Name: Klamry hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u przytomnych, nieskrępowanych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj technikę klamry hiperinsulinemiczno-euglikemicznej do oceny wrażliwości na insulinę u przytomnych, nieskrępowanych myszy. Metoda ta minimalizuje stres zwierząt poprzez cewnikowanie tętnicze i żylne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez grant 5-U24-DK059637-10 przyznany Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center.

<ol><li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+design+of+hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse.</a> Diabetes. 55, 390-397 (2006).</li>
<li>Berglund, E. D., Li, C. Y., Poffenberger, G., Ayala, J. E., Fueger, P. T., Willis, S. E., Jewell, M. M., Powers, A. C., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+in+vivo+in+four+commonly+used+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism in vivo in four commonly used inbred mouse strains.</a> Diabetes. 57, 1790-1799 (2008).</li>
<li>Niswender, K. D., Shiota, M., Postic, C., Cherrington, A. D., Magnuson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+glucokinase+gene+copy+number+on+glucose+homeostasis+and+hepatic+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of increased glucokinase gene copy number on glucose homeostasis and hepatic glucose metabolism.</a> J. Biol. Chem. 272, 22570-22575 (1997).</li>
<li>Kim, H. J., Higashimori, T., Park, S. Y., Choi, H., Dong, J., Kim, Y. J., Noh, H. L., Cho, Y. R., Cline, G., Kim, Y. B., Kim, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+interleukin-6+and+-10+on+skeletal+muscle+and+liver+insulin+action+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of interleukin-6 and -10 on skeletal muscle and liver insulin action in vivo.</a> Diabetes. 53, 1060-1067 (2004).</li>
<li>Kim, J. K., Fillmore, J. J., Chen, Y., Yu, C., Moore, I. K., Pypaert, M., Lutz, E. P., Kako, Y., Velez-Carrasco, W., Goldberg, I. J., Breslow, J. L., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+overexpression+of+lipoprotein+lipase+causes+tissue-specific+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific overexpression of lipoprotein lipase causes tissue-specific insulin resistance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 7522-7527 (2001).</li>
<li>Kim, J. K., Fillmore, J. J., Gavrilova, O., Chao, L., Higashimori, T., Choi, H., Kim, H. J., Yu, C., Chen, Y., Qu, X., Haluzik, M., Reitman, M. L., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+rosiglitazone+on+skeletal+muscle+and+liver+insulin+resistance+in+A-ZIP%2FF-1+fatless+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Differential effects of rosiglitazone on skeletal muscle and liver insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice.</a> Diabetes. 52, 1311-1318 (2003).</li>
<li>Kim, J. K., Fillmore, J. J., Sunshine, M. J., Albrecht, B., Higashimori, T., Kim, D. W., Liu, Z. X., Soos, T. J., Cline, G. W., O'Brien, W. R., Littman, D. R., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-theta+knockout+mice+are+protected+from+fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">PKC-theta knockout mice are protected from fat-induced insulin resistance.</a> J. Clin. Invest. 114, 823-827 (2004).</li>
<li>Kim, J. K., Gavrilova, O., Chen, Y., Reitman, M. L., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+insulin+resistance+in+A-ZIP%2FF-1+fatless+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of insulin resistance in A-ZIP/F-1 fatless mice.</a> J. Biol. Chem. 275, 8456-8460 (2000).</li>
<li>Kim, J. K., Gimeno, R. E., Higashimori, T., Kim, H. J., Choi, H., Punreddy, S., Mozell, R. L., Tan, G., Stricker-Krongrad, A., Hirsch, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+fatty+acid+transport+protein+1+prevents+fat-induced+insulin+resistance+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle.</a> J. Clin. Invest. 113, 756-763 (2004).</li>
<li>Kim, J. K., Kim, H. J., Park, S. Y., Cederberg, A., Westergren, R., Nilsson, D., Higashimori, T., Cho, Y. R., Liu, Z. X., Dong, J., Cline, G. W., Enerback, S., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-specific+overexpression+of+FOXC2+prevents+diet-induced+increases+in+intramuscular+fatty+acyl+CoA+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-specific overexpression of FOXC2 prevents diet-induced increases in intramuscular fatty acyl CoA and insulin resistance.</a> Diabetes. 54, 1657-1663 (2005).</li>
<li>Kim, J. K., Kim, Y. J., Fillmore, J. J., Chen, Y., Moore, I., Lee, J., Yuan, M., Li, Z. W., Karin, M., Perret, P., Shoelson, S. E., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+fat-induced+insulin+resistance+by+salicylate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate.</a> J. Clin. Invest. 108, 437-446 (2001).</li>
<li>Kim, J. K., Michael, P. revis, Peroni, S. F., Mauvais-Jarvis, O. D., Neschen, F., Kahn, S., Kahn, B. B., R, C., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+substrates+to+adipose+tissue+promotes+obesity+in+mice+with+selective+insulin+resistance+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Redistribution of substrates to adipose tissue promotes obesity in mice with selective insulin resistance in muscle.</a> J. Clin. Invest. 105, 1791-1797 (2000).</li>
<li>Kim, J. K., Zisman, A., Fillmore, J. J., Peroni, O. D., Kotani, K., Perret, P., Zong, H., Dong, J., Kahn, C. R., Kahn, B. B., Shulman, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+and+the+development+of+diabetes+in+mice+with+muscle-specific+inactivation+of+GLUT4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity and the development of diabetes in mice with muscle-specific inactivation of GLUT4.</a> J. Clin. Invest. 108, 153-160 (2001).</li>
<li>Haluzik, M., Gavrilova, O., LeRoith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha+deficiency+does+not+alter+insulin+sensitivity+in+mice+maintained+on+regular+or+high-fat+diet%3A+hyperinsulinemic-euglycemic+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha deficiency does not alter insulin sensitivity in mice maintained on regular or high-fat diet: hyperinsulinemic-euglycemic clamp studies.</a> Endocrinology. 145, 1662-1667 (2004).</li>
<li>Haluzik, M., Yakar, S., Gavrilova, O., Setser, J., Boisclair, Y., LeRoith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+in+the+liver-specific+IGF-1+gene-deleted+mouse+is+abrogated+by+deletion+of+the+acid-labile+subunit+of+the+IGF-binding+protein-3+complex%3A+relative+roles+of+growth+hormone+and+IGF-1+in+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance in the liver-specific IGF-1 gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-1 in insulin resistance.</a> Diabetes. 52, 2483-2489 (2003).</li>
<li>Haluzik, M. M., Lacinova, Z., Dolinkova, M., Haluzikova, D., Housa, D., Horinek, A., Vernerova, Z., Kumstyrova, T., Haluzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+insulin+sensitivity+after+peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha+agonist+treatment+is+accompanied+by+paradoxical+increase+of+circulating+resistin+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Improvement of insulin sensitivity after peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment is accompanied by paradoxical increase of circulating resistin levels.</a> Endocrinology. 147, 4517-4524 (2006).</li>
<li>Kim, H., Haluzik, M., Asghar, Z., Yau, D., Joseph, J. W., Fernandez, A. M., Reitman, M. L., Yakar, S., Stannard, B., Heron-Milhavet, L., Wheeler, M. B., LeRoith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha+agonist+treatment+in+a+transgenic+model+of+type+2+diabetes+reverses+the+lipotoxic+state+and+improves+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist treatment in a transgenic model of type 2 diabetes reverses the lipotoxic state and improves glucose homeostasis.</a> Diabetes. 52, 1770-1778 (2003).</li>
<li>Deibert, D. C., DeFronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epinephrine-induced+insulin+resistance+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epinephrine-induced insulin resistance in man.</a> J. Clin. Invest. 65, 717-721 (1980).</li>
<li>Rizza, R. A., Cryer, P. E., Haymond, M. W., Gerich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+mechanisms+for+the+effects+of+epinephrine+on+glucose+production+and+clearance+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Adrenergic mechanisms for the effects of epinephrine on glucose production and clearance in man.</a> J. Clin. Invest. 65, 682-689 (1980).</li>
<li>Nunemaker, C. S., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Sweet, I. R., Teague, J. C., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+in+the+conscious+mouse+is+biphasic+and+pulsatile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion in the conscious mouse is biphasic and pulsatile.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 523-529 (2006).</li>
<li>Nunemaker, C. S., Zhang, M., Wasserman, D. H., McGuinness, O. P., Powers, A. C., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+mice+can+be+distinguished+by+the+period+of+their+islet+calcium+oscillations%3A+is+there+an+intrinsic+islet+period+that+is+imprinted+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Individual mice can be distinguished by the period of their islet calcium oscillations: is there an intrinsic islet period that is imprinted in vivo.</a> Diabetes. 54, 3517-3522 (2005).</li>
<li>Halter, J. B., Beard, J. C., Jr, P. orte, D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+function+and+stress+hyperglycemia%3A+plasma+glucose+and+epinephrine+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Islet function and stress hyperglycemia: plasma glucose and epinephrine interaction.</a> Am. J. Physiol. 247, 47-52 (1984).</li>
<li>Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterregulatory+deficits+occur+within+24+h+of+a+single+hypoglycemic+episode+in+conscious%2C+unrestrained%2C+chronically+cannulated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, 678-684 (2006).</li>
<li>Jacobson, L., Ansari, T., Potts, J., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-deficient+corticotropin-releasing+hormone+knockout+mice+maintain+glucose+requirements+but+not+autonomic+responses+during+repeated+hypoglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-deficient corticotropin-releasing hormone knockout mice maintain glucose requirements but not autonomic responses during repeated hypoglycemia.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, 15-22 (2006).</li>
<li>Ayala, J. E., Bracy, D. P., James, F. D., Julien, B. M., Wasserman, D. H., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucagon-like+peptide-1+receptor+regulates+endogenous+glucose+production+and+muscle+glucose+uptake+independent+of+its+incretin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The glucagon-like peptide-1 receptor regulates endogenous glucose production and muscle glucose uptake independent of its incretin action.</a> Endocrinology. 150, 1155-1164 (2009).</li>
<li>Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Granner, D. K., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexokinase+II+overexpression+improves+exercise-stimulated+but+not+insulin-stimulated+muscle+glucose+uptake+in+high-fat-fed+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hexokinase II overexpression improves exercise-stimulated but not insulin-stimulated muscle glucose uptake in high-fat-fed C57BL/6J mice.</a> Diabetes. 53, 306-314 (2004).</li>
<li>Fueger, P. T., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+control+of+glucose+uptake+by+working+muscles+of+conscious+mice%3A+roles+of+transport+and+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Distributed control of glucose uptake by working muscles of conscious mice: roles of transport and phosphorylation.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 286, 77-84 (2004).</li>
<li>Fueger, P. T., Heikkinen, S., Bracy, D. P., Malabanan, C. M., Pencek, R. R., Laakso, M., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexokinase+II+partial+knockout+impairs+exercise-stimulated+glucose+uptake+in+oxidative+muscles+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hexokinase II partial knockout impairs exercise-stimulated glucose uptake in oxidative muscles of mice.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, 958-963 (2003).</li>
<li>Fueger, P. T., Hess, H. S., Posey, K. A., Bracy, D. P., Pencek, R. R., Charron, M. J., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+exercise-stimulated+muscle+glucose+uptake+by+GLUT4+is+dependent+on+glucose+phosphorylation+capacity+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Control of exercise-stimulated muscle glucose uptake by GLUT4 is dependent on glucose phosphorylation capacity in the conscious mouse.</a> J. Biol. Chem. , (2004).</li>
<li>Fueger, P. T., Li, C. Y., Ayala, J. E., Shearer, J., Bracy, D. P., Charron, M. J., Rottman, J. N., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+kinetics+and+exercise+tolerance+in+mice+lacking+the+GLUT4+glucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose kinetics and exercise tolerance in mice lacking the GLUT4 glucose transporter.</a> J. Physiol. 582, 801-812 (2007).</li>
<li>Shearer, J., Coenen, K. R., Pencek, R. R., Swift, L. L., Wasserman, D. H., Rottman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+fatty+acid+uptake+in+vivo%3A+comparison+of+%5B125I%5D-BMIPP+and+%5B3H%5D-bromopalmitate%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Long chain fatty acid uptake in vivo: comparison of [125I]-BMIPP and [3H]-bromopalmitate.</a> Lipids. 43, 703-711 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Zaciśnięcie hiperinsulinemiczno-euglikemiczne, czyli clamp insulinowy, jest powszechnie uważane za „złoty standard” w ocenie działania insuliny in vivo. Technikę tę stosowano u wielu gatunków, w tym u ludzi, psów, szczurów i myszy. Ze względu na rosnącą liczbę transgenicznych modeli mysich w badaniach nad zaburzeniami metabolicznymi, miniaturyzacja tej metody do zastosowania u myszy przyczyniła się do znaczącego postępu w badaniach nad metabolizmem.
Choć koncepcje stojące za zaciskiem insulinowym (insulin clamp) są proste, w praktyce stosuje się różne podejścia do przeprowadzania eksperymentów z wykorzystaniem tej metody. Nie jest to kwestia drugorzędna, ponieważ sposób przeprowadzenia eksperymentu wpływa na uzyskane wyniki1. Przedstawiamy tutaj protokół stosowany w Vanderbilt MMPC. Kluczową różnicą między naszym protokołem a innymi jest wykorzystanie cewnika tętniczego do pobierania próbek krwi. Stanowi to kontrast do powszechniej stosowanego podejścia, polegającego na pobieraniu krwi poprzez odcięcie końcówki ogona4, 7, 11, 12, 14-17. Zaletą pobierania próbek z cewnika tętniczego jest możliwość przeprowadzenia eksperymentu na myszy świadomej i nieunieruchomionej. Pobieranie krwi z ogona często wymaga unieruchomienia zwierzęcia i zwiększa wskaźniki stresu przy pobieraniu dużych objętości krwi1. Hormony stresu stymulują endogenną produkcję glukozy i upośledzają jej utylizację18, 19, co może stwarzać pozory fenotypu insulinoopornego. Pobieranie krwi z odciętego ogona może wymagać specjalnej zgody Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) ze względu na stresogenny charakter tej procedury. Procedura kaniulacji tętnicy została opracowana, aby uniknąć stresu związanego z odcinaniem ogona u myszy.
Kluczowym aspektem przeprowadzania zacisków insulinowych (insulin clamps) jest zdolność do utrzymania euglikemii. Nie istnieją algorytmy, które mogłyby prawidłowo przewidzieć, w jaki sposób należy dostosować GIR na podstawie pomiarów glukozy we krwi. Podobnie jak w przypadku zabiegu chirurgicznego, personel przeprowadzający eksperymenty z zaciskiem insulinowym nabierze biegłości w utrzymywaniu stabilnej euglikemii jedynie poprzez doświadczenie. Należy zauważyć, że ze względu na wyższy wskaźnik metaboliczny, dane uzyskane w badaniach na myszach będą z natury obarczone większym szumem. Powoduje to, że kompletna prezentacja danych, w tym przebiegi czasowe glukozy i GIR oraz wartości bezwzględne insuliny w osoczu, endoRa, Rd i Rg, jest kluczowa dla możliwości interpretacji wyników przez każdego czytelnika. Wysokie tempo przepływu glukozy u myszy (około 5 razy wyższe niż u ludzi) uzasadnia wysoką częstotliwość pobierania próbek glukozy. Chociaż objętość krwi myszy jest ograniczona, minimalna częstotliwość pobierania próbek raz na 10 minut jest niezbędna, aby mieć pewność, że osiągnięto odpowiedni poziom zacisku.
Jak pokazano na Rysunku 4, poziomy insuliny podczas zacisku (clamp) mogą się różnić między grupami. Czynniki takie jak interwencje dietetyczne, manipulacje transgeniczne lub różnice w szczepach tła mogą wpływać na poziom insuliny na czczo, co z kolei może oddziaływać na poziomy insuliny podczas zacisku. Interpretacja wyników w przypadku różnic w poziomach insuliny podczas zacisku może być problematyczna. Można temu zaradzić eksperymentalnie, przeprowadzając badania pilotażowe w celu wybrania takich prędkości wlewu insuliny, które zapewnią równoważne poziomy insuliny podczas zacisku pomiędzy grupami. Alternatywnie można zastosować somatostatynę do zahamowania wydzielania hormonów trzustkowych, a następnie zastąpić insulinę i glukagon w eksperymentalnie kontrolowanych dawkach. To drugie podejście jest częściej stosowane w zaciskach insulinowych u szczurów niż u myszy. Jeśli nie zastosowano tych metod eksperymentalnych, wartość GIR w stanie stacjonarnym można znormalizować do poziomu insuliny podczas zacisku lub z danych z zacisku można wyprowadzić wskaźnik wrażliwości na insulinę (SI) jako SI=GIR/(G•ΔI), gdzie G to stężenie glukozy w stanie stacjonarnym, a ΔI to różnica między stężeniem insuliny na czczo a stężeniem podczas zacisku. Założeniem w obu tych podejściach jest to, że osiągnięty poziom insuliny podczas zacisku mieści się w zakresie, w którym wrażliwość na insulinę jest liniowo powiązana z poziomem insuliny dla badanej grupy. To ostatnie założenie może nie mieć zastosowania przy porównywaniu grup z insulinoopornością i grup wrażliwych na insulinę. Idealnie należałoby wygenerować krzywą odpowiedzi na dawkę insuliny, aby dobrać odpowiedni wlew insuliny. Jednak ze względu na konieczność przeprowadzenia dodatkowych eksperymentów, rzadko się to robi.
Wszechstronność zapewniana przez cewnikowanie tętnicze znajduje zastosowanie w podejściach eksperymentalnych wykraczających poza zaciski euglikemiczne. Na przykład zaciski hiperglikemiczne, w których glukozę wlewa się z różną prędkością w celu utrzymania hiperglikemii w stosunku do poziomu glukozy na czczo, mogą być wykorzystywane do oceny endogennej funkcji trzustki in vivo2, 20, 21. Pomiar pierwszej fazy sekrecji insuliny podczas tego testu wymaga częstego pobierania próbek krwi (tj. co 2-5 min), co nie jest możliwe przy pobieraniu próbek z końcówki ogona. Co więcej, podwyższony poziom katecholamin wynikający z pobierania krwi z ogona może upośledzić sekrecję insuliny i nasilić sekrecję glukagonu22. Protokół zacisku insulinowego można również zmodyfikować tak, aby umożliwić spadek poziomu glukozy do względnej hipoglikemii w celu oceny odpowiedzi przeciwregulacyjnej2, 23, 24. Cewnikowanie tętnicze może być również stosowane do oceny dynamiki metabolizmu glukozy podczas wysiłku fizycznego25-30. Jest to znacznie korzystniejsze niż konwencjonalne podejścia prowadzone w pojedynczych punktach czasowych przed i po wysiłku lub w izolowanych mięśniach ex vivo. Zaprezentowane tutaj techniki mogą być wykorzystywane do oceny nie tylko glukozy, ale także metabolizmu kwasów tłuszczowych31.

zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Cukrzyca typu 2 charakteryzuje się zaburzeniem działania insuliny. Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, czyli clamp insulinowy, jest powszechnie uważany za „złoty standard” metody oceny działania insuliny in vivo. Podczas clampu insulinowego hiperinsulinemię osiąga się poprzez stały wlew insuliny. Euglikemię utrzymuje się za pomocą jednoczesnego wlewu glukozy ze zmienną prędkością. Ta zmienna prędkość wlewu glukozy (GIR) jest określana poprzez pomiar glukozy we krwi w krótkich odstępach czasu w trakcie całego eksperymentu i odpowiednią regulację GIR. GIR jest wskaźnikiem ogólnoustrojowego działania insuliny, ponieważ myszy z nasilonym działaniem insuliny wymagają wyższego GIR. Clamp insulinowy może obejmować podawanie izotopowego 2[14C]deoksyglukozy w celu oceny specyficznego dla tkanek wychwytu glukozy oraz [3-3H]glukozy w celu oceny zdolności insuliny do tłumienia szybkości pojawiania się endogennej glukozy (endoRa), będącej markerem wątrobowej produkcji glukozy, oraz do stymulowania szybkości ogólnoustrojowego zanikania glukozy (Rd).
Miniaturyzacja zacisku insulinowego (insulin clamp) do zastosowania w genetycznych modelach mysich chorób metabolicznych doprowadziła do znaczących postępów w badaniach nad cukrzycą. Metody przeprowadzania zacisków insulinowych różnią się w zależności od laboratorium. Należy zauważyć, że sposób wykonania zacisku insulinowego może istotnie wpływać na uzyskane wyniki. Opublikowaliśmy kompleksową ocenę różnych podejść do przeprowadzania zacisków insulinowych u przytomnych myszy1, a także ocenę odpowiedzi metabolicznej czterech powszechnie stosowanych inbredalnych szczepów myszy z wykorzystaniem różnych technik zacisku2. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania zacisków insulinowych u przytomnych, nieunieruchomionych myszy, opracowany przez Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). Obejmuje on opis metody implantacji cewników wykorzystywanych podczas zacisku insulinowego. Protokół stosowany przez Vanderbilt MMPC wykorzystuje unikalny system dwucewnikowy3. Jeden cewnik jest wprowadzany do żyły szyjnej w celu przeprowadzania infuzji. Drugi cewnik jest wprowadzany do tętnicy szyjnej, co umożliwia pobieranie krwi bez konieczności unieruchamiania lub manipulowania myszą. Technika ta stanowi znaczącą przewagę nad najczęstszą metodą pobierania próbek krwi podczas zacisków insulinowych, polegającą na pobieraniu krwi z odciętego końca ogona. W przeciwieństwie do tej drugiej metody, pobieranie krwi z cewnika tętniczego nie wywołuje stresu u myszy1. Opisujemy również metody wykorzystania infuzji znaczników izotopowych do oceny tkankowo specyficznego działania insuliny. Dostarczamy także wytyczne dotyczące właściwej prezentacji wyników uzyskanych z zacisków insulinowych.

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Cukrzyca typu 2 charakteryzuje się zaburzeniem działania insuliny. Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest powszechnie uważany za „złoty standard...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena działania insuliny w całym organizmie oraz w konkretnych tkankach u świadomych, niepodstresowanych myszy, bez konieczności ich manipulowania. Osiąga się to poprzez chirurgiczne wszczepienie cewnika do żyły szyjnej w celu prowadzenia infuzji oraz drugiego do tętnicy szyjnej w celu pobierania próbek krwi. Po pięcio- do siedmiodniowym okresie rekonwalescencji myszy, które były głodzone przez pięć godzin, otrzymują infuzję insuliny w celu wywołania fizjologicznej hiperinsulinemii.Następnie mierzy się poziom glukozy z cewnika tętnicznego, a glikemię utrzymuje się poprzez regulację szybkości infuzji glukozy. Eksperyment ten pozwala na pomiar różnic w insulinowrażliwości całego organizmu w oparciu o bezpośrednią zależność między szybkością infuzji glukozy niezbędną do utrzymania glikemii a działaniem insuliny. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod pobierania krwi, takich jak nacinanie ogona, jest to, że chirurgicznie implantowany cewnik tętniczy zapewnia dostęp naczyniowy do myszy, co pozwala na pobieranie próbek krwi bez konieczności manipulowania zwierzęciem.Dzięki temu możemy przeprowadzać te eksperymenty na myszach niepoddanych stresowi i nieograniczonych w ruchach. Cewnik tętniczy wykonuje się poprzez włożenie ściętego fragmentu rurki PE 10 do sześciocentymetrowego odcinka rurki astic, w taki sposób, aby PE 10 wystawała 0,9 cm poza sel. Cewnik żylny stanowi sześciocentymetrowy fragment rurki SEL z kołnierzem.Matrycę konstruuje się poprzez włożenie trzechcentymetrowych odcinków PE 20 do każdego z dwóch 1,3-centymetrowych konektorów ze stali nierdzewnej o rozmiarze 25 gauge, pod kątem około 120 stopni. Są one następnie umieszczane w kropelce medycznego kleju silikonowego, jak pokazano tutaj. Aby rozpocząć implantację cewnika, należy umieścić znieczuczoną mysz na czystej powierzchni roboczej, stosując technikę sterylną. Wykonuje się nacięcie pięć milimetrów na prawo od linii środkowej.Wyizoluj prawą żyłę szyjną. Ostrożnie podwiąż odgałęzienie głowowe nicią jedwabną, a na końcu ogonowym luźno zawiąż kolejny fragment nici. Następnie, za pomocą nożyczek sprężynowych, przetnij naczynie tuż poniżej podwiązania głowowego i wprowadź cewnik aż do koralika ograniczającego.Zawiąż szew za koralikiem i potwierdź drożność cewnika, podłączając jego wolny koniec do strzykawki do pobierania próbek. Aby wprowadzić cewnik tętniczy, wykonaj małe nacięcie pięć milimetrów na lewo od mostka i w kierunku głowowym względem pierwszego nacięcia. Wyizoluj lewą tętnicę szyjną wspólną, a następnie podwiąż jej odcinek głowowy.Zakończ szwem jedwabnym i zawiąż luźny węzeł. Kolejny odcinek szwu załóż na końcu proksymalnym odsłoniętego naczynia. Następnie zaklemuj koniec dystalny naczynia.Następnie należy przeciąć naczynie tuż poniżej podwiązanego końca za pomocą nożyczek sprężynowych. Ostrożnie wprowadź cewnik aż do zacisku. Następnie ostrożnie zwolnij zacisk i przesuń cewnik do połączenia Astic P.Mocno zawiąż ligatury na cewniku i potwierdź drożność cewnika, podłączając jego wolny koniec do strzykawki do pobierania próbek. Następnie odwróć zwierzę i wykonaj niewielkie nacięcie między łopatkami, a następnie przeprowadź igłę o rozmiarze 14G pod skórą, od nacięć z przodu do nacięcia na plecach. Przeciągnij cewniki przez igłę, aby wyprowadzić je na plecy myszy.Podłącz cewniki tętniczy i żylny do odpowiednich złączy na antenie mysiej, aby uzyskać dostęp do pobierania próbek lub do masa. Następnie wprowadź masa do nacięcia między łopatkami. Zamknij oba nacięcia szwem nylonowym.Potwierdź drożność obu cewników. Umieść mysz w ciepłej, czystej klatce w celu rekonwalescencji i pozwól myszy odpocząć przez co najmniej pięć dni przed wykonaniem zacisku insulinowego. Najtrudniejszym etapem przeprowadzania zacisku hiperinsulinemiczno-euglikemicznego u myszy jest próba utrzymania euglikemii.Myszy charakteryzują się bardzo szybkim metabolizmem, a ich poziom glukozy może ulec znacznym zmianom w trakcie trwania eksperymentu. Wymaga to pewnej praktyki, aby wyrobić wyczucie tego, jak poziom glukozy u myszy będzie się zmieniał w czasie badania, a następnie jak dostosować szybkość wlewu glukozy, aby utrzymać stabilną glikemię. Układ dla standardowego zacisku (clamp) przedstawiono tutaj.Trzy zestawy do infuzji (infuse eight), glukoza, insulina i wypłukane erytrocyty są podłączone do czterodrożnego konektora połączonego z obrotowym złączem (swivel) i zawieszone nad myszą. Port infuzyjny złącza obrotowego jest podłączony do cewnika żylnego. Przed podłączeniem myszy należy wypełnić wszystkie linie zestawów do infuzji roztworem soli fizjologicznej.Następnie wypełnij linię pobierania solą fizjologiczną z heparyną. Pozostaw strzykawkę z solą fizjologiczną z heparyną podłączoną do górnej części obrotowego złącza, usuwając strzykawkę do płukania. Rozpocznij głodzenie myszy na pięć do sześciu godzin przed rozpoczęciem klamrowania.Trzy godziny po rozpoczęciu postu zważ mysz i podłącz cewniki żylny oraz tętniczy odpowiednio do linii infuzyjnej i linii do pobierania próbek. Na 15 minut przed rozpoczęciem zacisku wprowadź pusty pasek do glukometru ręcznego. Następnie pobierz około 50 µL krwi do strzykawki płuczącej, aby usunąć sól fizjologiczną z linii, a następnie odłącz strzykawkę płuczącą.Zmierz poziom glukozy we krwi, dotykając paskiem do pomiaru glukozy kropli krwi formującej się na końcu cewnika. Następnie wprowadź strzykawkę z tępą igłą do linii pobraniowej i pobierz 50 µL krwi. Przenieś krew do probówki powlekanej EDTA i odwiruj ją w wirówce, aby uzyskać osocze do pomiarów podstawowego poziomu hormonów i metabolitów.W tym momencie należy ponownie włożyć strzykawkę do oczyszczania i odciągnąć tłok. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, należy ponownie wprowadzić 50 µL pobranej wcześniej krwi. Zapisz wartość poziomu glukozy we krwi odczytaną z glukometru.Po 10 minutach należy ponownie zmierzyć poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru i strzykawki płuczącej, a następnie pobrać kolejne 50 µL krwi w celu uzyskania drugiej próbki osocza. Po wykonaniu drugich pomiarów bazowych należy napełnić linie infuzyjne dla glukozy, insuliny i przemytych solą fizjologiczną erytrocytów aż do złącza czterodrożnego. Złącze czterodrożne należy podłączyć do rurki przymocowanej do obrotowego portu infuzyjnego.Zacznij od infuzji erytrocytów przemytych solą fizjologiczną. Ustaw szybkość infuzji tak, aby zastępować całkowitą objętość pobieranej krwi przez cały czas trwania badania. Gdy infuzja erytrocytów dotrze do myszy, rozpocznij infuzje insuliny i glukozy.Jest to czas równy zero minut. Insulinę podaje się w infuzji ze stałą, wcześniej określoną prędkością. Początkową prędkość infuzji glukozy szacuje się na podstawie wyjściowego poziomu glukozy we krwi oraz wcześniejszego doświadczenia.Przez następne dwie godziny należy mierzyć poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru i dostosowywać szybkość infuzji glukozy w celu utrzymania docelowej glikemii. W odstępach 10-minutowych należy zapisywać nowe odczyty glukozy oraz szybkości infuzji glukozy; w 100. i 120. minucie należy pobrać dodatkowe próbki krwi do pomiaru poziomu insuliny w osoczu oraz innych hormonów lub metabolitów. Przedstawiono tutaj przebieg czasowy poziomów glukozy w trakcie procedury clamp, co demonstruje, jak skutecznie utrzymywano glikemię zarówno u myszy karmionych standardową karmą, jak i karmą wysokotłuszczową przez cały czas trwania clampu. Przebieg czasowy szybkości infuzji glukozy pokazuje, że szybkość niezbędna do utrzymania glikemii jest znacznie niższa w grupie karmionej dietą wysokotłuszczową, co wskazuje na upośledzenie insulinowrażliwości całego organizmu.Zarówno na czczo, jak i podczas zacisku (clamp), poziomy insuliny są wyższe w grupie karmionej dietą wysokotłuszczową, co dodatkowo potwierdza występowanie fenotypu insulinooporności. U tych myszy do oszacowania szybkości pojawiania się glukozy endogennej wykorzystuje się glukozę znakowaną trytem. Endo A stanowi indeks wątrobowej produkcji glukozy, podczas gdy insulina całkowicie hamuje Endo A u myszy kontrolnych.Supresja jest upośledzona u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową. Podobnie, glukoza TRID jest wykorzystywana do oszacowania szybkości zaniku glukozy w całym organizmie. Zdolność insuliny do stymulowania Rd jest upośledzona u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową.2-deoksyglukoza znakowana węglem 14 jest wykorzystywana do oceny indeksu metabolicznego glukozy RG, który stanowi miarę swoistego dla tkanek poboru glukozy. Jak pokazano w tym przykładzie, stymulowany insuliną pobór glukozy do mięśni szkieletowych jest upośledzony u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z mikrochirurgią niezbędną do implantacji cewników tętniczych i żylnych.Zabieg ten wymaga bardzo wyspecjalizowanych umiejętności i regularnej praktyki przez kilka miesięcy, aby osiągnąć biegłość w przeprowadzaniu operacji do hiperinsulinemicznego clampu glikemicznego; trudność polega ponownie na próbie utrzymania glikemii u modelu zwierzęcego o bardzo wysokim metabolizmie.

hyperinsulinemic-euglycemic-clamps-in-conscious-unrestrained-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Klamry hiperinsulinemowo-normoglikemічнe u świadomych, niepowstrzymanych myszy

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny jest „złotym standardem” w ocenie działania insuliny. Insulinę podaje się w stałym tempie, co stymuluje wychwyt glukozy. Ilość egzogennej glukozy podawanej w celu przeciwdziałania temu spadkowi jest wskaźnikiem wrażliwości na insulinę. W niniejszym materiale procedura jest przeprowadzana na przytomnym, nieskrępowanym szczurze.

Zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny u świadłego szczura

Ten protokół bada rolę ligandu 5 (CCL5) chemokiny (motyw C-C) w podwzgórzu, dostarczając antagonistę, MetCCL5, do mózgu myszy za pomocą systemu infuzji mózgu za pomocą mikro-pompy osmotycznej. To przejściowe zahamowanie aktywności CCL5 przerwało sygnalizację insuliny w podwzgórzu, prowadząc do nietolerancji glukozy i obwodowej ogólnoustrojowej wrażliwości na insulinę.

Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy

Zacisk hiperglikemiczny służy do pomiaru uwalniania insuliny przy utrzymującym się wyższym stężeniu glukozy we krwi. Zacisk hipoglikemiczny służy do pomiaru produkcji glukozy indukowanej reakcjami przeciwregulacyjnymi. Obie metody wykorzystują tę samą procedurę chirurgiczną. W tym miejscu przedstawiamy technikę zaciskową do oceny ogólnoustrojowego metabolizmu glukozy.

Zacisk hiperglikemiczny i zacisk hipoglikemiczny u świadomych myszy

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Programowa stymulacja elektryczna umożliwia określenie właściwości przewodzenia w sercu oraz indukcję i terminację arytmii serca przy użyciu różnych protokołów stymulacji. Przy użyciu cewnika przezżylnego można uzyskać zapisy elektrogramów wewnątrzsercowych u myszy po zastosowaniu protokołów programowej stymulacji elektrycznej w celu zidentyfikowania podłoży arytmogennych.

Programowana stymulacja elektryczna u myszy

Echokardiografia przezklatkowa stanowi nieinwazyjną metodę oceny funkcji serca u myszy. Połączenie obrazowania ultradźwiękowego i dopplerowskiego pozwala na wykonanie pomiarów wymiarów serca oraz przepływu krwi wewnątrzsercowego, co łącznie umożliwia ocenę funkcji skurczowej i rozkurczowej serca.

Echokardiografia przezklatkowa u myszy

Dostęp naczyniowy do pomiaru hemodynamiki, dostarczania płynów i pobierania próbek krwi jest ważny dla każdego badania na małym modelu zwierzęcym. Przedstawiamy technikę wszczepiania cewników do tętnicy szyjnej i żyły szyjnej wspólnej u znieczulonego szczura w celu podłączenia do systemu w celu przeprowadzenia monitorowania, infuzji i pobierania próbek.

Cewnikowanie tętnicy szyjnej i żyły szyjnej w celu wykonania pomiarów hemodynamicznych, infuzji i pobierania próbek krwi w świadomym modelu szczurzym

Ta metoda została opracowana w celu dostarczenia stałego roztworu leku przez tętnicę szyjną, aby ocenić farmakokinetykę nowych leków w modelach mysich.

Wlewy z tętnic szyjnych do analizy farmakokinetycznej i farmakodynamicznej taksanów u myszy

Określenie współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) jest złotym standardem do oceny ogólnej funkcji nerek. Jednak tradycyjne procedury pomiaru tego parametru są kłopotliwe i wymagają dużej inwestycji czasu. W tym miejscu opisujemy szybszą i minimalnie inwazyjną metodę przezskórnego oznaczania GFR.

Przezskórna ocena czynności nerek u świadomych gryzoni

Znieczulone myszy wykazują niefizjologiczne ogólnoustrojowe ciśnienie krwi, co uniemożliwia miarodajną ocenę tonu autonomicznego, biorąc pod uwagę ścisły związek między ciśnieniem krwi a autonomicznym układem nerwowym. W związku z tym przedstawiono nowatorską metodę jednoczesnego rejestrowania aktywności nerkowego nerwu współczulnego i ciśnienia krwi za pomocą wlewu dożylnego u przytomnych myszy.

Nowatorskie podejście do jednoczesnego rejestrowania aktywności nerek współczulnych i ciśnienia krwi za pomocą wlewu dożylnego u przytomnych, nieskrępowanych myszy.

Poznaj technikę klamry hiperinsulinemiczno-euglikemicznej do oceny wrażliwości na insulinę u przytomnych, nieskrępowanych myszy. Metoda ta minimalizuje stres zwierząt poprzez cewnikowanie tętnicze i żylne.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Przeglądaj więcej filmów