Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu mysim

Zacznij od znieczulonej myszy i nałóż środek rozszerzający źrenice.

Pod mikroskopem należy otworzyć powiekę i lekko wysunąć oko, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia.

Nałóż kroplę okulistycznego roztworu lepkosprężystego, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe, aby uwidocznić siatkówkę.

Za pomocą cienkiej igły utwórz otwór za połączeniem rogówka-twardówka, unikając uszkodzenia naczyń krwionośnych i soczewki.

Przez ten wstępnie nakłuty otwór włóż strzykawkę stycznie do przestrzeni podsiatkówkowej w pobliżu nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE, który wspiera neurony siatkówki.

Wstrzyknąć wektor lentiwirusowy przenoszący geny docelowe do przestrzeni podsiatkówkowej.

Obserwuj tworzenie się pęcherzyka podsiatkówkowego w wyniku nagromadzenia płynu, potwierdzając pomyślne dostarczenie wektora.

Delikatnie zamknij powiekę, aby zakryć miejsce wstrzyknięcia i pozwolić myszy dojść do siebie.

Lentiwirus dostaje się do RPE poprzez endocytozę, uwalnia swój materiał genetyczny i przekształca go w odpowiednie DNA, które integruje się z genomem gospodarza, umożliwiając ekspresję genów.

Najpierw przygotuj mikrolitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 33. Wysterylizuj go za pomocą gazowego tlenku etylenu. Następnie przygotuj rozcieńczenie wektorów wirusowych w PBS w probówce z mikro fuge w ilości około 1 miliona jednostek miana na mikrolitr. Teraz, podczas ładowania strzykawki, przepłucz ją kilka razy roztworem, aby usunąć wszelkie martwe przestrzenie w strzykawce. Uzyskaj od 1,5 do 2 mikrolitrów gotowych do wstrzyknięcia.

Po przygotowaniu wstrzyknięcia wektora wirusowego znieczulij dorosłą mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym tiletaminy, zolazepamu i ksylazyny. Upewnij się, że zwierzę zostało znieczulone przy braku odruchów. Po potwierdzeniu znieczulenia rozszerz źrenice kroplą 0,5% fenylefryny i 0,5% tropikamidu. Teraz, pod mikroskopem operacyjnym, otwórz powiekę i wysuń oko, aby odsłonić równik. Przytrzymaj oko w tej pozycji, umieszczając palce na zewnątrz krawędzi oczodołu.

Następnie nałóż okulistyczny roztwór lepkosprężysty na powierzchnię rogówki i umieść mały okrągły szkiełko zakrywające na rogówce. W ten sposób można oglądać siatkówkę. Teraz, nieco z tyłu rąbka i niżej w prawym oku lub wyżej w lewym oku, użyj sterylnej półigły o rozmiarze 30, aby zrobić mały otwór. Otwory umieszczone tymczasowo lub nosowo nie są dobrym wyborem, ponieważ są trudne do zakrycia.

Podczas nakłuwania nie należy uderzać w naczynie rąbkowe ani soczewkę i nie wkładać całego skosu igły.

W przypadku wstrzyknięć podsiatkówkowych należy wprowadzić igłę do wstrzykiwań wektorowych przez otwór pod kątem 45 stopni do płaszczyzny tęczówki. Popchnij igłę do tyłu w kierunku obszaru okołobrodawkowatego, podążając wyznaczoną ścieżką, aby przekroczyć jamę ciała szklistego. Zbliżyć igłę do przestrzeni podsiatkówkowej, aż poczujesz łagodny opór, co wskazuje, że osiągnięto warstwę RPE.

Nie należy penetrować tkanki twardówki z nadmiernym naciskiem, ponieważ igłę należy umieścić w potencjalnej przestrzeni podsiatkówkowej. Jeśli igła nakłuje tkankę czaszki z nadmierną siłą, bez oporu wchodzi w przestrzeń oczodołu zewnątrzgałkowego.

Teraz delikatnie wstrzyknij wektor wirusowy do przestrzeni podsiatkówkowej. Trzymaj igłę bardzo nieruchomo, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek, co jest niezwykle ważne. Następnie równie delikatnie wyjmij igłę. Teraz gałka oczna może zostać uwolniona. Pęcherzyki podsiatkówkowe wskazujące na akumulację wektora powinny być widoczne. Na koniec delikatnie zamknij powiekę, aby zakryć miejsce wstrzyknięcia. Nastąpi samouszczelnienie otworu.