Name: Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ w celu ekspansji klonalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych wątroby CD133+ z wątroby myszy w celu ekspansji klonalnej. Technika obejmuje trawienie tkanki, cytometrię przepływową i hodowlę komórek do analizy funkcjonalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr Rountree pragnie podziękować za obecne wsparcie finansowe z sieci Children's Miracle Network, National Institute of Health (granty K08DK080928 oraz R03DK088013) oraz American Cancer Society Research Scholar Award (MGO-11651). Dr Rountree zaznacza, że procedura ta została początkowo opracowana i dopracowana dzięki finansowaniu z programu Pediatric Scientist Development Program (grant NICHD K12-HD00850).

<ol><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+%28TGF%29-beta-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+Stem+Cells.+III.+Emergent+themes+of+liver+stem+cell+biology%3A+niche%2C+quiescence%2C+self-renewal%2C+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+liver+repopulating+capacity+of+murine+oval+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).</li>
<li>Greenbaum, L. E., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stem+cells+in+liver+repair+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of stem cells in liver repair and fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).</li>
<li>Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Hedgehog+signaling+in+fibrogenic+liver+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).</li>
<li>Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scopolamine+treatment+and+muscarinic+receptor+subtype-3+gene+ablation+augment+azoxymethane-induced+murine+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).</li>
<li>Sell, S., Leffert, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Liver cancer stem cells.</a> J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Lee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+prognostic+subtype+of+human+hepatocellular+carcinoma+derived+from+hepatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells.</a> Nat. Med. 12, 410-416 (2006).</li>
<li>Sell, S., Dunsford, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+stem+cell+origin+of+hepatocellular+carcinoma+and+cholangiocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.</a> Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).</li>
<li>Amin, R., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+tgf-Beta+in+hepatic+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis.</a> Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).</li>
<li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor%2Fstem+cells+give+rise+to+liver+cancer+due+to+aberrant+TGF-beta+and+IL-6+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).</li>
<li>Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+stem+cells+and+molecular+signaling+pathways+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma.</a> Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li>
<li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2%2FBCRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li>
<li>Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+features%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li>
<li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li>
<li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li>
<li>Kordes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+hepatic+stellate+cells+are+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).</li>
<li>Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Factor+10+is+critical+for+liver+growth+during+embryogenesis+and+controls+of+hepatoblast+survival+via+b-catenin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation.</a> Hepatology. , (2007).</li>
<li>Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li>
</ol>

Dr Rountree otrzymuje wsparcie badawcze od firmy Bayer Pharmaceutics. Dr Ding, dr Crooks, pani Dang i pani VanKirk nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

W przeciwieństwie do układu krwiotwórczego, w którym macierzyste komórki krwiotwórcze odpowiadają za utrzymanie systemu różnicowania komórkowego zastępującego naturalną fizjologiczną wymianę leukocytów, erytrocytów i płytek krwi, macierzyste komórki wątroby lub dorosłe komórki progenitorowe wątroby nie uczestniczą w normalnej homeostazie wątroby.5,6 Po ostrym uszkodzeniu wątroby lub częściowej hepatektomii hepatocyty, jako zróżnicowany nabłonek wątroby, przechodzą kilka rund proliferacji w celu odtworzenia utraconej masy wątroby.5,6 Proliferację macierzystych komórek wątroby obserwuje się jedynie podczas przewlekłych uszkodzeń.1,5-11 Przypuszcza się, że te dorosłe, organospecyficzne komórki macierzyste różnicują się zarówno w hepatocyty, jak i w cholangiocyty.1,5-8 Co ciekawe, ogromna większość nowotworów wątroby rozwija się na tle przewlekłych uszkodzeń, dlatego wysunięto również hipotezę, że macierzyste komórki wątroby są prekursorami części podzbioru nowotworów wątroby.2-4,12-17
Jednym z głównych wyzwań w badaniach nad komórkami macierzystymi wątroby jest izolacja rzadkich populacji komórek do analizy funkcjonalnej. Przykładowo, ogromna większość komórek w wątrobie to hepatocyty, które są znacznie większe niż cholangiocyty i inne mniejsze komórki nieparenchymalne. Poprzez rozdzielenie całej wątroby na frakcje komórkowe (duże hepatocyty – frakcja parenchymalna oraz mniejsze komórki – frakcja nieparenchymalna), a następnie selekcję komórek negatywnych pod kątem CD45 (komórek niehematopoetycznych), jesteśmy w stanie wzbogacić wyjściową populację komórek macierzystych ponad 600-krotnie.1,18-21Należy zaznaczyć, że w żadnym stopniu nie sugerujemy, iż populacja CD133+ jest w 100% czystą populacją komórek macierzystych, lecz wyraźnie reprezentuje ona heterogenną populację komórek o różnej linii i potencjale repopulacyjnym. Jednym z głównych ograniczeń w tej dziedzinie są definicje komórek macierzystych i komórek progenitorowych. W niniejszej pracy używamy terminu „komórka macierzysta” w szerszym znaczeniu, jednak w ścisłej definicji nieparenchymalne komórki CD133+ reprezentują populację progenitorową dwuliniową. Biorąc pod uwagę obecny stan badań nad komórkami macierzystymi i progenitorowymi wątroby, niniejszy raport stanowi punkt wyjścia dla badaczy zainteresowanych tą dziedziną. W miarę pojawiania się nowych markerów, takich jak EpCAM,22,23 czy czynników transkrypcyjnych, takich jak Sox9,24 mogą one zostać włączone do procedury. Przykładowo, zaobserwowaliśmy dość wysoki stopień pokrywania się komórek EpCAM+ i komórek CD133+.
W niniejszym raporcie szczegółowo opisujemy proces izolacji komórek macierzystych z normalnej wątroby mysiej, a także z modeli przewlekłego uszkodzenia wątroby, w których wykazano zwiększoną proliferację komórek macierzystych wątroby. Metoda ta posiada wyraźne zalety w stosunku do standardowej immunohistochemii zamrożonej lub utrwalonej w formalinie wątroby, ponieważ po izolacji można przeprowadzić badania funkcjonalne z wykorzystaniem żywych komórek.1,3,4 Specyficznym celem tego procesu jest wyizolowanie względnie czystej populacji komórek macierzystych wątroby, które mogą być powielane klonalnie in vitro. 
Głównym ograniczeniem tej procedury jest fakt, że większość wyizolowanych komórek nie będzie żywotna po cytometrii przepływowej (patrz sekcja Rozwiązywanie problemów). Jest to wynik czasu potrzebnego na przygotowanie komórek oraz licznych procedur wymaganych do oczyszczenia populacji przed izolacją. Jeśli wątroba zostanie poddana trawieniu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek do natychmiastowej analizy FACS, różnica w wielkości między hepatocytami a innymi komórkami nieparenchymalnymi uniemożliwi skuteczne utworzenie bramki FACS. W przypadku wykorzystania nieparenchymalnych komórek wątroby bez eliminacji komórek hematopoetycznych istnieje ryzyko, że znaczną liczbę komórek CD133+ mogą stanowić komórki pochodzenia hematopoetycznego, które zanieczyszczą tę frakcję. Ponadto, dzięki przepuszczeniu komórek przez filtr Miltenyi, zbierane są jedynie pojedyncze komórki i bardzo małe skupiska komórek. Zapewnia to, że próbka nie zapcha igły wlotowej FACS.
Alternatywy dla tej procedury obejmują modyfikacje pod kątem dowolnego innego markera powierzchniowego komórek, takiego jak CD49f, EpCAM lub kombinacji markerów, na przykład CD133+EpCAM+. W drugiej opublikowanej pracy wykorzystano gradient gęstości do izolacji komórek macierzystych wątroby z frakcji nieparenchymalnej. Procedura ta wymaga użycia ultrawirówki (8000 ×g), znacząco wydłuża czas trwania procesu i w naszym doświadczeniu istotnie zmniejsza wydajność komórkową przed FACS oraz żywotność po FACS.8
Przyszłe eksperymenty obejmą szerszy zakres analizy ekspresji genów, w tym genów wątroby płodowej, takich jak HNF3, HNF4α i αfp. Dodatkowo, w celu potwierdzenia wyników RT-PCR dla komórek w hodowli, można zastosować analizę Western blot oraz immunocytochemię białek wykazujących ekspresję.
Warto zauważyć, że w niedawnych badaniach zidentyfikowano ekspresję CD133 na komórkach gwiaździstych wątroby.25 Obecnie rutynowo badamy nasze próbki pod kątem markerów komórek gwiaździstych (patrz sekcja Rozwiązywanie problemów) i nie stwierdziliśmy znaczącej kontaminacji w naszych frakcjach. Może to wynikać z zastosowania różnych technik trawienia wątroby i izolacji komórek.2,3,26
Biorąc pod uwagę fakt, że większość komórek nie będzie żywotna bezpośrednio po izolacji metodą FACS, zalecamy wysianie komórek, albo w formie populacji CD133+, albo jako pojedyncze komórki, przed ich zastosowaniem u zwierząt. Hodowla in vitro przez 5-7 dni znacząco poprawi wyniki analizy nowotworów. Ponadto, ze względu na trudność izolacji pojedynczych komórek, należy ją przeprowadzać dopiero wtedy, gdy możliwe stanie się namnażanie kolonii z izolowanych populacji CD133+. Bardziej szczegółowa analiza różnych warunków hodowli oraz białek rusztowaniowych, które można wykorzystać do hodowli macierzystych i progenitorowych komórek wątroby, została opracowana przez Lolę Reid. Praca ta dostarcza alternatywnych warunków i modyfikacji, które badacze mogą włączyć do swojego programu badawczego po opanowaniu podstawowych technik izolacji.27,28 Praca dr Reid dostarcza również bardziej szczegółowej analizy biologii linii komórkowych i dojrzewania pomiędzy macierzystymi komórkami wątroby a zróżnicowanymi progenitorami.
W zakresie analizy guzów in vivo sukcesy odnosiliśmy, wykorzystując świeżo wyizolowane komórki oraz komórki pochodzące z klonalnej ekspansji komórek CD133+ in vitro, stosując przede wszystkim 1x106 komórek. Skupiliśmy się na dwóch szczepach genetycznych z przewlekłym uszkodzeniem wątroby: myszach MAT1a-/- oraz myszach z usunięciem genu Pten-/- specyficznym dla wątroby, a jako gospodarzy dla wzrostu guzów wykorzystaliśmy zarówno myszy naga, jak i myszy typu dzikiego. Z naszego doświadczenia wynika, że macierzyste komórki wątroby CD133+ tworzą guzy tylko wtedy, gdy zostaną wyizolowane z modeli znacznego uszkodzenia wątroby o charakterze przednowotworowym. Należy zauważyć, że guzy powstałe z komórek CD133+ zazwyczaj wykazują cechy zarówno raka hepatokomórkowego, jak i raka dróg żółciowych, co sugeruje pochodzenie tych guzów z komórek macierzystych lub progenitorowych.2-4,29
Działania następcze po udokumentowaniu guzów obejmują standardową analizę patomorfologiczną tkanki nowotworowej (barwienie H&amp;E) oraz barwienie immunohistochemiczne. Ponadto guzy można rozdrobić i poddać trawieniu w celu przeprowadzenia analizy FACS lub ponownej hodowli.2-4,30
Podsumowując, szczegółowo opisaliśmy procedurę izolacji, ekspansji oraz podstawowej charakterystyki komórek macierzystych wątroby CD133+ oraz nowotworowych komórek macierzystych CD133+.
Rozwiązywanie problemów: 
Zanieczyszczenie CD45: 
W przypadku kroku 3, jeśli występuje kontaminacja komórkami CD45+, którą można ocenić poprzez dodanie przeciwciała CD45-FITC przed analizą FACS i izolacją, należy sprawdzić, czy przeciwciało do mikrokulek CD45 nie straciło ważności oraz czy filtrat był zbierany wyłącznie wtedy, gdy filtr znajdował się w uchwycie magnetycznym. Każdy filtrat zebrany w czasie, gdy filtr nie znajdował się w uchwycie magnetycznym, będzie zawierał komórki CD45+.
Niska liczba komórek: 
W przypadku nieuszkodzonej wątroby całkowita liczba wyizolowanych komórek nieparenchymalnych CD133+ może być mniejsza niż 10 000. Komórki te występują rzadko w wątrobie w stanie spoczynku. W modelu przewlekłego uszkodzenia, takim jak dieta z 0,1% DDC, liczba ta znacznie wzrośnie do 100 000 komórek. Jeśli całkowita liczba komórek jest znacznie niższa od tych wartości, należy rozważyć kwestię barwienia przeciwciałami do FACS. Należy sprawdzić, czy przeciwciało CD133 nie utraciło daty ważności, ponieważ słabe barwienie skutkuje niską wydajnością. Zalecamy również przeprowadzenie analizy FACS komórek nieparenchymalnych wątroby w celu określenia względnej wielkości populacji przed przystąpieniem do izolacji metodą FACS.
Niska żywotność komórek po FACS: 
Jednym z problemów dotyczących żywotności może być sposób i czas przetwarzania komórek. Idealnie cały proces izolacji komórek, kroki 1-4, powinien być przeprowadzony bez żadnych opóźnień między poszczególnymi etapami i zakończony w tym samym dniu. Każde znaczne opóźnienie między krokami 1-4 znacznie obniży żywotność komórek. Drugim problemem wpływającym na żywotność komórek może być ciśnienie płynu osłonowego stosowane podczas izolacji metodą FACS. Zalecamy stosowanie niższego ciśnienia płynu osłonowego. Wreszcie, po izolacji komórki powinny zostać natychmiast wysiane, ponieważ każde znaczące przechowywanie na lodzie po sortowaniu również obniży ich żywotność.
Heterogeniczność nieparenchymalna komórek CD133+: 
Niedawne doniesienia wskazują, że komórki gwiaździste wątroby mogą również wykazywać ekspresję CD133 i posiadać pewną plastyczność.25 Dlatego, oprócz weryfikacji genów dw potencjalności za pomocą Albuminy i Krt19, dodatkowa weryfikacja może obejmować geny związane z komórkami gwiaździstymi, takie jak kwaśne białko włókienstwe gliae w spoczynkowych komórkach gwiaździstych oraz aktyna mięśni gładkich alfa i desmina w aktywowanych komórkach gwiaździstych.3,4,26 Ponadto populacja CD133+ reprezentuje szerszą populację progenitorów. Dodanie drugiego markera, takiego jak EpCAM, może pomóc w dalszej rafinacji tej populacji i ograniczeniu heterogeniczności.

<table><tbody><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>10565-018</td><td>z czerwienią fenolową</td></tr><tr><td>mikrokule CD45</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>czynnik wzrostu hepatocytów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1404</td><td></td></tr><tr><td>Epidermalny czynnik wzrostu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>DNaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td>1 gram</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Grupa Roche</td><td>1088874</td><td></td></tr><tr><td>Pronaza</td><td>Grupa Roche</td><td>0165921</td><td></td></tr><tr><td>sito o gęstości 70 mikronów</td><td>Fisher Scientific</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript RT</td><td>Qiagen</td><td>205111</td><td>50 reakcji</td></tr><tr><td>HotStarTaq</td><td>Qiagen</td><td>203203</td><td></td></tr><tr><td>kolumna LD firmy Miltenyi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało FACS CD133-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>Płytki pokryte lamininą</td><td>BD Biosciences</td><td>354410</td><td>96-dołkowa</td></tr><tr><td>Trypsyna z 0,05% EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-354</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>50 kolumn dla układu 5x10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; komórki lub mniej</td></tr><tr><td>Pharm Lyse</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>stężenie 10X</td></tr></tbody></table>

izolacja komórek macierzystych wątroby cd133+ do ekspansji klonalnej

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Macierzyste komórki wątroby, czyli komórki owalne, proliferują podczas przewlekłego uszkodzenia wątroby i według hipotez różnicują się zarówno w hepatocyty, jak i cholangiocyty. Ponadto zakłada się, że macierzyste komórki wątroby są prekursorami pewnej grupy nowotworów wątroby, takich jak rak hepatokomórkowy. Jednym z głównych wyzwań w badaniach nad komórkami macierzystymi w dowolnym narządzie litego, takim jak wątroba, jest izolacja rzadkiej populacji komórek do szczegółowej analizy. Na przykład ogromna większość komórek w wątrobie to hepatocyty (frakcja parenchymatyczna), które są znacznie większe od komórek nieparenchymatycznych. Poprzez wzbogacanie specyficznych przedziałów komórkowych wątroby (tj. frakcji parenchymatycznej i nieparenchymatycznej) oraz selekcję komórek CD45-ujemnych, jesteśmy w stanie zwiększyć populację wyjściową komórek macierzystych ponad 600-krotnie. Procedury opisane w niniejszym raporcie pozwalają na efektywne sortowanie stosunkowo rzadkiej populacji komórek z narządu litego. Proces ten można wykorzystać do izolacji macierzystych komórek wątroby z normalnej wątroby mysiej, jak i z modeli przewlekłego uszkodzenia wątroby, w których wykazano zwiększoną proliferację macierzystych komórek wątroby. Metoda ta ma wyraźne zalety w porównaniu ze standardową immunohistochemią mrożonej lub utrwalonej w formalinie wątroby, ponieważ po wstępnych eksperymentach z kolokalizacji można przeprowadzić badania funkcjonalne z wykorzystaniem żywych komórek. Aby zrealizować procedurę opisaną w niniejszym raporcie, zdecydowanie zaleca się współpracę z ośrodkiem cytometrii przepływowej o profilu badawczym, ponieważ szczegóły izolacji metodą FACS są w wysokim stopniu zależne od specjalistycznej aparatury i biegłej wiedzy z zakresu podstawowych procedur cytometrii przepływowej. Specyficznym celem tego procesu jest izolacja populacji macierzystych komórek wątroby, które mogą być powielane klonalnie in vitro.

Opisujemy tutaj izolację wykazujących ekspresję CD133 komórek macierzystych wątroby oraz nowotworowych komórek macierzystych z całej wątroby mysiej, co jest procesem wymagającym trawienia tkanki, wzbogacania frakcji komórkowej oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy metody zaawansowanej izolacji pojedynczych komórek oraz ekspansji klonalnej.

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

Macierzyste komórki wątroby, czyli komórki owalne, proliferują podczas przewlekłego uszkodzenia wątroby i według przyjętych hipotez różnicują się zarówno w hepatocyty, jak i cholangiocyty. W ...

W tym filmie przedstawiono procedurę izolacji komórek macierzystych wątroby w celu zbadania ekspansji klonalnej z wykorzystaniem ekspresji CD 133 na powierzchni komórek po przewlekłym uszkodzeniu wątroby. Najpierw wątroba zostaje usunięta z myszy z przewlekłym uszkodzeniem wątroby i poddana trawieniu w celu otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie dodaje się bufor do lizy erytrocytów w celu usunięcia czerwonych krwinek, a roztwór przepuszcza się przez kolumnę zawierającą przeciwciała CD 45 z nanocząsteczkami magnetycznymi w celu usunięcia leukocytów CD 45.Komórki pozbawione CD 45 są następnie sortowane w celu wzbogacenia populacji CD 1 33 pozytywnych komórek macierzystych wątroby. Wreszcie wyizolowane CD 1 33 pozytywne komórki macierzyste wątroby są hodowane i namnażane. Analiza ekspresji genów i białek in vitro wykazuje, że wyizolowane CD 1 33 pozytywne komórki macierzyste są zdolne do różnicowania się zarówno w hepatocyty, jak i osteocyty.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kolokalizacja markerów z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych, jest możliwość izolacji pojedynczych komórek w celu ekspansji klonalnej i analizy funkcjonalnej. W celu potwierdzenia fenotypów komórek macierzystych i progenitorowych, technika ta zostanie zaprezentowana przeze mnie oraz przez He Dang, studenta studiów doktoranckich w moim laboratorium. Wszystkie bufory i pożywki należy przygotować z 24-godzinnym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia wszystkich roztworów.Pożywki, instrumenty, filtry i probówki powinny być sterylne i obsługiwane zgodnie z techniką sterylną. Aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji, należy przetrzeć okolicę brzucha ueutanazowanej myszy 70% ethanolem. Używając sterylnych instrumentów, otwórz jamę brzuszną i wyeksponuj wątrobę w bloku.Usuń pęcherzyk żółciowy z wyjętej wątroby, a następnie przenieś całą wątrobę do sterylnego, zamkniętego naczynia pod komorą z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą sterylnego ostrza do golenia posiekaj wątrobę, wykonując wielokrotne cięcia poziome i pionowe. Przez jedną minutę podziel posiekaną wątrobą na cztery części i umieść każdą z nich w osobnej probówce o pojemności 15 millilitrów z 10 mililitrami roztworu do trawienia enzymatycznego. Następnie umieść probówki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut w wytrząsarce ustawionej na jedną do dwóch cykli na sekundę.Po inkubacji przetrzyj probówki 70% etanolem. Następnie, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przepuszczając przetrawioną masę wątrobową przez filtr o oczkach 70 µm, zbierz przelew do sterylnego naczynia w celu usunięcia frakcji miąższowej zawierającej większe hepatocyty. Przepłucz filtr dwiema mililitrowymi aliquotami sterylnej, suplementowanej pożywki D-M-E-M-F 12.Użyj gumowego końca tłoka strzykawki, aby przecisnąć strawioną miazgę przez filtr. Powtórz ten proces pięć razy, aby uzyskać całkowitą objętość około 20 ml. Podziel filtrat do dwóch równych probówek 15 ml, a następnie odwiruj z prędkością 50 ×g przez jedną minutę w temperaturze 4 °C.Po odwirowaniu przenieś supernatant do probówki oznaczonej jako supernatant numer jeden i odrzuć pellet parenchymalny. Następnie, aby zebrać frakcję nieparenchymalną, która zawiera komórki macierzyste i progenitorowe, odwiruj supernatant numer jeden z prędkością 50 ×g przez jedną minutę.Przenieś supernatant do probówki oznaczonej jako supernatant nr 2, a następnie ponownie odrzuć pellet. Następnie odwiruj supernatant nr 2 przy 50 ×g przez jedną minutę.Po wirowaniu przenieś nadsącz do probówki oznaczonej jako nadsącz numer trzy, a osad odrzuć. Na koniec odwiruj końcowy nadsącz numer trzy z prędkością 180 ×g przez osiem minut w celu otrzymania frakcji nieparenchymalnej; po wirowaniu odrzuć nadsącz i niezwłocznie przejdź do następnego kroku protokołu, w którym następuje lizy erytrocytów i osadu. Bufor do lizy erytrocytów oraz bufor miltene używane w tej części procedury powinny zostać przygotowane dzień wcześniej i przechowywane w temperaturze 4 °C zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie pisemnym.Pracę należy prowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, utrzymując komórki i roztwory w lodzie. Osad nieparenchymalny z poprzedniego kroku resuspendować w 1 ml 1x rozcieńczonego buforu do lizy czerwonych krwinek i przenieść do probówki o pojemności 5 ml. Zamknąć probówkę i delikatnie mieszać na wortexie przez 5 s.Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po upływie 15 minut chronić przed światłem. Wirować probówkę z prędkością 200 ×g przez pięć minut, a po zakończeniu wirowania odpirować supernatant zawierający lizowane krwinki czerwone i resus.Resuspend osad w jednym mililitrze lodowatego, sterylnego buforu E. Odwiruj próbkę przy 200 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu odlej nadsącz i ponownie resuspenduj osad w jednym mililitrze lodowatego, sterylnego buforu.Bufor Milton. Następnie pobierz 10 µL tej zawiesiny komórkowej i dodaj 10 µL barwnika Trypan Blue. Policz komórki nieparenchymalne za pomocą hemocytometru, aby przeprowadzić deplecję hematopoetycznych komórek CD45 z frakcji nieparenchymalnej.Pracę rozpoczynamy w komorze z laminarnym przepływem powietrza, dostosowując stężenie komórek do poziomu 10⁷ do 10⁸ całkowitej liczby komórek w 100 µL buforu melty. Należy dopilnować, aby komórki i bufory pozostawały schłodzone przez cały czas trwania procedury.Następnie nanieś 20 µL przeciwciała na mikrokulki CD 45 na każde 10 milionów komórek i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Po inkubacji dodaj kolejne 2 mL buforu i wiruj z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu odlej supernatant i resuspenduj do 10⁸ komórek w 1 mL.W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieść kolumnę magnetyczną Milt LD w uchwycie magnetycznym. Pod filtrem umieść sterylną probówkę o pojemności 5 ml, aby zebrać filtrat. Następnie nanieś 2 ml próbki.Rozpuść dowolny bufor, aby przeprowadzić wstępne płukanie filtra. Po zakończeniu płukania nałóż komórki na kolumnę. Gdy zawiesina komórkowa znajdzie się wewnątrz kolumny, dodaj 1 mL buforu melt e w celu przemycia kolumny; powtórz to płukanie jeszcze dwukrotnie.Nie należy używać tłoka dostarczonego z kolumną w celu przyspieszenia filtracji. Po wykonaniu wszystkich etapów płukania odwiruj zebrany filtrat komórek nieparenchymalnych pozbawionych CD 45 z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Kolumnę z zatrzymanymi komórkami CD 45-dodatnimi należy wyrzucić.Następnie wykonuje się cytometrię przepływową w celu izolacji komórek CD 1 33 dodatnich; komórki resuspenduje się w buforze Milt do stężenia 10⁷ komórek na 100 µL, a następnie odmierza się aliquoty po 100 µL do trzech probówek. Do pierwszej probówki dodaje się 2 µL przeciwciała koniugowanego z PE przeciwko CD 1 33. Do drugiej probówki dodaje się przeciwciało IgG koniugowane z PE jako kontrolę.Trzecia probówka z komórkami będzie służyć jako kontrola niebarwiona, inkubowana w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut w ciemności; po inkubacji zawiesić ponownie w dwóch mililitrach buforu do barwienia i odwirować z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w jednym mililitrze buforu Milton e. Następnie na cytometrze przepływowym wykorzystać komórki niebarwione oraz komórki barwione IGPE, aby dostosować parametry sortowania dla zoptymalizowanego bramkowania populacji komórek CD 1 33 dodatnich.Nasz zestaw FICO ERYN lub RPE można zazwyczaj stosować z każdym cytometrem przepływowym wyposażonym w laser emitujący światło o długości 488 nanometrów. Na koniec, izolując populację komórek CD 1 33 pozytywnych za pomocą bramkowania dla CD 1 33 pozytywnych, należy zebrać komórki do sterylnie filtrowanego medium dla komórek owalnych. Komórki te mogą teraz być hodowane, a następnie można przeprowadzić izolację klonalną, po której następuje reakcja PCR w czasie rzeczywistym w celu oceny statusu potencjału CD 1 33.Pozytywne komórki macierzyste wątroby wyizolowano od myszy typu dzikiego oraz myszy z knockoutem MAT one A, zgodnie z opisem w tym filmie, jak pokazano tutaj. Komórki CD 1 33 pozytywne stanowią 0,4% silnie wzbogaconej, pozbawionej CD 45 frakcji nieparenchymalnej kontrolnej, pochodzącej z nieuszkodzonej wątroby myszy typu dzikiego, natomiast w genetycznym knockoutcie MAT one A minus minus, który jest modelem przewlekłego uszkodzenia wątroby, populacja CD 1 33 pozytywna zwiększa się dziesięciokrotnie lub więcej w tej samej silnie wzbogaconej frakcji.Po sortowaniu komórki poddano hodowli, a klony zostały powiększone. Przedstawiono obrazy w kontraście fazowym czterech kolonii pochodzących od pojedynczych komórek CD133-dodatnich, powiększonych na płytkach 96-dołkowych powlekanych lamininą. Komórki te znajdują się w siódmej dobie po izolacji i wykazują małe, zwarte kolonie komórek nabłonkowych w dniu siódmym, gdy kolonie składają się z około 25 komórek.RNA wyizolowano z komórek, a następnie przeanalizowano ekspresję genu markera dróg żółciowych CK 19, co przedstawiono w tych eksperymentach R-T-P-C-R. Ekspresja genów wykazuje obecność markera hepatocytów albuminy oraz markera dróg żółciowych CK 19, co potwierdza potencjał komórek CD 1 33 pozytywnych kilka tygodni po początkowej izolacji pojedynczych komórek CD 1 33 pozytywnych i ich ekspansji in vitro. 1 × 10⁶ komórek z modelu mat one, A minus minus, wstrzyknięto podskórnie niedoborowym immunologicznie myszom nagiym. Strzałki wskazują guzy rosnące cztery tygodnie po wstrzyknięciu komórek.Komórki CD 133-dodatnie pochodzące z przewlekłego uszkodzenia wątroby indukowanego toksynami, takiego jak CCL4 lub dieta z 0,1% DDC, nie tworzą guzów. Tworzenie guzów in vivo jest wykorzystywane do identyfikacji potencjału złośliwego lub fenotypu komórek macierzystych nowotworu w obrębie populacji komórek macierzystych. Po opanowaniu technika ta może zostać zrealizowana w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie prawidłowo przeprowadzona.Po wykonaniu tej procedury można dodać dodatkowe markery faktów, takie jak EPAM lub inne markery. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. w celu doprecyzowania markerów powierzchniowych populacji komórek progenitorowych wątroby, można zastosować techniki takie jak analiza populacji bocznej (side population flx). Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat izolacji komórek macierzystych i progenitorowych wątroby za pomocą cytometrii przepływowej.Należy pamiętać, że praca z tkankami zwierzęcymi może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i stosowanie właściwych technik laboratoryjnych.

isolation-of-cd133-liver-stem-cells-for-clonal-expansion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ w celu klonowane rozszerzenia

Izolacja dorosłych komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórek do kolby.

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Komórki macierzyste nowotworu (CSCs) zidentyfikowano w wielu typach zmian złośliwych. W niniejszym protokole opisujemy metodę cytometrii przepływowej wykorzystującą aktywność dehydrogenazy aldehydowej oraz ekspresję CD44 i CD24 do izolacji CSCs z ksenoprzeszczepów gruczolakoprzewodowego raka trzustki człowieka. Te żywe komórki mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych i analitycznych.

Izolacja komórek macierzystych z ksenoprzeszczepów raka trzustki człowieka

Ten film opisuje technikę izolowania komórek macierzystych czerniaka CD133 ujemnych i dodatnich z pierwotnej linii komórkowej czerniaka za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. CD133-dodatnie CSC czerniaka są dalej badane w celu zrozumienia mechanizmów nowotworzenia czerniaka.

Izolacja komórek macierzystych czerniaka: metoda uzyskiwania dodatnich i ujemnych komórek czerniaka CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie

Ten film pokazuje izolację limfocytów, w tym komórek NK lub komórek NK, z ludzkiej tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji. Trawienie enzymatyczne i mechaniczne, po którym następuje separacja w gradieniu gęstości, sprzyja izolacji limfocytów, w tym komórek NK. Pobrane limfocyty mogą być dalej wykorzystywane do selektywnej ekspansji komórek NK.

Izolacja komórek NK z tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji

Ten film demonstruje technikę generowania myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS). Krwiotwórcze komórki macierzyste CD34 + (HSC) są izolowane z ludzkich komórek kożucha krwi pępowinowej za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami. HSC CD34+ są namnażane w pożywce wzrostowej wzbogaconej o cytokiny i kriokonserwowane. Na koniec rozmrożone HSC wstrzykuje się do mysiego szczeniaka z niedoborem odporności w celu ustalenia mysiego modelu HIS.

Izolowanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej w celu wytworzenia myszy z ludzkim układem odpornościowym

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Opisany tutaj jest protokół do izolacji i dalszego badania naciekających leukocytów decidua basalis i decidua parietalis - ludzkiego interfejsu matczyno-płodowego. Protokół ten utrzymuje integralność markerów powierzchniowych komórek i daje wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, co udowodniono w analizie cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Zgłaszamy wiarygodną metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu z genetycznie modyfikowanych modeli mysich.

Izolacja i ekspansja hodowli komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych wątroby CD133+ z wątroby myszy w celu ekspansji klonalnej. Technika obejmuje trawienie tkanki, cytometrię przepływową i hodowlę komórek do analizy funkcjonalnej.

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

Przeglądaj więcej filmów