Name: Wyłuszczenie oka myszy do zdalnego fenotypowania o wysokiej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Poznaj technikę wyłuszczenia oka myszy do zdalnego fenotypowania o wysokiej przepustowości. Film pokazuje usuwanie gałki ocznej z oczodołu, identyfikację kluczowych punktów anatomicznych i przygotowanie tkanek do badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Research to Prevent Blindness; Bartly J. Mondino M.D., dyrektor Jules Stein Eye Institute, UCLA; oraz Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui White i Jeanne Estabel z Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus. Badanie to jest zgodne z oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

1. Disekcja tępa: Enukleacja oka myszy w preparatach niefiksowanych
<ol>
 <li>Rozszerzyć powieki, aby poprawić ekspozycję i dostęp do tylnej powierzchni gałki ocznej.</li>
 <li>Umieścić zakrzywioną pęsetę opatrunkową za (pod) gałką oczną w oczodole. Pęseta opatrunkowa Mahajan Sharptip jest instrumentem specjalistycznym z ostrymi końcówkami, co ułatwia ten etap (patrz tabela materiały i odczynniki).</li>
 <li>Zamknąć pęsetę i chwycić tkankę łączną oczodołu oraz nerw wzrokowy za gałką oczną, uważając, aby nie ścisnąć gałki.</li>
 <li>Delikatnie pociągnąć pęsetę w górę i wyciągnąć gałkę oczną z oczodołu. Biała, nitkowata tkanka to nerw wzrokowy.</li>
 <li>Umieścić oko w PBS. Używając igły G30, wykonać pojedyncze nakłucie bezpośrednio za limbusie, wprowadzając igłę na 1-2 mm do wnętrza gałki ocznej. Pozwala to utrwalaczom, takim jak glutaraldehyd, które w innym przypadku nie byłyby w stanie przeniknąć przez tkankę oka, na bezpośrednie wniknięcie do wnętrza. Wykonanie tego nakłucia może nie być konieczne, jeśli utrwalacz, taki jak paraformaldehyd lub alkohol, jest w stanie dyfundować do badanych tkanek oka.</li>
 <li>Natychmiast umieścić całe oko w utrwalaczu w celu utrwalenia przez imersję.</li>
</ol>
2. Precyzyjna sekcja: Enukleacja oka myszy po utrwaleniu perfuzyjnym
<ol>
 <li>Użyj zakrzywionej pęsety Colibrie, aby odsunąć powiekę od gałki ocznej.</li>
 <li>Zorientuj zakrzywione nożyczki do dyssekcji Westcotta równolegle do gałki ocznej, kierując je w stronę tylnej części orbity.</li>
 <li>Przetnij utrwaloną tkankę łączną otaczającą gałkę oczną od strony dolnej, przyśrodkowej, górnej i bocznej.</li>
 <li>Umieść zakrzywioną pęsetę za gałką oczną, chwyć tkankę łączną, nie naciskając na gałkę, i pociągnij do przodu, aby przeprowadzić enukleację oka. Ze względu na to, że tkanka łączna orbity jest sztywna w wyniku utrwalenia perfuzyjnego, może być konieczne dodatkowe przecięcie tkanek oczodołowych, aby całkowicie uwolnić gałkę oczną.</li>
</ol>
3. Fixacja i pakowanie
Transport utrwalonych tkanek musi odbywać się zgodnie z wymogami instytucjonalnymi oraz przepisami służb pocztowych, w tym z zastosowaniem odpowiednich etykiet i opakowań. Poniższy protokół stanowi przykład wysyłki niezakaźnej próbki biologicznej w temperaturze otoczenia. Wymaga to zastosowania 3 warstw opakowania, lecz nie wymaga etykiet dla substancji biologicznych klasy A/B ani etykiet dotyczących ciekłego azotu.
<ol>
 <li>Umieść gałkę oczną w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 5 mL zawierającej co najmniej 3 mL utrwalacza lub buforu po utrwalaniu, jeśli proces utrwalania jest krótki. Zapisz numer identyfikacyjny na zakrętce fiolki i zabezpiecz ją Parafilmem.</li>
 <li>Umieść fiolki scyntylacyjne w zatwierdzonym pojemniku do transportu próbek biologicznych. W naszym instytucie zatwierdzone pojemniki wymagają trzech warstw: szczelnego pojemnika, w którym umieszczona jest próbka, absorbującej warstwy środkowej oraz ochronnej warstwy zewnętrznej.</li>
 <li>Umieść pojemnik w opakowaniu z folii bąbelkowej, a następnie w zatwierdzonym laboratoryjnym pojemniku transportowym wraz z odpowiednią dokumentacją.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Badanie histologiczne oczu można przeprowadzić za pomocą różnych metod, w tym barwienia hematoksyliną i eozyną, wykrywania ekspresji enzymatycznej, transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz immunohistochemii. Po utrwalaniu przez imersję w 4% paraformaldehydzie tkankę zatopiono w parafinie i wykonano jej przekroje na mikrotomie. W fenotypowaniu wysokoprzepustowym analizujemy przekroje źrenica-nerw wzrokowy, które obejmują wszystkie typy tkanek w oku (Rysunek 1). Przekroje tkanek poddano również badaniu pod kątem ekspresji lacZ (Rysunek 2), transmisyjnej mikroskopii elektronowej organelli komórkowych (Rysunek 3) oraz ekspresji specyficznych cząsteczek przy użyciu przeciwciał (Rysunek 4).
W naszej metodzie przesiewowej fenotypów orientacja oka względem strony nosowej (kąt wewnętrzny) i skroniowej (kąt zewnętrzny) nie była istotna. W przypadku, gdy orientacja oka jest konieczna, istnieją co najmniej dwie możliwości. Po enukleacji zastosowaliśmy lekką kauteryzację rogówki po stronie skroniowej na godzinie trzeciej przy użyciu ręcznego kauteryzatora. Zmiana ta jest wyraźna w badaniu histologicznym i nie ulega zatarciu podczas przetwarzania, w przeciwieństwie do tuszów histologicznych. Wadą jest to, że kauteryzacja uszkadza rogówkę, która może być krytyczną tkanką do badania. Druga opcja wymaga doświadczonego anatomy, który potrafi zidentyfikować miejsca przyczepu mięśni pozagałkowych. Pod stereomikroskopem identyfikacja przyczepów mięśnia skośnego dolnego i górnego wyznacza odpowiednio dolny i górny aspekt gałki ocznej.3 Przy zastosowaniu dowolnej z tych metod orientacji ważne jest śledzenie preparatu jako oka prawego lub lewego. Łącznie pozwoli to na dokładną orientację gałki ocznej przed sekcjonowaniem.
<img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig1.jpg" alt="Mikrografia anatomii oka; przekroje histologiczne; soczewka, siatkówka, rogówka; szczegóły warstw komórkowych." data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Histologiczne obrazy oka myszy po zdalnej akwizycji. Oczy myszy zostały enukleowane poprzez ostre rozcięcie po fiksacji perfuzyjnej 4% paraformaldehydem. A. Przekrój źrenica-nerw wzrokowy barwiony hematoksyliną i eozyną wykazuje zachowanie wszystkich podstruktur tkankowych. ON, nerw wzrokowy. (zielony pasek skali = 500 mikronów) B. Widok normalnej siatkówki przy większym powiększeniu ukazuje jej strukturę warstwową: RGC, komórki zwojowe siatkówki; IPL, wewnętrzna warstwa splotowata; INL, wewnętrzna warstwa jądrowa; OPL, zewnętrzna warstwa splotowata; ONL, zewnętrzna warstwa jądrowa (komórka fotoreceptora)(strzałka); IS, wewnętrzne segmenty fotoreceptorów (głowica strzałki); OS, zewnętrzne segmenty fotoreceptorów; RPE, nabłonek barwnikowy siatkówki; C, naczyniówka. (zielony pasek skali = 50 mikronów) C. W porównaniu do normalnej siatkówki, ten preparat jest cieńszy z powodu degeneracji fotoreceptorów. Warstwy ONL, IS i OS są całkowicie nieobecne (strzałka). (zielony pasek skali = 50 mikronów) 
<img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig2.jpg" alt="Histologia nabłonka rzęsowego; obraz mikroskopowy porównujący warstwy nabłonka i zrębu; szczegóły komórkowe." data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ekspresja lacZ u myszy transgenicznych. Gałki oczne wyłuskano poprzez tępe rozcięcie i zanurzono na noc w 37°C w roztworze X-gal 1 mg/ml (5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 2 mM MgCl2, 0,02% NP40 oraz 0,1% dejksocholanu sodu). Gałki oczne utrwalono w 2% formaldehydzie/0,2% glutaraldehydu przez 30 minut i przekrojono przy użyciu mikrotomu. Produkt X-gal (kolor niebieski) znakuje: A. nabłonek rzęsowy, B. nabłonek rogówki oraz C. warstwę komórek zwojowych siatkówki (RGC) w siatkówce. INL – wewnętrzna warstwa jądrowa; ONL – zewnętrzna warstwa jądrowa.
<img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig3.jpg" alt="Struktura siatkówki; mikrograf elektronowy przedstawiający zewnętrzne segmenty czopków, komórki RPE, błonę Brucha." data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE). Po rozcięciu tępym i wykonaniu rany punkcyjnej oczy utrwalono przez imersję w 2,5% Paraformaldehydzie/ 2,5% Glutaraldehydzie w 0,1M buforze fosforanowym sodu. Oczy poddano wtórnej fiksacji w 1% tetrótlenku osmu, stopniowo odwodniono i zatopiono w żywicy Spurra. Tkankę pocięto na skrawki o grubości 90 nm, umieszczono na miedzianych siatkach pokrytych Formvarem i obrazowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Mikrograf przedstawia zewnętrzne segmenty fotoreceptorów siatkówki neurosensorycznej, melanosomy (M) w obrębie nabłonka pigmentowego siatkówki oraz błonę Brucha.
<img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig4.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej struktury biofilmu bakteryjnego; powiększenie przy skali 20 mikronów." data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Barwienie immunohistochemiczne dysmutazy ponadtlenkowej-3 (zielony) w ciele szklistym myszy. Gałki oczne usunięto metodą tępej dyssekcji, a następnie poddano fiksacji przez imersję w 4% paraformaldehydzie. Następnie zatopiono je w parafinie i wykonano skrawki za pomocą mikrotomu. Przekroje tkanek inkubowano z króliczym poliklonalnym anty serum SOD3 rozcieńczonym 1:50. Ekspresję SOD3 wykryto przy użyciu przeciwciała wtórnego koziego anty-króliczego IgG (H+L) skoniugowanego z Alexa Fluor 488. Barwienie SOD3 przedstawiono w kolorze zielonym.

<ol><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li>
<li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+Mouse+Eye+Phenomics+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratories%2C+Mouse+Genetics+Meeting%22%5BJournal%5D)">A high-throughput Mouse Eye Phenomics System.</a> Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).</li>
<li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).</li>
<li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li>
<li>Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+genes+encoding+melanosomal+proteins+cause+pigmentary+glaucoma+in+DBA%2F2J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice.</a> Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).</li>
<li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fundus+photography+and+angiography%3A+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).</li>
<li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+resources+for+vision+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).</li>
<li>Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+from+screening+over+9000+mutation-bearing+mice+for+defects+in+the+electroretinogram+and+appearance+of+the+fundus%5BTitle%5D)+AND+%22Vision.+Res%22%5BJournal%5D)">Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus.</a> Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).</li>
<li>Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mouse+retinal+degenerations.+I.+Correlation+of+indirect+ophthalmoscopy%2C+electroretinograms%2C+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Doc.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology.</a> Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).</li>
<li>Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+in+mice+lacking+the+gamma+subunit+of+the+rod+cGMP+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase.</a> Science. 272, 1026-1029 (1996).</li>
<li>Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+carrying+the+H258N+mutation+in+the+gene+encoding+the+beta-subunit+of+phosphodiesterase-6+%28PDE6B%29+provide+a+model+for+human+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness.</a> Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Większość myszy transgenicznych znajduje się w laboratoriach, które nie przeprowadzają badań oczu. Nasza technika wideo przedstawia prostą, zestandaryzowaną metodę zdalnego przekazywania umiejętności chirurgicznych w celu optymalizacji pozyskiwania tkanek z laboratoriów z niewielkim doświadczeniem w badaniu oczu. Przedstawiona technika pomaga pokonać główną przeszkodę w fenotypowaniu wysokoprzepływowym, jaką jest korzystanie z ograniczonej liczby ośrodków eksperckich ze względu na niestandaryzowane metody pobierania i ut...

<table><tbody><tr><td>Zakrzywiona pęseta opatrunkowa</td><td>Storz Ophthalmics</td><td>E1408</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta opatrunkowa Mahajana z ostrym końcem</td><td>Storz Ophthalmics</td><td>E1406 (REF SP7-64520)</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki Westcotta</td><td>Storz Ophthalmics</td><td>E3321 WH</td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgiczne ostrze BD Beaver 15&amp;#x00B0;</td><td>BD Biosciences</td><td>374881</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta do szycia Castroviejo 0.22</td><td>Storz Ophthalmics</td><td>E1805</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Colibri 0.12</td><td>Storz Ophthalmics</td><td>2/132</td><td></td></tr><tr><td>Igła G30</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Koperta do przesyłek biohazard</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-523-4</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne</td><td>Wheaton</td><td>4500413033</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Paraformaldehyd/ 2.5% Glutaraldehyd w 0.1M buforze fosforanowym sodu</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15700 &amp;amp; 16300</td><td>Zmieszane w laboratorium</td></tr><tr><td>50% Glutaraldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16300</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Formvar</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15810</td><td></td></tr><tr><td>Miedźiowa siatka z nacięciem (Copper Slot Grid)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>M2010-CR</td><td></td></tr><tr><td>4% Tetroksyd osmu</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19140</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SOD3</td><td>Abcam</td><td>Ab21974</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>Żywica do zatapiania Spurr&amp;rsquo;s</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14300</td><td></td></tr></tbody></table>

enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Oko myszy stanowi ważny model genetyczny dla badań translacyjnych nad chorobami okulistycznymi ludzi. Choroby prowadzące do utraty wzroku u ludzi, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej, degeneracja fotoreceptorów, zaćma, jaskra, retinoblastoma oraz retinopatia cukrzycowa, zostały odtworzone u myszy transgenicznych.1-5 Większość myszy transgenicznych i knockout została stworzona przez laboratoria w celu badania chorób pozookulistycznych, jednak konserwatyzm genetyczny między układami narządowymi sugeruje, że wiele z tych samych genów może odgrywać rolę również w rozwoju oka i jego schorzeniach. Zatem myszy te stanowią istotny zasób w odkrywaniu nowych korelacji genotyp-fenotyp w oku. Ponieważ myszy te są rozproszone na całym świecie, ich pozyskanie, utrzymanie i fenotypowanie w sposób wydajny i kosztowo efektywny jest utrudnione. W związku z tym większość wysokoprzepustowych przesiewów fenotypowania okulistycznego jest ograniczona do kilku ośrodków, które wymagają obecności ekspertów okulistyki na miejscu w celu badania oczu żywych myszy. 6-9 Alternatywnym podejściem opracowanym przez nasze laboratorium jest metoda zdalnego pozyskiwania tkanek, która może być stosowana w badaniach oczu myszy transgenicznych na dużą lub małą skalę. Zestandaryzowane procedury przekazywania umiejętności chirurgicznych za pomocą wideo, utrwalania tkanek oraz ich transportu pozwalają każdemu laboratorium na pobranie całych oczu zwierząt mutantów i wysłanie ich do fenotypowania molekularnego i morfologicznego. W niniejszym artykule wideo przedstawiamy techniki enukleacji i transportu mysich oczu, zarówno nieutrwalonych, jak i utrwalonych metodą perfuzji, do zdalnych analiz fenotypowych.

Technika sekcji przedstawia enukleację oka myszy w celu utrwalenia tkanki do fenotypowania w badaniach wysokoprzepustowych.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Oko myszy stanowi istotny model genetyczny dla badań translacyjnych nad chorobami okulistycznymi u ludzi. Choroby prowadzące do ślepoty u ludzi, takie jak zwyrodnienie plamki...

W tym filmie zaprezentowano oko myszy oraz proces enukleacji, czyli usuwania gałki ocznej z oczodołu. Gałka oczna jest ograniczona dolną krawędzią powieki. Tutaj znajduje się kąt przynosowy, czyli przyśrodkowy.Z tyłu znajduje się kącik zewnętrzny lub boczny. Powyżej widoczna jest krawędź górnej powieki. Oto preparat chirurgiczny.Igła wskazuje na przejrzystą rogówkę. Widać niewielką część soczewki wystającą poza tęczówkę. Tęczówka znajduje się tutaj, jest brązowa i zakrywa soczewkę.Najważniejszym punktem orientacyjnym podczas operacji jest ta biała linia, czyli limbus; otwór zostanie wykonany tuż za nią. Tylna połowa gałki ocznej znajduje się za limbusem; tutaj wskazujemy miejsce przyczepu mięśnia. W tym miejscu widać mięsień przylegający do gałki ocznej, a następnie tkankę łączną wypełniającą oczodoł, w skład której wchodzi gruczoł łzowy.I na koniec, jest to biały, długi odcinek nerwu wzrokowego uzyskany w wyniku rozcierania. Używając zakrzywionej pęsety chirurgicznej z dostosowanym ostrym końcem, należy rozpocząć od rozsunięcia powiek. Pozwala to na wypchnięcie oka i odsunięcie go.Ostrożnie wprowadź pęsetę do oczodołu, za gałkę oczną, delikatnie ją uciśnij za gałką, nie ściskając jej, i pociągnij do przodu. Powinno to pozwolić na chwycenie tkanki łącznej, a nie gałki ocznej. Po odsunięciu gałki ocznej na bok można zobaczyć tkankę oczodołową wraz z białym nerwem wzrokowym.Jest to druga sekcja, przeprowadzona jedynie po to, aby ponownie pokazać, że należy wprowadzić narzędzia w okolicy kąta oka, przesunąć pęsetę za gałkę oczną, uchwycić tkankę łączną i pociągnąć ją do przodu, nie naciskając przy tym samej gałki ocznej. Ponownie można zauważyć tkankę łączną w postaci długiego, białego pasma nerwu wzrokowego. Aby wykonać ranę kłutą, należy uchwycić gałkę oczną za miejsce przyczepu mięśnia i wprowadzić igłę za limbus, tuż obok miejsca trzymania oka w celu jego stabilizacji.Pozwoli to na wniknięcie utrwalacza do wnętrza oka. Jeśli wykonasz nakłucie w znacznej odległości od miejsca trzymania oka, gałka oczna będzie bardzo niestabilna, a wykonanie rany o takiej długości będzie trudne, o ile nie ściśniesz oka lub nie wywrzesz nadmiernego nacisku. Można również chwycić całą tkankę łączną znajdującą się bezpośrednio za gałką oczną.Niektóre utrwalacze nie wymagają wykonania rany kłutej. Zasadniczo umieszczamy oko w probówce scyntylacyjnej o pojemności 5 cc z co najmniej 3 cc utrwalacza, aby upewnić się, że oko jest całkowicie zanurzone. W przypadku zwierząt utrwalonych metodą perfuzji niezbędna jest precyzyjna sekcja.Używamy zakrzywionej pęsety Calibri oraz zakrzywionych nożyczek Wescotta. Chwytamy dolną powiekę za pomocą pęsety Calibri. Wprowadzamy nożyczki w kierunku kości oczodołu i rozpoczynamy wycinanie tkanki łącznej.Wykorzystujemy krzywiznę oddaloną od gałki ocznej, unikając jej podczas dopasowywania rozmiaru. Dowolny fragment oka będzie odpowiedni na całej długości brzegu dolnej powieki, od jednego kącika do drugiego. W pewnym momencie większość tkanki łącznej zostanie usunięta, co pozwoli na wsunięcie nożyczek za gałkę oczną i jej odsuniecie.Oto kolejny przykład: wprowadzamy nożyczki do orbity, ale przy samej kości oczodołowej, a nie przy gałce ocznej, i wycinamy tkankę łączną. Pozwoli to na stopniowe uwolnienie gałki ocznej, która przypomina piłkę do koszykówki w koszu. Używając pęsety, odsuwamy powieki i wykonujemy delikatne, krótkie cięcia wokół gałki ocznej.W tym miejscu chwytamy tkankę łączną lub przyczep mięśnia za pomocą pęsety Collibra i kończymy oddzielanie gałki ocznej od tkanki łącznej orbity. Po odpowiednim utrwaleniu gałek ocznych, a w przypadku konieczności ich transportu, zabezpieczamy fiolkę z utrwalaczem za pomocą parafilmu.Opakowanie musi być zgodne z przepisami Twojej uczelni oraz regulacjami rządowymi. Zazwyczaj umieszczamy je w pojemniku z dodatkiem waty, aby wchłonęła ewentualny wyciek płynu; pojemnik ten musi być szczelnie zamknięty. Tak przygotowany pojemnik transportowy zostaje następnie umieszczony w kopercie z folią bąbelkową.Próbkę umieszcza się w laboratoryjnym opakowaniu transportowym do cieczy, wraz z całą niezbędną dokumentacją.

mouse-eye-enucleation-for-remote-high-throughput-phenotyping

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wyłuszczenie oka myszy do zdalnego fenotypowania o wysokiej przepustowości

Niniejszy protokół opisuje prostą i niedrogą metodę ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. enhancerów/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantów. Opisano przygotowanie DNA, wycięcie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Source: Jagodzińska, J., et. al., optyczna tomografia koherentna: obrazowanie komórek zwojowych siatkówki myszy . J. Vis. Exp. (2017)  W tym filmie pokazujemy zastosowanie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SD-OCT) do obrazowania warstw siatkówki i oceny zmian strukturalnych w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z neuropatią nerwu wzrokowego.

Obrazowanie in vivo siatkówki myszy za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Usunięcie oczu, zwane również enukleacją, stanowi użyteczną strategię do badania aspektów plastyczności wizualnej, międzymodalnej i rozwojowej wzdłuż układu wzrokowego ssaków, ponieważ powoduje nieodwracalną częściową (jednooczną) lub całkowitą (obuoczną) utratę wzroku. W tym miejscu opisujemy wysoce powtarzalne i proste podejście do przeprowadzania enukleacji in vivo.

Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten artykuł przedstawia protokół mikropreparacji oka u gryzoni. Proces ten polega na wyłuszczeniu gałki ocznej wraz z błoną naszywkową (tj. Trzecią powieką). Następnie następuje oddzielenie tylnej i przedniej części gałki ocznej.

Mikrodysekcja oka gryzonia

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Poznaj technikę wyłuszczenia oka myszy do zdalnego fenotypowania o wysokiej przepustowości. Film pokazuje usuwanie gałki ocznej z oczodołu, identyfikację kluczowych punktów anatomicznych i przygotowanie tkanek do badań.

Enukleacja oka myszy w celu zdalnego wysokoprzepustowego fenotypowania

Przeglądaj więcej filmów