Name: Transformacja szyjki zębów i uprawa in vitro Schistosoma mansoni Schistosomules (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Poznaj metodę transformacji cercarii w schistosomula Schistosoma mansoni in vitro. Technika obejmuje zbieranie pasożytów z ślimaków Biomphalaria glabrata, koncentrację i transformację igłą, a następnie hodowlę w medium RPMI.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten został sfinansowany ze środków startowych Case Western Reserve University przyznanych E. Jolly. Zainfekowane ślimaki zostały udostępnione przez Schistosome Resource Center, NIH-NIAID (kontrakt NIAID nr HHSN272201000009I). Dziękujemy również Chrisowi Kingowi i Ronaldowi Blantonowi za wsparcie w pozyskaniu zainfekowanych ślimaków z przywrą oraz za pomocne dyskusje.

Środki bezpieczeństwa:
Cerkarie schystosomów mogą bezpośrednio przenikać przez skórę, nie wymagając do tego skaleczeń ani porów, wywołując przewlekłą chorobę – schistosomozę. S. mansoni jest organizmem o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2), dlatego podczas pracy z zakaźnymi cerkariami należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej oraz właściwe środki bezpieczeństwa. Większość sprzętu niezbędnego do hodowli i transformacji schystosomów jest standardowa, z wyjątkiem kilku kluczowych pozycji wymienionych w tabeli na końcu protokołu. Wszystkie prace z cerkariami powinny być prowadzone w oddzielnym pomieszczeniu. Schystosomule należy hodować w sterylnym, zatwierdzonym dygestorium biologicznym. Należy nosić dwie warstwy rękawiczek nitrylowych lub lateksowych, fartuch laboratoryjny, wodoodporne obuwie, spodnie bez dziur ani rozdarć oraz wodoodporne osłony na nadgarstki i przedramiona. W przypadku przypadkowego rozlania substancji, należy natychmiast spryskać skażony obszar 70% etanolem lub 10% wybielaczem, intensywnie pocierając, jeśli substancja dostanie się na ciało. Będzie to wystarczające do unieszkodliwienia pasożyta, jednak wszystkie możliwe zakażenia powinny zostać zgłoszone i potraktowane poważnie. Chociaż schystosomule nie są z natury zakaźne, wytyczne instytucjonalne mogą się różnić, dlatego należy je sprawdzić, aby ustalić, czy środki ostrożności BSL2 są wymagane podczas niezakaźnych etapów cyklu życiowego. Po zakończeniu eksperymentu należy zdezynfekować wszystkie powierzchnie, które miały kontakt z jakąkolwiek potencjalnie zakaźną substancją, a odpady zutylizować w zatwierdzonym pojemniku na odpady biologiczne.
UWAGA: Przykryć pojemniki z gospodarzami (ślimakami) od 1 do 2 dni przed zrzuceniem i chronić przed światłem
1. Pozyskiwanie cerkarii z gospodarza ślimaka
<ol>
<li>Napełnij czysty zlewka o pojemności 500mL, wolny od detergentów, do połowy wodą destylowaną wyrównaną do temperatury pokojowej. Jeśli pracuje się z ślimakami gospodarzami zainfekowanymi miracidiami w różnych terminach, należy użyć osobnego zlewka dla każdej daty infekcji (jest to szczególnie istotne, jeśli ślimaki mają być ponownie wykorzystane w przyszłych eksperymentach). Rozmiar zlewka może być mniejszy, w zależności od doświadczenia użytkownika.</li>
<li>Zabierz zainfekowane ślimaki gospodarzy, z których chcesz uzyskać uwalnianie, i ostrożnie umieść je w zlewce, używając standardowego siatkowego łapaka akwariowego i pęsety ogólnego przeznaczenia w razie potrzeby.</li>
<li>Umieść zlewkę na tacy ociekowej przeciwrozlewowej w odległości około 8 do 12 cali poniżej żarowego źródła światła. Pozostaw na 1-2 godziny pod światłem. Cercarie opuszczają ślimaka gospodarza po wystawieniu na jasne światło.</li>
<li>Ostrożnie odfiltruj ślimaki z mieszaniny cercarii. Zachowaj szczególne środki ostrożności, ponieważ mieszanina jest silnie zakaźna. Pamiętaj, że cercarie mogą bezpośrednio przenikać przez ludzką skórę!</li>
<li>Umieść mieszaninę ponownie pod źródłem światła na około 15 minut, aby pozwolić na osadzenie się wszelkich cząsteczkowych zanieczyszczeń.</li>
<li>Przenieś cercarie do czystej kolby Erlenmeyera za pomocą pipety, unikając pobierania osadu z dna zlewki. Umieść kolbę pod kątem około 45° w lodzie i w ciemności na 45 - 60 minut, aby cercarie osiadły w jednym rogu.</li>
<li>Za pomocą pipety 50 mL usuń od 75 do 90% nadsączu i przelej go do zlewki zawierającej 10% wybielacz lub 70% etanol, dbając o to, aby krople wody zawierające cercarie nie kapały z pipety.</li>
<li>Delikatnie zakręć kolbą Erlenmeyera z cercariami, aby resuspendować je w roztworze. Użyj pipety, aby przenieść próbkę do sterylnych stożkowych probówek 50 ml. Ponownie umieść probówki w lodzie na 20 minut w ciemności. W ciemności cercarie osadzą się w stronę dna probówki.</li>
</ol>
2. Ręczna transformacja cerkarii do postaci schistosomul
Przed rozpoczęciem: Przygotować pełne pożywkę RPMI 1640 (RPMI, 5% płodowej surowicy bydlęcej, 1X Pen/Strep) i ogrzać do 37°C. (Kluczowe jest, aby użyta płodowa surowica bydlęca została inaktywowana poprzez inkubację w temperaturze 56°C przez 1 godzinę, ponieważ schistosomy mogą być wrażliwe na dopełniacz). 
<ol>
<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza (biohazard hood), usuń nadmiar nadosadu za pomocą pipety lub pompy próżniowej, pozostawiając od 5 do 10 ml roztworu w każdej probówce stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
<li>Do strzykawki o odpowiedniej pojemności przymocuj obustronną igłę emulgacyjną luer lok o rozmiarze 22 gauge.</li>
<li>Powoli nabierz mieszaninę do strzykawki. Zbierz cerkarie ze wszystkich probówek 50 ml do jednej strzykawki. Zwróć uwagę, aby roztwór nie kapał.</li>
<li>Ostrożnie obróć strzykawkę tak, aby wolny koniec igły był skierowany do góry. Do tego końca igły emulgacyjnej przymocuj drugą strzykawkę.</li>
<li>Przepuść mieszaninę przez igłę łącznie 40 razy (20 razy w obie strony), aby przekształcić cerkarie.</li>
<li>Ustaw strzykawki pionowo tak, aby mieszanina znajdowała się w dolnej strzykawce, a górna była pusta. Zdejmij górną strzykawkę i zdezynfekuj ją w 70% Ethanol.</li>
<li>Przelewaj mieszaninę kropla po kropli do czystej, wysokiej szalki Pyrex o wymiarach 100mm x 50mm lub naczynia krystalizacyjnego. Zdezynfekuj igłę i strzykawkę w 70% Ethanol.</li>
<li>Dodaj podgrzane do 37°C kompletne medium RPMI 1640 w ilości takiej, aby dno szalki Petri było całkowicie pokryte, analogicznie do przygotowywania szalek z pożywką Luria broth.</li>
<li>Delikatnie zakręć zawartością, aby zgromadzić schistosomule w centrum szalki Petri. Unikaj rozbryzgów. 
Uwaga: Na tym etapie może być pomocne wyłączenie oświetlenia komory, aby lepiej zwizualizować schistosomule w centrum.</li>
<li>Natychmiast przenieś skoncentrowane schistosomule do dołka nowej 12-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą sterylnego zakraplacza.</li>
<li>Powtarzaj kroki 2.9 i 2.10 do czasu, aż w centrum szalki nie będzie już obecnych schistosomule (około 10 razy). Każdą kolejną porcję przenoś do nowego dołka.</li>
<li>Wypełnij każdy dołek do połowy (˜1.5 mL) uprzednio ogrzanym kompletnym medium RPMI.</li>
<li>Zweryfikuj obecność schistosomule oraz brak cerkarii za pomocą mikroskopu odwróconego.</li>
<li>Hoduj schistosomule w inkubatorze CO2 ustawionym na 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Przed przeniesieniem przekształconych schistosomul do pożywki hodowlanej, obserwacja pod odwróconym mikroskopem w polu jasnym (przykład znajduje się w tabeli sprzętu) powinna pozwolić na uzyskanie obrazu podobnego do Ryciny 1, na którym w dołku znajdują się wyłącznie przekształcone schistosomule. Potencjalne zanieczyszczenia mogą obejmować nieuszkodzone cerkarie, odcięte ogony cerkarii lub inne zanieczyszczenia. W przypadku braku mikroskopu odwróconego, do wizualizacji schistosomul wystarczy standardowy mikroskop lub nawet stereomikroskop sekcyjny. Należy pamiętać, że procedura ta nie zawsze prowadzi do przekształcenia 100% cerkarii. 
<img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Stadium schistosomulum w cyklu życiowym, obraz mikroskopowy, badanie z zakresu parazytologii, badania nad schistosomatozą." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Przekształcone schistosomulum
<img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Cerkarie i ogony na obrazie mikroskopowym; parazytologia, stadium larwalne płaziwców, badanie schistosomiazy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Cerkarie i odcięte ogony

<ol><li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li>
<li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis+and+water+resources+development%3A+systematic+review%2C+meta-analysis%2C+and+estimates+of+people+at+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li>
<li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Int%22%5BJournal%5D)">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li>
<li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection%3A+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li>
<li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae%3A+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li>
<li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigation+within+host+tissues%3A+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li>
<li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li>
<li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+cercarial+responses+to+irradiance+changes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li>
<li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula%2C+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li>
<li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li>
<li>Yoshino, T. P. &amp, Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li>
<li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li>
<li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li>
<li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podczas procedury transformacji mogą wystąpić liczne potencjalne problemy, jednak niniejszy protokół został opracowany tak, aby uniknąć większości z nich. Jednym z potencjalnych zagrożeń jest zapchanie igły emulgującej, co zazwyczaj wynika z obecności zanieczyszczeń pozostałych po zbiorach w kroku 1.3. Aby uniknąć tego problemu, należy upewnić się, że w kroku 1.5 wszystkie cząstki stałe opadły na dno, a w kroku 1.6 ostrożnie przenieść cerkarie. Ponadto, zgodnie z wcześniejszym opisem, zaleca się pracę w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosowanie środków ochrony osobistej (w tym przyłbic) oraz unikanie wywierania nadmiernego nacisku na strzykawki.
Odseparowane ogony cerkarii można zaobserwować w medium, co świadczy o niewłaściwej separacji podczas kroku 2.9. Ogony wykazują ruchy przypominające skurcze i mają charakterystyczny kształt (patrz Rycina 2), dzięki czemu można je łatwo odróżnić od schistosomulów. Ogony można usunąć, przemywając schistosomule nadmiarem pełnego medium RPMI i pozwalając im opaść na dno. Ogony pozostaną na powierzchni i mogą zostać odessane.
Jeśli w medium znajdują się nienaruszone cerkarie, oznacza to, że transformacja z kroku 2.5 nie została wykonana prawidłowo. Obraz nienaruszonej cerkarii przedstawiono w Rysunku 3b w celu odniesienia. W przypadku wystąpienia tego problemu należy upewnić się, że używana igła do emulgowania ma odpowiedni rozmiar. Można również zwiększyć liczbę przejść mieszaniny cerkarii przez igłę, choć 40 powtórzeń jest zazwyczaj znacznie więcej niż wystarczy, aby osiągnąć niemal 100% odcięcie ogonów cerkarii.
Przemiana cerkariów w schistosomule została po raz pierwszy opisana w 1974 roku przez Colleya i Wikela (13). Od tego czasu przygotowywanie schistosomul odbywało się albo za pomocą strategii ścinania z użyciem igły i strzykawki, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, albo przy użyciu metody wirowania w wstrząsarku (vortex) z późniejszym rozdzielaniem za pomocą gradientów percoll (14, 15) lub poprzez mieszanie wirowe, jak pokazano w niniejszej pracy. Te dwie techniki przygotowywania schistosomul zostały szczegółowo opisane przez Freda Lewisa (16), a więcej informacji na temat dalszej hodowli schistosomul w celu długoterminowego wzrostu można znaleźć w NIAID Schistosome Resource Center (<a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a>).

<table><tbody><tr><td>Igła emulsyjna 22g x 2-7/8&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-17G</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka RPMI 1640 1X (500ml)</td><td>Invitrogen</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS) inaktywowana ciepłem</td><td>Invitrogen</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Szalka krystalizacyjna (100mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-741D</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta ogólnego przeznaczenia</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>Siatka akwariowa Petco do artemii</td><td>Petco</td><td>SKU:1190954</td><td></td></tr></tbody></table>

transformacja cerkarii i hodowla in vitro schistosomul schistosoma mansoni

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Pasożyty z rodzaju Schistosoma są czynnikami etiologicznymi schistosomatozy, przewlekłej, wyniszczającej choroby, która dotyka ponad 200 milionów ludzi na całym świecie i zajmuje drugie miejsce po malarii wśród chorób pasożytniczych pod względem wpływu na zdrowie publiczne i sytuację społeczno-ekonomiczną (1-4). Schistosomy są przywrami o złożonym cyklu życiowym, który obejmuje fazy pasożytnicze w organizmach mięczaków i ssaków, przedzielone wolno pływającymi stadiami pośrednimi. W skrócie, wolno pływające cerkarie zakażają gospodarza ssaka poprzez penetrację skóry przy pomocy wydzielanych proteaz; w tym czasie cerkarie tracą ogony, przekształcając się w schistosomule. Schistosomule muszą teraz uniknąć odpowiedzi układu odpornościowego gospodarza, wykształcić jelito do trawienia erytrocytów i migrować przez płuca oraz krążenie wrotne do miejsca docelowego w układzie wrotnym wątroby, a ostatecznie do żył krezkowych (w przypadku S. mansoni), gdzie robaki samce i samice łączą się w pary i rozmnażają, produkując codziennie setki jaj. Część jaj jest wydalana z organizmu do słodkiej wody, gdzie wykluwają się z nich wolno pływające miracidia (5-10). Miracidia zakażają określone gatunki ślimaków i przekształcają się w sporocysty macierzyste i potomne, które z kolei produkują zakaźne cerkarie, zamykając cykl życiowy. Niestety, całego cyklu życiowego schistosomów nie można hodować in vitro, ale zakaźne cerkarie mogą zostać przekształcone w schistosomule, a schistosomule mogą być hodowane przez wiele tygodni w celu analizy rozwoju schistosomów in vitro lub analizy mikromacierzy. W niniejszym protokole przedstawiamy wizualny opis transformacji cerkarii oraz hodowli schistosomul in vitro. Uzyskujemy zakaźne cerkarie z gospodarza ślimaka Biomphalaria glabrata i ręcznie przekształcamy je w schistosomule poprzez oddzielenie ogonów za pomocą emulsyjnej igły dwustronnej. Opisane techniki transformacji cerkarii in vitro oraz hodowli schistosomul pozwalają uniknąć wykorzystania gospodarza ssaka, co upraszcza wizualizację schistosomów i ułatwia pobieranie pasożytów do analizy eksperymentalnej. Techniki transformacji i hodowli schistosomów in vitro są stosowane od lat (11, 12), jednak nie opracowano protokołów wizualnych, które byłyby dostępne dla całej społeczności naukowej.

Opisujemy metodę in vitro hodowli schistosomul pasożytniczego płazińca Schistosoma mansoni, polegającą na pozyskiwaniu i transformacji zakaźnych cerkariów z pośredniego żywiciela – słodkowodnego ślimaka Biomphalaria glabrata.

Transformacja cerkarii i hodowla in vitro schistosomul Schistosoma mansoni

Pasożyty z rodzaju Schistosoma są czynnikami etiologicznymi schistosomiazy, przewlekłej, wyniszczającej choroby, która dotyka ponad 200 milionów ludzi na całym świecie i ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przekształcenie zakaźnych CRC e w shisom. Jest to realizowane poprzez wstępne pobranie zakaźnych CRC z gospodarza ślimaka. Zakaźne CRC są następnie zagęszczane i przekształcane w niezakaźne shisom przy użyciu igły dwustronnej.Na koniec shisomy są zagęszczane i zbierane na płytkę hodowlaną, a następnie inkubowane w pożywce RPMI w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla. Stosując tę metodę, można uzyskać transformowane shisomy z zanieczyszczeniem FU cial lub ogonem cial. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ procedura transformacji może być trudna do opanowania i potencjalnie niebezpieczna.Cica są zakaźne i występują w wysokim stężeniu, a ich izolacja wymaga delikatnego i precyzyjnego obchodzenia się z materiałem, aby proces przebiegł bezpiecznie i skutecznie. Procedurę tę zademonstruje John, asystent badawczy w moim laboratorium. Napełnij czysty zlewka o pojemności 500 milliliter w połowie wodą destylowaną o temperaturze pokojowej. Używając standardowego siatki do ryb akwariowych oraz pęsety, przenieś zainfekowane ślimaki do zlewki.Umieść zlewkę na tacy do wycieków awaryjnych w odległości od 8 do 12 cali poniżej źródła światła żarowego i pozostaw ją w tym miejscu na jedną lub dwie godziny. Ekspozycja na jasne światło powoduje opuszczenie organizmu ślimaka przez CRC. Podczas usuwania ślimaków należy zastosować dodatkowe środki ostrożności, aby uniknąć kontaktu z zakażoną wodą, która zawiera CRC zdolne do bezpośredniego przenikania przez ludzką skórę.Usunąć ślimaki, a następnie pozostawić roztwór pod źródłem światła przez około 15 minut, aby cząsteczkowe odpady opadły na dno kolby. Po osadzeniu się odpadów, za pomocą pipety przenieść ciecz do czystej kolby Erlenmeyera, unikając zaciągania osadu z dna zlewki.Umieść kolbę na lodzie pod kątem 45 stopni. Inkubuj roztwór w ciemności przez 45 do 60 minut, aby CRC osadziły się w jednym narożniku. Gdy pasożyty opadną na dno, użyj pipety 50 ml, aby usunąć większość nadsączu i ostrożnie go zutylizować.W zlewce zawierającej 10% wybielacza lub 70% etanolu delikatnie zakręć kolbą Erlenmeyera, aby resuspendować pasożyty. Następnie za pomocą pipety przenieś próbkę do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów. Umieść probówki w lodzie i inkubuj je ponownie w ciemności przez 20 minut, aby umożliwić osadzenie się CRC.Po osadzeniu się pasożytów należy za pomocą pipety odessać większość nadsączu, pozostawiając w każdej probówce od pięciu do 10 ml płynu. Następnie do strzykawki należy założyć igłę emulgacyjną z podwójnym gwintem Luer-lock o rozmiarze 22 G. Z każdej probówki powoli nabrać do strzykawki roztwór zawierający pasożyty.Należy uważać, aby nie doprowadzić do wycieku zakaźnej mieszaniny wewnątrz dygestorium. Ostrożnie obróć strzykawkę tak, aby igła była skierowana w górę, a następnie przymocuj drugą strzykawkę do wolnego końca igły. Przepompowuj mieszaninę tam i z powrotem między obiema strzykawkami około 20 razy, aby przekształcić crc.Następnie ustaw strzykawki pionowo tak, aby ta pusta znajdowała się na górze. Ostrożnie wyjmij górną strzykawkę i zdezynfekuj ją w 70%Ethanol. Przenieś pasożyty kropla po kropli do czystej, wysokiej szalki krystalizacyjnej Pyrex.Następnie zdezynfekuj igłę i strzykawkę w 70% etanolu. Potem umieść szalkę na białym tle, aby ułatwić wizualizację pasożytów, i dodaj podgrzane do 37 °C kompletne pożywka RPMI w ilości takiej, aby dno szalki Pyrex było całkowicie zakryte.Delikatnie zakręć zawartością, aby zebrać shisom w centrum za pomocą sterylnego zakraplacza. Pobierz część skoncentrowanego shisom i przenieś pasożyty do nowej 12-dołkowej płytki hodowlanej. Powtarzaj ten etap płukania, aż do całkowitego usunięcia pasożytów.Po przeniesieniu pasożytów należy wypełnić każdą studzienkę w połowie ciepłym medium RPMI, aby potwierdzić obecność shisom. Płytkę należy obejrzeć za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego. Na tym etapie większość pasożytów powinna przekształcić się w shisom, które można odróżnić od CRC E, ponieważ są mniej modalne i nie posiadają charakterystycznego ogona cial.Może być również obecna niewielka liczba nienaruszonych CRC e odciętych CRC cial tails lub innych zanieczyszczeń. Shta można następnie hodować i utrzymywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide do sześciu tygodni, przy cotygodniowej wymianie pożywki. Należy pamiętać, że praca z zakaźnymi aria może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie podwójnych warstw rękawic, osłon na rękawy oraz właściwe korzystanie z pomieszczeń i komór z laminarnym przepływem powietrza do pracy z materiałami biologicznymi.

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przemiana cercarialna i in vitro hodowla Schistosoma mansoni Schistosomi

Schistosoma mansoni jaja są silnymi stymulatorami odpowiedzi immunologicznej typu Th2 (T helper type 2), charakterystycznej dla infekcji pasożytniczych, astmy i zapalenia alergicznego. Niniejszy protokół wykorzystuje wstrzykiwanie jaj S. mansoni w celu wywołania indukowanej cytokinami CD4 Th2 odpowiedzi zapalnej w płucach, charakteryzującej się tworzeniem ziarniaków wokół jaj, eozynofilią oraz alternatywną aktywacją makrofagów.

Wykorzystanie jaj Schistosoma mansoni jako modelu in vivo stanu zapalnego płuc wywołanego przez helminty

Ten artykuł opisuje protokół na dużą skalę izolacji aksenicznej i zbierania swobodnie pływających miracidii ludzkiej krwi przywry Schistosoma mansoni oraz ich późniejszego przetwarzania w celu wprowadzenia do hodowli in vitro.

Masowa izolacja i hodowla in vitro wewnątrzmięczakowych stadiów ludzkiej krwi Fluke Schistosoma mansoni

Czynnik choroby Chagasa wywołany przez Trypanosoma cruzi powoduje długotrwałe, bezobjawowe infekcje, które nagle przekształcają się w klinicznie rozpoznaną patologię. Poniższy protokół badawczy opisuje krótkoterminowe rodzinne badanie epidemiologiczne mające na celu rozwikłanie infekcji T. cruzi przenoszonej drogą płciową z rodzica na potomstwo.

Przenoszenie płciowe amerykańskich trypanosomów z samców i samic na naiwnych partnerów

Tutaj dostarczyliśmy metodę osiągnięcia stabilnej transfekcji pasożytów Eimeria kurczaka poprzez nukleofektyczne sporozoity lub merozoity drugiej generacji. Genetycznie zmodyfikowane pasożyty eimeriańskie wykazujące ekspresję heterologicznych genów antygenowych mogą być wykorzystywane jako nośniki szczepionek.

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Szczegółowe badania nad stadiami pasożytów malarii u komarów są niezbędne do opracowania skutecznych strategii blokowania transmisji. Protokół ten pokazuje, jak skutecznie hodować zakaźne gametocyty, a następnie karmić te gametocyty komarami w celu wytworzenia stadiów komara P. falciparum.

Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum) Hodowla gametocytów i infekcja komarów poprzez sztuczne karmienie błoną

Opisujemy technikę szybkiej transdukcji przejściowej w różnych stadiach rozwojowych Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji.

Przejściowa transdukcja strobilowanych form Echinococcus granulosus

Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.

Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Poznaj metodę transformacji cercarii w schistosomula Schistosoma mansoni in vitro. Technika obejmuje zbieranie pasożytów z ślimaków Biomphalaria glabrata, koncentrację i transformację igłą, a następnie hodowlę w medium RPMI.

Transformacja cerkarii i hodowla in vitro schistosomul Schistosoma mansoni

Przeglądaj więcej filmów