Obrazowanie uwalniania neuroprzekaźników za pomocą komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych

Weźmy mysz z oknem czaszkowym zawierającym cienką warstwę czaszki, aby umożliwić wizualizację mózgu.

Ruch głowy jest ograniczony za pomocą dołączonego pałąka.

Kora mózgowa jest wstępnie wstrzykiwana za pomocą neuroprzekaźników opartych na komórkach, zaprojektowanych fluorescencyjnie reporterów lub CNiFER, które są komórkami reporterowymi, które umożliwiają wykrywanie uwalniania neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym.

CNiFER wyrażają receptor neuroprzekaźnika sprzężony z białkiem G i cytoplazmatyczny detektor wapnia, który składa się z domeny wiążącej wapń połączonej z fluoroforami donorowymi i akceptorowymi.

Za pomocą mikroskopu dwufotonowego wzbudzić detektor, aby spowodować emisję fluorescencji donorowej i umożliwić wizualizację CNiFER.

Aktywność neuronalna docierająca do kory mózgowej powoduje uwalnianie neuroprzekaźników.

Te neuroprzekaźniki wiążą się z receptorami CNiFER i aktywują szlaki sygnałowe, które indukują uwalnianie wapnia z retikulum endoplazmatycznego.

Zwiększony cytoplazmatyczny wapń wiąże się z detektorem, powodując zmianę konformacyjną, która zbliża fluorofory.

Dawca przekazuje energię do akceptora w celu stymulacji emisji fluorescencji akceptora, co wskazuje na uwalnianie neuroprzekaźnika.

Umieść platformę obrazowania z myszą z unieruchomioną głową pod obiektywem 10-krotnym zanurzeniem w wodzie w mikroskopie obrazowania dwufotonowego. Włóż kostkę filtracyjną do obrazowania progów, która ma zwierciadło dichroiczne o długości 505 nanometrów i filtry pasmowoprzepustowe o długości od 460 nanometrów do 500 nanometrów do pomiaru ECFP i od 520 nanometrów do 560 nanometrów do pomiaru cytrynu.

Następnie dodaj ACSF do studni, zawierającej przerzedzone okno czaszki, i opuść 10-krotny obiektyw zanurzenia w wodzie do ACSF. Użyj okularu w połączeniu z lampą rtęciową i kostką filtra GFP, aby zlokalizować cNIFERs. Teraz przełącz się na obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie.

Następnie należy wybrać odpowiednią ścieżkę światła do obrazowania dwufotonowego. Włącz femtosekundowy laser impulsowy w bliskiej podczerwieni. Wybierz długość fali 820 nanometrów i ustawienie mocy od 5 do 15%. Ustaw napięcie PMT1 i PMT2 na wartość submaksymalną, zwykle od 500 do 1000 woltów, w zależności od PMT.

Następnie ustaw wzmocnienie na 1 dla każdego kanału i 0 dla pozycji Z dla celu. Opuść obiektyw o około 100 do 200 mikrometrów od powierzchni kory mózgowej i rozpocznij skanowanie x, y. Dostosuj wzmocnienie mocy lasera i napięcie PMT dla każdego kanału, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu fluorescencji cNIFER.

Następnie użyj oprogramowania, aby ograniczyć obrazowanie do regionu zawierającego komórki cNIFERs, a także regionu tła. Wybierz uśrednianie linii Kalmana dla dwóch, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu, i użyj częstotliwości skanowania od 0,3 do 1 Hz przy 4 mikrosekundach na piksel. Następnie narysuj ROI wokół komórek cNIFER, otaczając około trzech do czterech komórek na płaszczyznę.

Skonfiguruj analizę średniej intensywności zwrotu z inwestycji w czasie rzeczywistym. Następnie rozpocznij akwizycję, aby monitorować fluorescencję cNIFER w czasie i rozpocznij stymulację elektryczną lub eksperyment behawioralny podczas monitorowania progu.