ostrze 8 mm, proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Neurobiotyna</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-1120</td><td>0,5%</td></tr><tr><td>Streptawidyna sprzężona z Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>S11223</td><td>2%</td></tr><tr><td>Rodamina dekstranowa (wysoka masa cząsteczkowa (&amp;gt; 10 000 MW))</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>0,5%</td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop skaningowy Zeiss 510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM-5 Image Browser 3,2,0,115</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8.0</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Ładowanie przez przecięcie (cut-loading): użyteczne narzędzie do badania zakresu sprzężenia markerów złącz szczelinowych między neuronami siatkówki

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Oprócz chemicznej transmisji synaptycznej, neurony połączone złączami szczelinowymi mogą również komunikować się szybko za pomocą elektrycznej transmisji synaptycznej. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że złącza szczelinowe nie tylko umożliwiają przepływ prądu elektrycznego i synchronizację aktywności między połączonymi lub sprzężonymi komórkami, ale że siła lub skuteczność komunikacji elektrycznej między sprzężonymi komórkami może być w dużym stopniu modulowana1,2. Ponadto duża średnica wewnętrzna (~1.2 nm) wielu kanałów złączy szczelinowych umożliwia nie tylko przepływ prądu elektrycznego, ale także dyfuzję wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych i małych metabolitów między połączonymi komórkami, dzięki czemu złącza szczelinowe mogą pośredniczyć również w komunikacji metabolicznej i chemicznej. Siłę komunikacji poprzez złącza szczelinowe między neuronami oraz jej modulację przez neurotransmitery i inne czynniki można badać poprzez jednoczesną rejestrację elektryczną ze sprzężonych komórek oraz poprzez określanie stopnia dyfuzji cząsteczek znacznika, które przenikają przez złącza szczelinowe, ale nie przez błonę komórkową, po wstrzyknięciu jontoforetycznym do pojedynczych komórek. Jednakże procedury te mogą być niezwykle trudne do przeprowadzenia na neuronach z małymi somatami w nienaruszonej tkance nerwowej.
Liczne badania nad synapsami elektrycznymi oraz modulacją komunikacji elektrycznej przeprowadzono w siatkówce kręgowców, ponieważ każdy z pięciu typów neuronów siatkówki jest połączony elektrycznie za pomocą połączeń szczelinowych3,4. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że zegar okołodobowy (24-godzinny) w siatkówce oraz zmiany w stymulacji światłem regulują sprzężenie w połączeniach szczelinowych3-8. Na przykład niedawne prace wykazały, że okołodobowy zegar siatkówki zmniejsza sprzężenie w połączeniach szczelinowych między fotoreceptorami pręcikowymi a czopkowymi w ciągu dnia poprzez zwiększenie aktywacji receptorów dopaminy D2, a drastycznie zwiększa sprzężenie pręcikowo-czopkowe w nocy poprzez redukcję aktywacji receptorów D27,8. Jednakże badania te są niezwykle trudne do przeprowadzenia na neuronach z małymi somatami w nienaruszonej tkance nerwowej siatkówki, a dodatkowo trudno jest odpowiednio kontrolować warunki oświetlenia podczas badań elektrofizjologicznych pojedynczych neuronów siatkówki, aby uniknąć zmian przewodnictwa połączeń szczelinowych indukowanych przez światło.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy prostą metodę określania zakresu sprzężenia poprzez połączenia szczelinowe między neuronami siatkówki w różnych warunkach oświetlenia oraz o różnych porach dnia i nocy. Technika ładowania przez cięcie (cut-loading) jest modyfikacją metody ładowania przez zeskrobnięcie (scrape loading)9-12, która opiera się na wprowadzaniu barwnika i jego dyfuzji przez otwarte kanały połączeń szczelinowych. Metoda ładowania przez zeskrobnięcie sprawdza się w komórkach hodowlanych, ale nie w grubych przekrojach, takich jak nienaruszone siatkówki. Technika ładowania przez cięcie była stosowana do badania sprzężenia fotoreceptorów w nienaruszonych siatkówkach ryb i ssaków7, 8,13 i może być wykorzystana do badania sprzężenia między innymi neuronami siatkówki, zgodnie z opisem przedstawionym w niniejszej pracy.

Opisano prostą i wygodną metodę określania zakresu sprzężenia markerów złączy szczelinowych pomiędzy neuronami siatkówki. Technika ta umożliwia badanie funkcji synaps elektrycznych pomiędzy neuronami w nienaruszonej siatkówce w różnych warunkach oświetlenia oraz o różnych porach dnia i nocy.

Oprócz chemicznej transmisji synaptycznej, neurony połączone poprzez złącza szczelinowe mogą również szybko komunikować się za pomocą synaps elektrycznych...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu z obciążeniem przez cięcie (cut loading) jest zbadanie stopnia sprzężenia za pomocą znacznika przez złącza szczelinowe pomiędzy neuronami w nienaruszonej siatkówce w kontrolowanych warunkach oświetlenia. Pierwszy krok polega na przecięciu siatkówek ostrym ostrzem zanurzonym w roztworze neurobiotyny, która jest cząsteczką znacznika zdolną do dyfuzji przez otwarte kanały złączy szczelinowych, ale nie przez błony komórkowe. W drugim kroku siatkówki są inkubowane w roztworze Ringera, co umożliwia dyfuzję znacznika przez otwarte kanały złączy szczelinowych.Jeśli sprzężenie poprzez złącza szczelinowe jest słabe, fluorescencja neurobiotyny będzie ograniczona do neuronów siatkówki znajdujących się w pobliżu miejsca cięcia. W przeciwieństwie do tego, jeśli sprzężenie poprzez złącza szczelinowe jest silne, fluorescencja zostanie wykryta w neuronach siatkówki oddalonych od miejsca cięcia. Główną zaletą ładowania metodą cięcia w porównaniu z istniejącymi technikami jest łatwiejsze przeprowadzanie tej procedury w przypadku neuronów o małych ciałach komórkowych w nienaruszonej tkance siatkówki nerwowej.Łatwiejsza jest również kontrola warunków oświetlenia podczas załadunku wycinków niż podczas badania elektrofizjologicznego pojedynczych neuronów w nienaruszonym tkankowym preparacie siatkówki. Ponieważ bodźce świetlne stosowane podczas rejestracji elektrycznej mogą same prowadzić do zmian w sprzężeniu złączy szczelinowych, technikę tę zaprezentuje dr Chu Choi, postdoc z mojego laboratorium. W tej procedurze złota rybka jest utrzymywana w stałej ciemności w ciągu dnia przez co najmniej jedną godzinę przed operacją, a wszystkie kolejne kroki, aż do utrwalenia tkanki siatkówki, są również wykonywane w ciągu dnia w stałej ciemności; głęboko znieczulamy złotą rybkę, dodając do wody w akwarium 150 mg/L metanosulfonianu.Następnie uśmierć złotą rybkę zgodnie z wytycznymi federalnymi i uniwersyteckimi i ostrożnie usuń gałki oczne. Następnie odetnij przednią część każdej gałki ocznej. Po czym połóż kawałek papieru filtracyjnego na górnej części tylnej połowy oka, a następnie odwróć papier i oko tak, aby papier filtracyjny znalazł się pod tylną częścią oka.Następnie delikatnie usuń tylną część oka, w tym twardówkę i nabłonek pigmentowy, z ciemnoadaptowanego złotego karasia. Przetnij nerw wzrokowy siatkówki za pomocą precyzyjnych nożyczek. Neuropatyczna siatkówka złotego karasia, zorientowana stroną fotoreceptorów do góry, powinna teraz zostać przyczepiona do papieru filtracyjnego przed enukleacją, podczas gdy ryba znajduje się pod wpływem znieczulenia w 5 mL natlenionego roztworu Ringera na bazie węglanów, z dodatkiem leku testowego lub bez niego, w każdej studzience płytki 6-dołkowej, po wycięciu nienaruszonej siatkówki neuronalnej z tylnej części oka.Przenieść siatkówki do dołków w warunkach całkowitej ciemności. Następnie uszczelnić dołki paraformą i inkubować tkankę przez 30 minut. Bezpośrednio przed przecięciem siatkówki przygotować 100 µL roztworu znacznika, rozpuszczając 0,5% neurobiotyny w roztworze Ringera.Następnie do szklanej szalki Petri wlej roztwór neurobiotyny. Delikatnie ostukaj papier filtracyjny, do którego przytwierdzona jest siatkówka, o ręcznik papierowy. Aby usunąć nadmiar roztworu Ringera, zanurz żyletkę w roztworze neurobiotyny i wykonaj prostopadłe cięcie promieniowe przez siatkówkę oraz papier filtracyjny.Następnie ponownie zanurz żyletkę w roztworze neuro biotyny i przetnij siatkówkę po raz drugi. Powtórz tę czynność, wykonując do czterech nacięć na każdą siatkówkę. Na tym etapie przenieś siatkówkę do świeżego roztworu Ringera, medium z lekiem testowym lub bez niego, na 15 minut, aby umożliwić załadunek i dyfuzję.Przemyć ją trzykrotnie świeżym roztworem Ringera lub pożywką z lekiem testowym lub bez niego, przez pięć minut każdego razu. Następnie utrwalić siatkówkę w 4%paraformaldehydzie w 0,1 M roztworze buforu fosforanowego w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie przemyć siatkówkę 0,1 M PBS przez noc w temperaturze 4 °C, umieszczając ją w lodówce do następnego dnia.Siatkówkę inkubowano ze streptawidyną Alexa 488 (2%) w 0,1 M PBS i 0,3% Triton X 100 do stężenia końcowego 10 µg/ml przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia siatkówkę przemyto trzykrotnie 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej, każdorazowo przez 10 minut.Oddziel siatkówkę od papieru filtracyjnego w PBS. Następnie, używając cienkiego pędzla, przymocuj siatkówkę stroną fotoreceptorów do góry na szkiełku przedmiotowym z medium montażowym vector shield. Przenieś szkiełko do konfokalnego mikroskopu skaningowego i wykonaj zdjęcia przy tym samym powiększeniu, rozdzielczości i ustawieniach dla każdego warunku eksperymentalnego, aby umożliwić porównanie wpływu różnych warunków doświadczalnych na zakres funkcjonalnego sprzężenia znacznika przez połączenia szczelinowe.Poniżej przedstawiono zakres sprzęgania znacznika komórek fotoreceptorów w ciągu dnia w stałej ciemności w porównaniu do okresu dnia w stałej ciemności w obecności selektywnego antagonisty receptora dopaminowego D2. Należy zauważyć, że cięcie brzytwą na obu obrazach znajduje się po lewej stronie. Chociaż pojedynczy obraz może zawierać wszystkie oznakowane komórki, zaleca się zebranie stosu Z (Z stack) obszaru zainteresowania i spłaszczenie go do jednego obrazu, takiego jak ten przedstawiony.Poniżej przedstawiono zakres sprzęgania znacznika komórek fotoreceptorów podczas sekwencyjnego przesuwania przez taki przekrój Zacka. Należy zauważyć, że cięcie brzytwą na tym obrazie znajduje się po prawej stronie. Aby ilościowo określić zakres sprzęgania znacznika w przeglądarce obrazów LSM, otwórz obraz, następnie kliknij eksport i zapisz zdjęcie jako nieskompresowany plik TIF 16-bitowy; skala powinna zostać dołączona do tego obrazu TIFF przy użyciu oprogramowania NIH ImageJ.Zmierz intensywność fluorescencji neurobiotyny znakowanej Alexa 488 na obrazach siatkówek zamontowanych w otworach, wykonanych przy małym powiększeniu. Otwórz plik TIFF w programie Image J, a następnie narysuj linię prostą odpowiadającą paskowi skali. Następnie przejdź do menu Analyze, wybierz Set Scale i wprowadź znaną odległość oraz jednostkę długości.Następnie kliknij OK. Teraz pomiary fluorescencji mogą być przedstawione w jednostkach skalibrowanych, takich jak milimetry. Następnie wybierz interesujący obszar, korzystając z narzędzia prostokątnego zaznaczania.Szczyt fluorescencji powinien znajdować się przy lewej krawędzi zaznaczonego obszaru. Upewnij się, że w pobliżu prawej krawędzi nie występuje sygnał fluorescencyjny. Kliknij analyze and plot profile dla danych kontrolnych z okresu dziennego uzyskanych w stałej ciemności.Od lewej do prawej wyświetlona jest krzywa z wykładniczym spadkiem. Następnie należy kliknąć przycisk kopiuj w oknie wyskakującym i wkleić dane do programu Excel. Obecnie dostępne są dwie kolumny: jedna przedstawiająca odległość od cięcia, a druga intensywność fluorescencji w funkcji odległości od cięcia.W ramach porównania powyższe kroki powtarza się z danymi uzyskanymi w stałej ciemności w ciągu dnia. W obecności spit bro każdą surową wartość fluorescencji dzieli się przez maksymalną wartość fluorescencji, aby uzyskać względną intensywność fluorescencji. Należy skopiować dwie kolumny odpowiadające odległości od miejsca cięcia oraz względnej intensywności fluorescencji, a następnie wkleić je do oprogramowania Origin.Kroki te przedstawiono zarówno dla kontroli w ciągu dnia, jak i dla próbki śliny pobranej w ciągu dnia. Dane uzyskane na tym etapie dopasowuje się do wyników za pomocą funkcji wykładniczego zaniku numer jeden. Następnie porównuje się wartości stałej czasowej dla różnych warunków eksperymentalnych, stosując test T lub analizę ANOVA.W celu porównania przedstawiono funkcje wykładnicze i analizy statystyczne danych dla grup kontrolnych w dzień, grupy z podanym pip rone w dzień oraz grupy kontrolnej w nocy. Przedstawiono przykłady zakresu sprzężenia barwnika komórek fotoreceptorów w siatkówce złotej rybki zaadaptowanej do ciemności w dzień (A), w nocy (B) oraz w dzień w obecności selektywnego antagonisty receptora dopaminowego D2, ujawnione za pomocą techniki ładowania przez przecięcie (cut loading technique). Wszystkie obrazy konfokalne zostały wykonane przy użyciu tych samych ustawień w celu porównania.Na tym wykresie intensywność fluorescencji dla trzech warunków doświadczalnych przedstawiono jako funkcję odległości od miejsca cięcia, dopasowując dane za pomocą funkcji wykładniczej. Technika ładowania przez cięcie (cut loading) jest wykorzystywana do ilościowego określenia stopnia sprzężenia znaczników przez złącza szczelinowe poprzez obliczanie wartości stałej przestrzennej, jak pokazano tutaj dla trzech warunków doświadczalnych. Technikę ładowania przez cięcie można również wykorzystać do badania synaps elektrycznych pomiędzy innymi typami komórek w siatkówce oraz u innych gatunków.Na przykład te dwie ryciny ilustrują, że królicze komórki poziome typu A i typu B wykazują homologiczne sprzęganie znacznika po zastosowaniu techniki ładowania przez nacięcie (cut loading) i dyfuzji neurobiotyny w warunkach adaptacji do ciemności. Wykorzystaliśmy technikę ładowania przez nacięcie, aby zbadać zakres dyfuzji znacznika przez złącza szczelinowe między pręcikami a czopkami w ciągu dnia i nocy. Ponadto technika ta może być używana do ustalenia, czy sprzęganie znacznika między innymi neuronami siatkówki jest kontrolowane przez zegar siatkówkowy i/lub przez specyficzne warunki oświetlenia i ciemności.Można go również wykorzystać do badania sprzężenia znaczników między neuronami w innych obszarach mózgu.

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ładowanie fragmentów: Przydatne narzędzie do badania stopnia połączenia śledzącego złącza szczelinowego między neuronami siatkówki

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Opisujemy prostą i niskokosztową technikę wprowadzania wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych i czułych na wapń do neuronów lub dowolnego szlaku neuronalnego z wykorzystaniem polietylenowej pipety ssącej.

Retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Tutaj opisujemy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez pień nerwu żaby do zakończeń nerwowych. Przedstawiamy również protokół rejestracji i analizy szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych.

Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby

Tutaj prezentujemy protokół do oceny organizacji sieci astrocytowych. Opisana metoda minimalizuje odchylenie, aby zapewnić opisowe pomiary tych sieci, takie jak liczba komórek, rozmiar, obszar i położenie w jądrze. Anizotropię ocenia się za pomocą analizy wektorowej.

Analiza rozmiaru, kształtu i kierunkowości sieci sprzężonych astrocytów

Tutaj prezentujemy protokół dla nowatorskiego testu komunikacji międzykomórkowej z połączeniem szczelinowym, przeznaczonego do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych modulujących złącze szczelinowe w celu odkrycia leków i oceny toksykologicznej.

Test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Poznaj metodę ładowania ciętego do badania sprzężenia szczelinowego między neuronami siatkówki. Technika ta pozwala analizować wpływ warunków oświetlenia na komunikację neuronalną w tkance siatkówki.

Ładowanie cięte: przydatne narzędzie do badania zakresu sprzężenia znacznika połączenia szczelinowego między neuronami siatkówki (Wideo) | JoVE Journal

Ładowanie przez przecięcie (cut-loading): użyteczne narzędzie do badania zakresu sprzężenia markerów złącz szczelinowych między neuronami siatkówki

Przeglądaj więcej filmów