Ładowanie cięte: przydatne narzędzie do badania zakresu sprzężenia znacznika połączenia szczelinowego między neuronami siatkówki

Ogólnym celem następującego eksperymentu z obciążeniem ciętym jest zbadanie zakresu sprzężenia znacznika połączenia szczelinowego między neuronami w nienaruszonej siatkówce w kontrolowanych warunkach oświetlenia. Pierwszy krok osiąga się poprzez przecięcie siatkówki ostrym ostrzem zanurzonym w roztworze neurobiotyny, cząsteczki znacznikowej, która może dyfundować przez otwarte kanały połączeń szczelinowych, ale nie przez błony komórkowe. W drugim etapie siatkówki są inkubowane w roztworze Ringera, który umożliwia dyfuzję znacznika przez otwarte kanały połączeniowe szczeliny.

Jeśli sprzężenie połączenia szczelinowego jest słabe, fluorescencja neurobiotyny będzie ograniczona do neuronów siatkówki, które znajdują się w pobliżu cięcia. W przeciwieństwie do tego, jeśli sprzężenie połączenia szczelinowego jest silne, fluorescencja zostanie wykryta w neuronach siatkówki daleko od cięcia. Główną zaletą obciążenia ciętego w porównaniu z istniejącymi technikami jest to, że łatwiej jest je wykonać na neuronach z małymi ciałami komórkowymi w nienaruszonej tkance nerwowej siatkówki.

Łatwiej jest również kontrolować warunki oświetlenia podczas obciążenia cięciem niż podczas badania elektrofizjologicznego pojedynczych neuronów w nienaruszonej tkance siatkówki. Ponieważ bodźce świetlne używane podczas zapisu elektrycznego mogą same w sobie prowadzić do zmian w sprzężeniu złączy szczelinowych, technikę zademonstruje dr Chu Choi, doktor habilitowany z mojego laboratorium. W tej procedurze złota rybka jest trzymana w ciągłej ciemności w ciągu dnia przez co najmniej godzinę przed zabiegiem, a wszystkie kolejne kroki, aż do utrwalenia tkanki siatkówki, są również wykonywane w ciągu dnia w ciągłej ciemności, głęboko znieczulić złotą rybkę, dodając 150 miligramów na litr sulfonianu metanu do wody w akwarium.

Następnie poświęć złotą rybkę zgodnie z wytycznymi federalnymi i uniwersyteckimi i ostrożnie usuń jej gałki oczne. Następnie usuń przednią część każdej gałki ocznej. Następnie umieść kawałek bibuły filtracyjnej na tylnej części oka i odwróć bibułę filtracyjną i oko tak, aby bibuła filtracyjna znalazła się pod tylną częścią oka.

Teraz delikatnie usuń tylną część oka, w tym twardówkę i nabłonek pigmentowy z ciemnej przystosowanej złotej rybki. Siatkówka przecięła nerw wzrokowy za pomocą cienkich nożyczek. Nerwowa złota rybka, fotoreceptorem zorientowanym na siatkówkę do góry powinna być teraz przymocowana do bibuły filtracyjnej przed enukleacją, podczas gdy ryba jest poddawana znieczuleniu w ilości pięciu mililitrów natlenionym roztworem pierścienia na bazie węglanów z lub bez badanego leku do każdej studzienki sześciodołkowej płytki po wycięciu nienaruszonej siatkówki nerwowej z tylnej części oka.

Przenieś siatkówki do studzienek w ciągłej ciemności. Następnie uszczelnij studzienki paraformem i pozwól tkance inkubować przez 30 minut. Przygotuj 100 mikrolitrów roztworu znacznikowego, rozpuszczając 0,5% neurobiotyny w roztworze Ringera bezpośrednio przed przecięciem siatkówki.

Następnie dodaj roztwór neurobiotyny do szklanej szalki Petriego. Następnie delikatnie postukaj w bibułę filtracyjną, do której przymocowana jest siatkówka, po ręczniku papierowym. Aby usunąć nadmiar dzwonków, zanurz żyletkę w roztworze neurobiotyny i wykonaj prostopadłe promieniowe nacięcie przez siatkówkę i bibułę filtracyjną.

Następnie ponownie zanurz żyletkę w roztworze neurobiotyny i przetnij siatkówkę po raz drugi. Powtórz to do czterech cięć na siatkówkę. Na tym etapie przenieś siatkówkę do świeżych dzwonków, pożywki z badanym lekiem lub bez niego przez 15 minut, aby umożliwić ładowanie i dyfuzję.

Umyj go trzy razy świeżymi dzwonkami, pożywką z badanym lekiem lub bez, przez pięć minut każdy. Następnie utrwalić siatkówkę za pomocą 4% para formaldehydu w 0,1-molowym roztworze buforowym fosforanu w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie przemyj siatkówkę 0,1 molowym PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, umieszczając ją następnego dnia w lodówce.

Reaguj siatkówkę z 2% streptawidyną Alexa 4 88 w 0,1 molowym PBS i 0,3% Triton X 100 do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia. Przemyj siatkówkę trzykrotnie 0,1 molowym PBS w temperaturze pokojowej za każdym razem przez 10 minut.

Odłącz siatkówkę od bibuły filtracyjnej w PBS. Następnie za pomocą cienkiej szczoteczki zamontuj fotoreceptor siatkówki stroną do góry na szkiełku z podłożem montażowym osłony wektorowej. Przenieść szkiełko do laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i wykonać zdjęcia w tej samej rozdzielczości powiększenia i ustawieniach dla każdego warunku doświadczalnego, tak aby można było dokonać porównań wpływu różnych warunków eksperymentalnych na zakres sprzężenia znacznika funkcjonalnego z przerwą.

Oto zakres sprzężenia znacznika komórek fotoreceptorowych w ciągu dnia w ciągłej ciemności w porównaniu z dniem w ciągłej ciemności w obecności jednego selektywnego antagonisty receptora dopaminy D2. Zwróć uwagę, że wycięcie brzytwą na obu obrazach znajduje się po lewej stronie. Chociaż pojedynczy obraz może zawierać wszystkie oznaczone komórki, zaleca się zebranie stosu Z obszaru zainteresowania i zwinięcie go w jeden pokazany obraz.

Oto zakres sprzężenia znacznika komórek fotoreceptorowych, gdy porusza się sekwencyjnie przez takiego Zacka. Zwróć uwagę, że wycięcie brzytwy na tym obrazie znajduje się po prawej stronie. Aby określić ilościowo zakres sprzężenia śledzenia w przeglądarce obrazów LSM, otwórz obraz, a następnie kliknij przycisk eksportuj i zapisz obraz jako 16-bitowy nieskompresowany pasek skali pliku TIF, który powinien być dołączony do tego obrazu TIFF za pomocą oprogramowania NIH image J.

Zmierz intensywność fluorescencji neurobiotyny znakowanej Alexa 4 88 na podstawie obrazów siatkówki z otworami w małym powiększeniu. Otwórz plik TIFF za pomocą oprogramowania Image J, a następnie narysuj linię prostą odpowiadającą podziałce liniowej. Następnie przejdź do analizy, ustaw skalę i wprowadź znaną odległość i jednostkę długości.

Następnie kliknij OK. Teraz pomiary fluorescencji mogą być prezentowane w skalibrowanych jednostkach, takich jak milimetry. Następnie wybierz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia do zaznaczania prostokątnego.

Szczyt fluorescencji powinien znajdować się na lewej krawędzi wyboru. Upewnij się, że w pobliżu prawej granicy nie ma sygnału fluorescencyjnego. Kliknij przycisk Analizuj i wykreśl profil dla dziennych danych kontrolnych uzyskanych w ciągłej ciemności.

Krzywa z zanikiem wykładniczym jest wyświetlana od lewej do prawej. Następnie kliknij kopiuj w wyskakującym okienku i wklej go w programie Excel. Teraz są dwie kolumny, jedna pokazująca odległość od cięcia, a druga pokazująca intensywność fluorescencji w funkcji odległości od cięcia.

Dla porównania, powyższe kroki są powtarzane z danymi uzyskanymi w ciągłej ciemności w ciągu dnia. W obecności plucia bro podzielić każdą surową wartość fluorescencji przez maksymalną wartość fluorescencji, aby uzyskać względną intensywność fluorescencji. Skopiuj dwie kolumny odpowiadające odległości od cięcia i względnej intensywności fluorescencji, a następnie wklej je do oprogramowania źródłowego.

Te kroki są pokazane zarówno dla sterowania dziennego, jak i mierzei dziennej. Uruchom dane w tym momencie, dopasuj wyniki do rozkładu wykładniczego. Funkcja numer jeden, porównaj wartości stałych przestrzennych w różnych warunkach eksperymentalnych za pomocą testu T lub Inova.

Dla porównania pokazano funkcje wykładnicze i analizy statystyczne kontroli dziennej, dziennej rone i danych kontroli nocnej. Pokazano. Oto przykłady zakresu sprzężenia znaczników komórek fotoreceptorowych w ciemnej przystosowanej siatkówce złotej rybki w dzień A, w nocy B oraz w dzień w obecności jednego selektywnego antagonisty receptora dopaminy D dwóch, jak ujawniono techniką obciążenia cięciem. Wszystkie obrazy konfokalne zostały wykonane przy użyciu tych samych ustawień dla porównania.

Na tym wykresie intensywność fluorescencji dla trzech warunków eksperymentalnych jest wykreślona jako funkcja odległości od cięcia i dopasowana przez funkcję wykładniczą. Technika obciążenia ciętego jest stosowana do ilościowego określenia zakresu sprzężenia znacznika skrzyżowania szczelinowego poprzez obliczenie wartości stałych przestrzennych, jak pokazano tutaj dla trzech warunków eksperymentalnych. Technika obciążenia ciętego może być również wykorzystana do badania synaps elektrycznych między innymi typami komórek w siatkówce i u innych gatunków.

Na przykład te dwa rysunki ilustrują, że komórki poziome królika, typu A i typu B wykazują homologiczne sprzężenie znacznikowe podążające za obciążeniem cięciem i dyfuzją neurobiotyny w ciemnych warunkach przystosowanych. Zastosowaliśmy technikę załadunku ciętego do zbadania zakresu dyfuzji znacznika przez szczeliny między prętami i stożkami w dzień iw nocy. Ponadto technika ta może być wykorzystana do określenia, czy sprzężenie znacznikowe między innymi neuronami siatkówki jest kontrolowane przez zegar siatkówkowy i/lub przez określone warunki jasnej ciemności.

Może być również wykorzystany do badania sprzężenia znaczników między neuronami w innych obszarach mózgu.