Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena działania insuliny w całym organizmie oraz w konkretnych tkankach u świadomych, niepodstresowanych myszy, bez konieczności ich manipulowania. Osiąga się to poprzez chirurgiczne wszczepienie cewnika do żyły szyjnej w celu prowadzenia infuzji oraz drugiego do tętnicy szyjnej w celu pobierania próbek krwi. Po pięcio- do siedmiodniowym okresie rekonwalescencji myszy, które były głodzone przez pięć godzin, otrzymują infuzję insuliny w celu wywołania fizjologicznej hiperinsulinemii.

Następnie mierzy się poziom glukozy z cewnika tętnicznego, a glikemię utrzymuje się poprzez regulację szybkości infuzji glukozy. Eksperyment ten pozwala na pomiar różnic w insulinowrażliwości całego organizmu w oparciu o bezpośrednią zależność między szybkością infuzji glukozy niezbędną do utrzymania glikemii a działaniem insuliny. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod pobierania krwi, takich jak nacinanie ogona, jest to, że chirurgicznie implantowany cewnik tętniczy zapewnia dostęp naczyniowy do myszy, co pozwala na pobieranie próbek krwi bez konieczności manipulowania zwierzęciem.

Dzięki temu możemy przeprowadzać te eksperymenty na myszach niepoddanych stresowi i nieograniczonych w ruchach. Cewnik tętniczy wykonuje się poprzez włożenie ściętego fragmentu rurki PE 10 do sześciocentymetrowego odcinka rurki astic, w taki sposób, aby PE 10 wystawała 0,9 cm poza sel. Cewnik żylny stanowi sześciocentymetrowy fragment rurki SEL z kołnierzem.

Matrycę konstruuje się poprzez włożenie trzechcentymetrowych odcinków PE 20 do każdego z dwóch 1,3-centymetrowych konektorów ze stali nierdzewnej o rozmiarze 25 gauge, pod kątem około 120 stopni. Są one następnie umieszczane w kropelce medycznego kleju silikonowego, jak pokazano tutaj. Aby rozpocząć implantację cewnika, należy umieścić znieczuczoną mysz na czystej powierzchni roboczej, stosując technikę sterylną. Wykonuje się nacięcie pięć milimetrów na prawo od linii środkowej.

Wyizoluj prawą żyłę szyjną. Ostrożnie podwiąż odgałęzienie głowowe nicią jedwabną, a na końcu ogonowym luźno zawiąż kolejny fragment nici. Następnie, za pomocą nożyczek sprężynowych, przetnij naczynie tuż poniżej podwiązania głowowego i wprowadź cewnik aż do koralika ograniczającego.

Zawiąż szew za koralikiem i potwierdź drożność cewnika, podłączając jego wolny koniec do strzykawki do pobierania próbek. Aby wprowadzić cewnik tętniczy, wykonaj małe nacięcie pięć milimetrów na lewo od mostka i w kierunku głowowym względem pierwszego nacięcia. Wyizoluj lewą tętnicę szyjną wspólną, a następnie podwiąż jej odcinek głowowy.

Zakończ szwem jedwabnym i zawiąż luźny węzeł. Kolejny odcinek szwu załóż na końcu proksymalnym odsłoniętego naczynia. Następnie zaklemuj koniec dystalny naczynia.

Następnie należy przeciąć naczynie tuż poniżej podwiązanego końca za pomocą nożyczek sprężynowych. Ostrożnie wprowadź cewnik aż do zacisku. Następnie ostrożnie zwolnij zacisk i przesuń cewnik do połączenia Astic P.

Mocno zawiąż ligatury na cewniku i potwierdź drożność cewnika, podłączając jego wolny koniec do strzykawki do pobierania próbek. Następnie odwróć zwierzę i wykonaj niewielkie nacięcie między łopatkami, a następnie przeprowadź igłę o rozmiarze 14G pod skórą, od nacięć z przodu do nacięcia na plecach. Przeciągnij cewniki przez igłę, aby wyprowadzić je na plecy myszy.

Podłącz cewniki tętniczy i żylny do odpowiednich złączy na antenie mysiej, aby uzyskać dostęp do pobierania próbek lub do masa. Następnie wprowadź masa do nacięcia między łopatkami. Zamknij oba nacięcia szwem nylonowym.

Potwierdź drożność obu cewników. Umieść mysz w ciepłej, czystej klatce w celu rekonwalescencji i pozwól myszy odpocząć przez co najmniej pięć dni przed wykonaniem zacisku insulinowego. Najtrudniejszym etapem przeprowadzania zacisku hiperinsulinemiczno-euglikemicznego u myszy jest próba utrzymania euglikemii.

Myszy charakteryzują się bardzo szybkim metabolizmem, a ich poziom glukozy może ulec znacznym zmianom w trakcie trwania eksperymentu. Wymaga to pewnej praktyki, aby wyrobić wyczucie tego, jak poziom glukozy u myszy będzie się zmieniał w czasie badania, a następnie jak dostosować szybkość wlewu glukozy, aby utrzymać stabilną glikemię. Układ dla standardowego zacisku (clamp) przedstawiono tutaj.

Trzy zestawy do infuzji (infuse eight), glukoza, insulina i wypłukane erytrocyty są podłączone do czterodrożnego konektora połączonego z obrotowym złączem (swivel) i zawieszone nad myszą. Port infuzyjny złącza obrotowego jest podłączony do cewnika żylnego. Przed podłączeniem myszy należy wypełnić wszystkie linie zestawów do infuzji roztworem soli fizjologicznej.

Następnie wypełnij linię pobierania solą fizjologiczną z heparyną. Pozostaw strzykawkę z solą fizjologiczną z heparyną podłączoną do górnej części obrotowego złącza, usuwając strzykawkę do płukania. Rozpocznij głodzenie myszy na pięć do sześciu godzin przed rozpoczęciem klamrowania.

Trzy godziny po rozpoczęciu postu zważ mysz i podłącz cewniki żylny oraz tętniczy odpowiednio do linii infuzyjnej i linii do pobierania próbek. Na 15 minut przed rozpoczęciem zacisku wprowadź pusty pasek do glukometru ręcznego. Następnie pobierz około 50 µL krwi do strzykawki płuczącej, aby usunąć sól fizjologiczną z linii, a następnie odłącz strzykawkę płuczącą.

Zmierz poziom glukozy we krwi, dotykając paskiem do pomiaru glukozy kropli krwi formującej się na końcu cewnika. Następnie wprowadź strzykawkę z tępą igłą do linii pobraniowej i pobierz 50 µL krwi. Przenieś krew do probówki powlekanej EDTA i odwiruj ją w wirówce, aby uzyskać osocze do pomiarów podstawowego poziomu hormonów i metabolitów.

W tym momencie należy ponownie włożyć strzykawkę do oczyszczania i odciągnąć tłok. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, należy ponownie wprowadzić 50 µL pobranej wcześniej krwi. Zapisz wartość poziomu glukozy we krwi odczytaną z glukometru.

Po 10 minutach należy ponownie zmierzyć poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru i strzykawki płuczącej, a następnie pobrać kolejne 50 µL krwi w celu uzyskania drugiej próbki osocza. Po wykonaniu drugich pomiarów bazowych należy napełnić linie infuzyjne dla glukozy, insuliny i przemytych solą fizjologiczną erytrocytów aż do złącza czterodrożnego. Złącze czterodrożne należy podłączyć do rurki przymocowanej do obrotowego portu infuzyjnego.

Zacznij od infuzji erytrocytów przemytych solą fizjologiczną. Ustaw szybkość infuzji tak, aby zastępować całkowitą objętość pobieranej krwi przez cały czas trwania badania. Gdy infuzja erytrocytów dotrze do myszy, rozpocznij infuzje insuliny i glukozy.

Jest to czas równy zero minut. Insulinę podaje się w infuzji ze stałą, wcześniej określoną prędkością. Początkową prędkość infuzji glukozy szacuje się na podstawie wyjściowego poziomu glukozy we krwi oraz wcześniejszego doświadczenia.

Przez następne dwie godziny należy mierzyć poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru i dostosowywać szybkość infuzji glukozy w celu utrzymania docelowej glikemii. W odstępach 10-minutowych należy zapisywać nowe odczyty glukozy oraz szybkości infuzji glukozy; w 100. i 120. minucie należy pobrać dodatkowe próbki krwi do pomiaru poziomu insuliny w osoczu oraz innych hormonów lub metabolitów. Przedstawiono tutaj przebieg czasowy poziomów glukozy w trakcie procedury clamp, co demonstruje, jak skutecznie utrzymywano glikemię zarówno u myszy karmionych standardową karmą, jak i karmą wysokotłuszczową przez cały czas trwania clampu. Przebieg czasowy szybkości infuzji glukozy pokazuje, że szybkość niezbędna do utrzymania glikemii jest znacznie niższa w grupie karmionej dietą wysokotłuszczową, co wskazuje na upośledzenie insulinowrażliwości całego organizmu.

Zarówno na czczo, jak i podczas zacisku (clamp), poziomy insuliny są wyższe w grupie karmionej dietą wysokotłuszczową, co dodatkowo potwierdza występowanie fenotypu insulinooporności. U tych myszy do oszacowania szybkości pojawiania się glukozy endogennej wykorzystuje się glukozę znakowaną trytem. Endo A stanowi indeks wątrobowej produkcji glukozy, podczas gdy insulina całkowicie hamuje Endo A u myszy kontrolnych.

Supresja jest upośledzona u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową. Podobnie, glukoza TRID jest wykorzystywana do oszacowania szybkości zaniku glukozy w całym organizmie. Zdolność insuliny do stymulowania Rd jest upośledzona u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową.

2-deoksyglukoza znakowana węglem 14 jest wykorzystywana do oceny indeksu metabolicznego glukozy RG, który stanowi miarę swoistego dla tkanek poboru glukozy. Jak pokazano w tym przykładzie, stymulowany insuliną pobór glukozy do mięśni szkieletowych jest upośledzony u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z mikrochirurgią niezbędną do implantacji cewników tętniczych i żylnych.

Zabieg ten wymaga bardzo wyspecjalizowanych umiejętności i regularnej praktyki przez kilka miesięcy, aby osiągnąć biegłość w przeprowadzaniu operacji do hiperinsulinemicznego clampu glikemicznego; trudność polega ponownie na próbie utrzymania glikemii u modelu zwierzęcego o bardzo wysokim metabolizmie.