Name: Izolacja pierwotnych komórek trofoblastu myszy i test inwazji trofoblastu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj izolację pierwotnych komórek trofoblastu z łożysk myszy oraz test inwazji na matrycy Matrigel. Ta metoda umożliwia badanie biologii komórek łożyskowych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować zespołowi Creative Services w University of Missouri Academic Support Center za przygotowanie tego filmu.
Praca ta była wspierana przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health &amp; Human Development National Institutes of Health, grant numer HD055231

1. Disekcja łożyska myszy
<ol>
 <li>Przygotuj pary myszy do kojarzenia.</li>
 <li>W kolejnych dniach sprawdzaj obecność czopa kopulacyjnego. Dzień, w którym wykryto czop, uznaje się za 0,5 dnia po kopulacji (dpc)7.</li>
 <li>Łożek można pobierać na pożądanym etapie ciąży; czysta dyssekcja łożyska jest możliwa począwszy od rozwoju dojrzałego łożyska w dniu 10,5. W niniejszej procedurze demonstrujemy etap 14,5 dpc. Przy podanych objętościach, 40-60 łożysk w 10,5 dpc oraz 10-20 łożysk w 14,5 dpc zapewnią wyraźnie widoczną warstwę komórek trofoblastu.</li>
 <li>Uśmierć ciężarną mysz i usuń macicę, przecinając ją w obrębie szyjki oraz wzdłuż mesometrium.</li>
 <li>Za pomocą ostrych nożyczek przetnij tkankę pomiędzy poszczególnymi produktami poczęcia (Rycina 1A).</li>
 <li>Używając dwóch par pęset, uchwyć ścianę macicy na krawędzi cięcia i rozdziel ją, usuwając mięsień macicy (myometrium) (Rycina 1B). Zaleca się użycie jednej pary pęset ząbkowanych, średnio precyzyjnych (zakrzywionych lub prostych) oraz jednej pary pęset bardzo precyzyjnych (np. nr 5).</li>
 <li>Naprzeciwko łożyska otwórz deciduę za pomocą pęsety lub nożyczek, odsłaniając łożysko. Trzymając tkankę macicy jedną pęsetą, przesuń drugą pęsetą pod łożysko, aby je oddzielić (Rycina 1C). W razie potrzeby oddziel płód i błony płodowe od łożyska. Nie jest możliwe usunięcie całej tkanki deciduy poprzez dyssekcję bez utraty części tkanki łożyskowej, jednak dodatkową tkankę deciduy (bladą) można usunąć z powierzchni łożyska, delikatnie zdejmując ją pęsetą. W celu dalszego oczyszczania zastosujemy gradient Percoll.</li>
 <li>Każde wypreparowane łożysko umieść w 25 ml schłodzonego do temperatury lodu buforu do dysocjacji w probówce stożkowej o pojemności 50 ml, aż wszystkie dyssekcje zostaną zakończone. W późniejszych etapach, przed przeniesieniem do buforu do dysocjacji, grubo posiekaj tkankę łożyskową nożyczkami lub żyletką.</li>
</ol>
2. Izolacja trofoblastów
<ol>
 <li>Luźno zakręć probówkę stożkową i umieść ją w kąpieli w temperaturze 37°C na 45-60 minut. Energicznie mieszaj roztwór dysocjujący, pipetując go w przybliżeniu co 10 min. Całkowity czas trawienia należy ściśle monitorować; osiągnięcie optymalnej odzyskiwalności komórek prawdopodobnie będzie wymagało kilku prób. Tkanki powinny być możliwe do przepuszczenia przez pipetę 10 ml, jednak widoczne będą pozostałości fragmentów tkanek. Nadmierne trawienie spowoduje niską przeżywalność komórek i niską wydajność wysiewania. Optymalna przeżywalność i wydajność wysiewania występuje, gdy obecne są skupiska kilku komórek, a nie w przypadku osiągnięcia całkowitej dysocjacji. Z kolei niewystarczające trawienie doprowadzi do zmniejszonej czystości po separacji w Percollu. Po osiągnięciu odpowiedniego stopnia trawienia umieść probówkę na lodzie, aby zatrzymać aktywność kolagenazy.</li>
 <li>Przepuść roztwór przez sitko komórkowe, aby usunąć nietrawione materiały, a następnie wiruj przy 50 x g przez 5 minut.</li>
 <li>W celu przemycia usuń supernatant i resuspenduj komórki w 10 ml roztworu do przemywania. Wiruj przy 50 x g przez 5 minut.</li>
 <li>Podczas wirowania przygotuj roztwór Percollu, mieszając 9,6 ml Percollu, 13,4 ml roztworu do przemywania oraz 1,1 ml 10x medium 19 w probówce 50 ml odpowiedniej do wirowania przy wysokich prędkościach.</li>
 <li>Usuń supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 2 mL roztworu do przemywania.</li>
 <li>Dodaj komórki do roztworu Percollu i wiruj przy 30 0 x g przez 30 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Wyjmij probówkę z wirówki, nie naruszając gradientu. Aby zwizualizować gradient, ustaw probówkę przed jasnym źródłem światła. Zlokalizuj prążek trofoblastu (Rysunek 2) i odessać go pipetą, uważając, aby nie naruszyć znajdującego się poniżej prążka erytrocytów. Objętość prążka trofoblastu będzie wynosić 5-8 ml.</li>
 <li>Przenieś komórki trofoblastu do probówki stożkowej 50 ml. Dodaj roztwór do przemywania do uzyskania całkowitej objętości 45 ml.</li>
 <li>Wiruj przy 50 x g przez 5 minut. Usuń supernatant i resuspenduj w medium hodowlanym (NCTC-135). Komórki można hodować na cienkiej warstwie Matrigelu lub na plastiku do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i 5% CO2. W dniu 10,5 każda łożysko daje około 50 00 żywych komórek, z czego 80-90% jest cytokeratyna-dodatnich.</li>
</ol>

3. Test inwazji trofoblastycznej
<ol>
 <li>Do każdej komory z matrigelem dodać 1-2 ml pożywki hodowlanej (NCTC-135) i inkubować w temperaturze 37°, przy 5% CO2 przez 30-90 min.</li>
 <li>Usunąć pożywkę i do górnej komory dodać 1,5 ml x 105 świeżo wyizolowanych komórek w 2 ml pożywki. Do dolnej komory dodać 1 ml pożywki, aby przykryć dolną powierzchnię membrany.</li>
 <li>Hodować komórki w insertach przez 18-24 godziny.</li>
 <li>Zeskrobać komórki i matrigel z insertu za pomocą tamponu z pianki.</li>
 <li>Przepłukać górną i dolną część komory w 2 ml PBS.</li>
 <li>Utrwalić przez 5 min w 1 ml 4% paraformaldehydu w PBS.</li>
 <li>Przebarwić, wypełniając dolną komorę 40 μl DAPI (30nM) i inkubując przez 30 min.</li>
 <li>Przemyć krótko trzy razy w PBS.</li>
 <li>Usunąć membrany z insertów za pomocą ostrego ostrza skalpela.</li>
 <li>Na szkiełko nanieść kroplę 10 μl medium montażowego (50% glicerolu w PBS). Za pomocą pęsety położyć membranę na kropli. Dodać kolejną kroplę 10 μl medium, a następnie ostrożnie przykryć szkiełkiem nakrywką.</li>
 <li>Wykonanie fotografii i przeliczenie komórek. Należy pamiętać o odpowiednim zorientowaniu membrany (stroną z komórkami do góry lub do dołu) w zależności od używanego mikroskopu. Oprogramowanie Image J (National Institutes of Health) zawiera funkcję ręcznego liczenia, która może być wykorzystana w tym celu, podobnie jak Adobe Photoshop lub licznik ręczny.</li>
</ol>

4. Reprezentatywne wyniki

<img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="Schemat sekcji mezometrialnej i antymezometrialnej przedstawiający ułożenie płodu i łożyska." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Disekcja łożyska myszy. (a) Macicę usuwa się poprzez przecięcie wzdłuż jajowodów (żółte), wzdłuż powierzchni mezometrialnej oraz w obrębie szyjki macicy (na dole). Poszczególne konceptusy można następnie oddzielić, przecinając je nożyczkami w sposób przedstawiony na schemacie. (b) Ścianę macicy usuwa się, umieszczając dwie pęsety w przeciętej powierzchni macicy i rozdzierając ją wzdłuż strony antymezometrialnej, blisko płodu i z dala od łożyska. (c) Następnie izoluje się łożysko, chwytając je pęsetą i wsuwając drugą pęsetę pomiędzy łożysko a tkankę macicy. Pępowinę oraz pozostałe błony pozazarodkowe można następnie oddzielić od łożyska.

<img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="Izolacja trofoblastu poprzez wirowanie, schemat i układ eksperymentalny, rozdział składników krwi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Separacja komórek trofoblastu metodą Percoll. Po wirowaniu widoczne będą trzy główne pasma, zgodnie z przedstawionym po lewej stronie schematem i zdjęciem po prawej stronie. Górne pasmo, najbardziej wyraźne, zawiera debris komórkowy oraz fibroblasty. Tuż poniżej rozproszonego pasma trofoblastu widoczne będzie wąskie (czerwone) pasmo zawierające erytrocyty. W paśmie trofoblastu prawdopodobnie pojawią się agregaty komórkowe, takie jak dwa widoczne bezpośrednio po lewej stronie strzałki na zdjęciu. 

<img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="Obraz mikroskopowy cząsteczek sadzy w zawiesinie, z naniesioną skalą rozmiarów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Inwazyjne komórki trofoblastyczne (biała strzałka) przejdą przez warstwę matrigelu oraz pory membrany, pojawiając się na jej dolnej powierzchni. Widoczne są również pory (czarna grot strzałki). Można policzyć liczbę komórek na całej powierzchni membrany lub na reprezentatywnym obszarze próbkowym. Obraz w skali szarości z fluorescencyjnym barwieniem jąder DAPI został odwrócony w celu poprawy wizualizacji komórek. 

<img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna jąder komórkowych; barwienie na niebiesko, skala powiększenia 10 μm; obrazowanie komórkowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4.Komórki trofoblastyczne można zidentyfikować, a czystość wyizolowanej populacji ocenić za pomocą immunobarwienia na cytokeratynę 7 (środek, magenta). Komórki przeciwbarwiono DAPI (góra, niebieski). Obraz złożony, dół.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W tym filmie prezentujemy izolację trofoblastów z łożyska myszy. Następnie przedstawiamy test in vitro inwazji trofoblastów. Dzięki zastosowaniu tej procedury można uzyskać w dużej mierze, choć nie całkowicie, czystą populację komórek trofoblastycznych. Jeśli wymagana jest większa czystość, można przeprowadzić separację za pomocą kulek magnetycznych lub cytometrię przepływową, zgodnie z opisem dla pierwotnych ludzkich trofoblastów. Odpowiedni czas etapu dysocjacji kolagenazą musi być określony przy każdym eksperymencie i...

izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Łożeka odpowiada za transport składników odżywczych, gazów i czynników wzrostu do płodu, a także za usuwanie produktów przemiany materii. 
W związku z tym wady rozwoju łożyska mają istotne konsekwencje dla płodu i matki oraz stanowią główną przyczynę śmiertelności zarodkowej. Głównym typem komórek płodowej części łożyska jest trofoblast. Pierwotne komórki trofoblastu łożyska myszy są użytecznym narzędziem do badania prawidłowego i nieprawidłowego rozwoju łożyska i, w przeciwieństwie do linii komórkowych, mogą być izolowane i wykorzystywane do badania trofoblastu na określonych etapach ciąży. Ponadto pierwotne hodowle trofoblastu z myszy transgenicznych mogą być stosowane do badania roli konkretnych genów w komórkach łożyska. Przedstawiony tutaj protokół opiera się na opisie Thordarsona et al.1, w którym zastosowano gradient Percoll w celu uzyskania względnie czystej populacji komórek trofoblastu z wyizolowanych łożysk myszy. Jest on podobny do częściej stosowanych metod izolacji komórek trofoblastu człowieka2-3. Czystość można ocenić za pomocą barwienia immunocytochemicznego wyizolowanych komórek na cytokeratynę 74. Następnie wyizolowane komórki poddaje się analizie za pomocą testu inwazji w matrigelu w celu oceny inwazyjności trofoblastu in vitro5-6. Komórki, które dokonały inwazji, są analizowane immunocytochemicznie i barwione w celu ich policzenia.

W niniejszym protokole opisujemy sekcję łożysk myszy w 10,5 dniu ciąży, a następnie izolację komórek trofoblastycznych z wykorzystaniem gradientu Percoll. Następnie demonstrujemy zastosowanie wyizolowanych komórek w teście inwazji na Matrigelu.

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Łożeczka odpowiada za transport składników odżywczych, gazów i czynników wzrostu do płodu, a także za usuwanie produktów przemiany materii. 
W związku z tym wady...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie pierwotnych trofoblastów łożyska myszy do hodowli komórkowej. Przedstawimy również jedno z zastosowań tych komórek – test inwazji w Matrigel. Macica zostanie usunięta z ciężarnej myszy, a następnie przeprowadzona zostanie dyssekcja łożyska.Tkanka łożyska zostanie poddana trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórkowych, a następnie komórki zostaną rozdzielone przy użyciu gradientu gęstości zgodnie z protokołem. Odessana zostanie frakcja zawierająca komórki trofoblastów, a otrzymaną populację komórek można następnie przemyć i wysiać. W dalszej części zaprezentujemy test inwazyjności, w którym komórki wysiewa się na warstwę matrigelu pokrywającą cienką membranę.Komórki inwazyjne przebiją się przez warstwę matrigelu i przejdą przez pory w membranie o średnicy ośmiu mikrometrów. Następnie komórki zostaną utrwalone, a membrana usunięta. Komórki, które dokonały inwazji, można następnie zbarwić i policzyć.Witam, nazywam się Kathleen Pennington i reprezentuję laboratorium Schultza w Katedrze Położnictwa, Ginekologii i Zdrowia Kobiet na Uniwersytecie Missouri w Columbia, Missouri. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę, której używamy do izolacji pierwotnych trofoblastów z myszy w ciąży. Następnie przeprowadzimy test inwazyjności, którego używamy do badania tych komórek.Wykorzystujemy te procedury do badania czynników wpływających na rozwój trofoblastu łożyska oraz jego zdolność do naciekania macierzy pozakomórkowej. Zacznijmy. W pierwszej kolejności, w każdym z poniższych dni, przygotuj pary myszy do kojarzenia.Sprawdź obecność czopa kopulacyjnego. Dzień, w którym wykryto czop, uznaje się za dzień 0,5.Łożysko poowocowe można pobrać na pożąganym etapie ciąży. W niniejszej procedurze zaprezentujemy sekcję łożyska z dnia 14,5 na blacie laboratoryjnym. Należy jednak pamiętać, że na wcześniejszych etapach do wizualizacji tkanek może być wymagany mikroskop; w takim przypadku należy zlokalizować macicę, a następnie przeciąć ją w miejscu połączenia z jajowodem.Kontynuuj usuwanie tkanki tłuszczowej i naczyń krwionośnych, przecinając w okolicy szyjki macicy oraz w drugim miejscu połączenia jajdowodu. Aby usunąć macicę, przenieś ją do czystej szalki Petriego za pomocą ostrych nożyczek. Oddziel poszczególne koncepcjusy. Po oddzieleniu przenieś każdy koncepcjus do czystej szalki.Płód znajduje się po stronie przeciwnej do mięśnia macicy względem łożyska. Łożysko znajduje się wzdłuż strony mezjalnej macicy. Użyj jednej pary pęsety, aby uchwycić macicę w pobliżu powierzchni cięcia.Ostrożnie rozsuń obie pary pęset w przeciwnych kierunkach, rozdzierając ścianę macicy wzdłuż strony przeciwmiometrialnej. Zazwyczaj spowoduje to również przerwanie błon płodowych. Pozostawi to wyraźnie widoczny płód na górze, pod którym znajduje się czerwona łożyska oraz biała tkanka macicy.Następnie za pomocą precyzyjnej pęsety oddziel pępowinę płodu i tkankę owodni od łożyska. Przytrzymaj tkankę macicy jedną pęsetą i przesuń drugą pomiędzy łożyskiem a znajdującą się pod nim tkanką macicy. Na tym etapie z łożyska można usunąć nadmiar tkanki deciduum.Niemniej jednak, prawdopodobnie pozostaną niektóre komórki trofoblastyczne. Każde wypreparowane łożysko należy umieścić w lodowatym buforze do dysocjacji do czasu zakończenia wszystkich preparacji. Po zakończeniu preparacji należy lekko zakręcić zakrętką probówki stożkowej zawierającej łożysko i roztwór do dysocjacji, a następnie umieścić ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 45 do 60 minut.Po 10 minutach wymieszać roztwór dysocjujący, energicznie pipetując go w górę i w dół, uważnie monitorując postęp trawienia. Odpowiedni czas trwania etapu dysocjacji kolagenazą musi zostać ustalony dla każdego eksperymentu i zostanie dopracowany wraz z doświadczeniem. Nadmierne trawienie znacząco ograniczy odzyskiwanie komórek, natomiast niedostateczne trawienie może prowadzić do zmniejszenia czystości, a także do mniejszej liczby komórek.Przerwać reakcję, gdy pozostaną jedynie nieliczne fragmenty niestrawionej tkanki. Przeszczepić roztwór przez sitko do komórek, aby usunąć niestrawione materiały, a następnie odwirować przy 500 ×g przez pięć minut w celu osadzenia komórek łożyska. Następnie przemyć komórki.Aby usunąć roztwór dysocjujący, odwiruj próbkę i resuspenduj komórki w 10 ml roztworu piorącego, a następnie odwiruj przy 500 ×g przez pięć minut. W międzyczasie przygotuj roztwór percoll, mieszając 9,6 ml percoll i 13,4 ml roztworu piorącego w probówce odpowiedniej do wirowania przy wysokich prędkościach.Dodać 1,1 ml 10x pożywki 1 99, aby przygotować roztwór do komórek, a następnie odwrócić probówkę, aby wymieszać. Po wirowaniu i przemyciu roztworem, usunąć nadfiltr i resuspendować osad komórkowy. W 2 ml roztworu do mycia dodać komórki do roztworu według protokołu i wymieszać, aby stworzyć gradient; wirować przy 20 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, a następnie wyjąć probówkę z wirówki, nie naruszając gradientu.Gradient można łatwiej zwizualizować, trzymając probówkę przed źródłem światła. W górnej części probówki widoczny będzie biały prążek zawierający głównie szczątki komórkowe, a w dolnej części najprawdopodobniej pojawi się prążek erytrocytów. Tuż powyżej.Jest to prążek trofoblastyczny. Odessaj medium do poziomu tuż powyżej prążka trofoblastycznego i wylej je. Następnie, używając pipety, przenieś prążek trofoblastyczny do czystej probówki do wirowania zawierającej 35 ml roztworu do płukania i wiruj przy 500 ×g przez pięć minut.Aby uzyskać osad komórek trofoblastycznych, resuspenduj pellet w pożywce do hodowli trofoblastów. W tym etapie komórki będą hodowane w komorach inwazyjnych w płytce sześciodołkowej. Komory z Matrigelem zostały wcześniej przemyte zgodnie z instrukcją producenta; pipetuj od 0,5 do 1 ml pożywki kulturacyjnej do dołka poniżej każdego wkładu.Następnie do komory dodaj 1,5 × 10⁵ komórek w odpowiedniej objętości pożywki. Inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po 18 do 24 godzinach wyjmij komory inwazyjne z inkubatora.Usuń pożywkę i wypłucz komory trzykrotnie w PBS, po pięć minut za każdym razem, delikatnie, lecz dokładnie. Zeskrob komórki i główną warstwę żelu z górnej powierzchni wkładu. Używając patyczka higienicznego, utrwal komórki, które przeniknęły przez membranę, wypełniając dołek 4% roztworem paraformaldehydu i inkubując przez pięć minut.Przepłucz trzy razy w PBS. Zbarw komórki, które dokonały inwazji, wypełniając dołek barwnikiem jądrowym, takim jak dappy. Inkubuj przez 20 minut.Ponownie przemyj trzy razy w PBS. Za pomocą ostrza skalpela nanieś kroplę medium montażowego na szkiełko przedmiotowe, a następnie ostrożnie usuń membranę z komory inwazyjnej przy użyciu pęsety. Przenieś membranę na szkiełko tak, aby komórki były skierowane do góry.Połóż membranę na kropli, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Dodaj kolejną kroplę medium montującego, a następnie przykryj całość szkiełkiem nakrywką.Uważnie obejrzyj i sfotografuj komórki, które przeniknęły przez powierzchnię membrany. Na rysunku pierwszym widać, że inwazyjne trofoblasty przenikają przez warstwę matrigelu i pory membrany, pojawiając się na jej dolnej powierzchni. Pory mogą być również widoczne.Liczbę komórek inwazyjnych można policzyć i porównać pomiędzy grupami badawczymi ręcznie lub przy użyciu oprogramowania komputerowego. Rysunek 2; oprócz barwień jąder komórkowych, do charakterystyki komórek inwazyjnych można wykorzystać immunocytochemię. W tym przypadku zastosowano przeciwciało przeciwko cytokeratynie 7, aby potwierdzić, że są to komórki trofoblastu.Przedstawiliśmy metodę izolacji komórek trofoblastycznych z łożyska myszy. Następnie zaprezentowaliśmy test in vitro oceniający inwazyjność trofoblastu. Stosując tę procedurę w dużym stopniu, choć nie całkowicie, można uzyskać czystą populację komórek trofoblastycznych.Jeśli wymagana jest dalsza puryfikacja, można przeprowadzić separację za pomocą kulek magnetycznych lub cytometrię przepływową, zgodnie z opisem dla pierwotnych ludzkich komórek trofoblastycznych. Chociaż zaprezentowaliśmy użycie komercyjnie przygotowanych komór inwazyjnych z matri gel, można je również przygotować samodzielnie, dodając matri gel do niepowlekanych komór transwell do pożądanej grubości. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

isolation-primary-mouse-trophoblast-cells-trophoblast-invasion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastu mysiego i badanie inwazji trofoblastu

W niniejszym filmie prezentujemy izolację blastocyst myszy oraz wyprowadzenie komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst. Opisujemy również warunki utrzymania właściwości macierzystych komórek, a także indukcję ich różnicowania w hodowli.

Wytwarzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

Ten manuskrypt przedstawia unikalny model in vitro immunooczyszczanych ludzkich komórek cytopifoblastu kosmkowego hodowanych w warunkach hipoksji/reoksygenacji. Model ten jest odpowiedni do badania ochronnego wpływu obiecujących metod leczenia, takich jak melatonina, na powikłania ciąży związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i zmienioną funkcją łożyska.

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Prezentowany tutaj jest protokół pobierania próbek ludzkiej tkanki kosmków łożyskowych, a następnie izolacji cytotrofoblastów do pierwotnej hodowli komórek. Leczenie trofoblastów TNFα podsumowuje stan zapalny w środowisku wewnątrzmacicznym otyłości i ułatwia odkrycie celów molekularnych regulowanych przez stan zapalny w łożyskach z otyłością matczyną.

Podstawowy model ludzkiego trofoblastu do badania wpływu stanu zapalnego związanego z otyłością matki na regulację autofagii w łożysku

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Tutaj prezentujemy wysoce przystępny protokół oceny ruchu komórek w ludzkich komórkach trofoblastu za pomocą trzech testów in vitro: testu zadrapania, testu inwazji transwell i testu proliferacji komórek.

Testy in vitro w celu oceny migracji, inwazji i proliferacji unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych trofoblastu w pierwszym trymestrze ciąży

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Obecny protokół pozwala na odzyskanie struktur przypominających rurki powstałych w klasycznym teście angiogenezy in vitro, gdzie komórki, takie jak komórki trofoblastu, organizują się w struktury podobne do naczyń włosowatych na warstwie zewnątrzkomórkowej macierzy błony podstawnej. Odzyskane struktury są wykorzystywane do izolacji RNA i białek do różnych analiz biochemicznych.

Odzyskiwanie komórek trofoblastu z testu tworzenia rurki angiogenezy do analizy ekspresji markerów różnicowania

Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

Poznaj izolację pierwotnych komórek trofoblastu z łożysk myszy oraz test inwazji na matrycy Matrigel. Ta metoda umożliwia badanie biologii komórek łożyskowych in vitro.

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Przeglądaj więcej filmów