Name: Chromatograficzne oczyszczanie wysoce aktywnych rybosomów drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj szybką chromatograficzną metodę oczyszczania rybosomów drożdży, która eliminuje zanieczyszczenia nukleazami i proteazami. Technika ta zapewnia wysoką aktywność biochemiczną i integralność strukturalną rybosomów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować wszystkim członkom laboratorium Dinmana, w tym Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy oraz Michael Rhodin za pomoc i wkład w ten projekt. Praca ta była wspierana grantami przyznanymi AM przez American Heart Association (AHA 0630163N) oraz JDD przez National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL otrzymał wsparcie w ramach dodatku z American Reinvestment and Recovery Act of 2009 do grantu głównego (3R01GM058859-11S1).

1. Przygotowanie żywicy Sulfolink naładowanej cysteiną
<ol>
<li>Przygotować żywicę Sulfolink (Pierce) w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Do dwóch plastikowych probówek o pojemności 10 ml przelać łącznie 10 ml 50% zawiesiny żelu sprzęgającego Sulfolink (zgodnie z dostawą producenta), rozdzielając po 5 ml do każdej probówki.</li>
<li>Krótko odwirować probówki przy 850 x g i ostrożnie usunąć nadsączniki.</li>
<li>Przemyć żel trzykrotnie w buforze sprzęgającym (50 mM Tris, pH 8.5, 5 mM EDTA) poprzez resuspensję kulek w 5 ml, krótkie wirowanie przy 850 x g i usunięcie nadsącznika za pomocą pipety.</li>
<li>Do każdej probówki dodać pięć ml 50 mM roztworu L-cysteiny w buforze sprzęgającym i mieszać zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze 25°C.</li>
<li>Usunąć pozostałości L-cysteiny poprzez przemywanie zgodnie z opisem w kroku 1.4 powyżej.</li>
<li>Resuspendować żel w 10 ml buforu wiążącego [20 mM HEPES, pH 7.6, 5 mM Mg(OAc)2, 60 mM NH4Cl, 2 mM DTT] i zrównoważyć żywicę, przemywając ją 3 razy w 10 ml buforu wiążącego zgodnie z opisem w kroku 1.4. Przenieść żywicę do kolumny wirówkowej o pojemności 10 ml, zamknąć i przechowywać w temperaturze 4°C. Pojemność żywicy do wiązania RNA wynosi ˜20 jednostek A260 na ml.</li>
</ol>
 2. Oczyszczanie chromatograficzne rybosomów przy użyciu żywicy Sulfolink z przyłączoną cysteiną
Uwaga: W przypadku pracy ze szczepem, w którym aktywność proteazy stanowi problem, we wszystkich kolejnych buforach można zastosować koktajle inhibitorów proteaz.
<ol>
<li>Wszystkie komponenty należy przechowywać w lodzie, a wszystkie roztwory przygotować przy użyciu wody wolnej od RNaz i przeprowadzić sterylną filtrację.</li>
<li>Komórki drożdży hodować przez noc do średniej fazy logarytmicznej (O.D.595 = 0.6 - 1.2) w odpowiednim medium. Komórki osadzić przez wirowanie, przemyć 1 gram komórek w buforze wiążącym i wirować przy 370 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Komórki resuspenderować w 1 ml buforu wiążącego do przybliżonej objętości całkowitej 2 ml i rozbić przy użyciu takiej samej objętości szklanych kulek o średnicy 0.5 mm schłodzonych do 4°C, korzystając z urządzenia Biospec Mini-bead beater (Bartlesville, OK). W razie potrzeby próbki można rozdzielić do wielu probówek.</li>
<li>Niezniszczone komórki, organelle i szczątki komórkowe usunąć przez wirowanie przy 30 0 x g przez 30 minut w ultrawirowce Beckman-Coulter Optima Max E (Fullerton, CA).</li>
<li>Bezpośrednio przed użyciem osadzić żywicę przez wirowanie przez jedną minutę przy 1 0 x g, aby usunąć roztwór do przechowywania. Na każdy jeden gram komórek należy użyć dwóch ml żywicy.</li>
<li>Z wirówki 30 0 x g pobrać nadpłyny z lizatu komórkowego (S30), uważając, aby zminimalizować zanieczyszczenie frakcją lipidową na samej górze lub szczątkami komórkowymi na dnie probówek, i przenieść je bezpośrednio do naładowanej zawiesiny Sulfolink. Warstwy lipidowej można uniknąć poprzez jej usunięcie lub wypchnięcie z pipety po tym, jak końcówka przejdzie do nadpłynu.</li>
<li>Mieszaninę S30/Sulfolink inkubować w lodzie przez 15 minut bez mieszania.</li>
<li>Kolumny umieścić w stożkowych probówkach 15 ml i wirować przy 1 0 x g przez jedną minutę.</li>
<li>Frakcje przepłuku przenieść z powrotem do kolumn, wymieszać ręcznie i inkubować przez kolejne 15 minut w lodzie.</li>
<li>Kolumny umieścić w stożkowych probówkach 15 ml i wirować przy 1 0 x g przez jedną minutę. Odrzucić przepłuk.</li>
<li>Zakryć kolumny i dodać 5 ml buforu wiążącego. Mieszać kolumny ręcznie aż do resuspensji, zdjąć zakrycia i wirować kolumny przy 1 00 x g przez jedną minutę. Powtórzyć ten protokół płukania jeszcze dwa razy.</li>
<li>Do każdej kolumny dodać 1.5 ml buforu elucyjnego (20 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 10 mM Mg(OAc)2, 50 mM KCl, 2mM DTT, 0.5 mg/ml heparyny). Zawiesiny wymieszać ręcznie i inkubować w lodzie przez 2 minuty.</li>
<li>Kolumny umieścić w nowych stożkowych probówkach 15 ml i wirować przy 1 0 x g przez 1 minutę. Zebrać eluat. Powtórzyć etap elucji jeszcze raz, tak aby końcowe połączone objętości próbek wynosiły ˜ 3 ml. Użyta żywica może zostać przemyta buforem elucyjnym bez heparyny, a następnie poddana ekwilibracji buforem wiążącym i przechowywana w objętościach 10 ml buforu wiążącego w temperaturze 4°C do późniejszego użycia.</li>
</ol>
3. Obróbka puromycyną
Uwaga: Alternatywną metodą usuwania zanieczyszczających gatunków tRNA jest zmiana pożywki z bogatej w glukozę na pozbawioną glukozy w celu promowania odrywania się rybosomów (ribosome runoff). Należy jednak pamiętać, że zmienia to stan metaboliczny komórek drożdży, co może wpłynąć na funkcję i stężenie rybosomów.
W celu odłączenia rybosomów od endogennego peptydylo-tRNA przeprowadza się inkubację z puromycyną.
<ol>
<li>Dostosować pH 10 mM roztworu puromycyny do wartości 7,5, dodając kroplami 1M KOH w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Dodać zneutralizowany roztwór puromycyny do eluatu, aby uzyskać końcowe stężenie ok. 1mM.</li>
<li>Dodać 10 mM GTP do końcowego stężenia 1 mM.</li>
<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 30°C.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie rybosomów poprzez sedymentację na poduszkach glicerolowych
<ol>
<li>Wlej 1 ml buforu poduszkowego (20 mM HEPES, pH 7.6, 10 mM Mg(OAc)2, 50 mM KCl, 2 mM DTT, 25% glicerolu) do poliwęglanowej probówki do ultrawirówki o objętości 4 ml.</li>
<li>Ostrożnie nałóż frakcje elucyjne traktowane puromycyną na wierzch poduszki i wiruj próbki z prędkością 10,0 x g przez noc w temperaturze 4°C.</li>
<li>Wyjmij probówki z rotora wirówki i odessaj nadstawi.</li>
<li>Przemyj osady zawierające oczyszczone rybosomy dwukrotnie 1 ml buforu poduszkowego.</li>
<li>Resuspenduj rybosomy w 10 μl buforu poduszkowego poprzez delikatne rozbicie osadu za pomocą szklanej rurki.</li>
<li>Po rozbiciu zakryj probówki parafilmem i mieszaj z umiarkowaną prędkością wortexie w chłodni przez jedną godzinę.</li>
<li>Przenieś zawartość do probówki do mikrocentryfugi, wiruj przez 5 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4°C i przenieś nadstawi do nowych probówek.</li> 
<li>Powtórz kroki 4.1 do 4.7, używając 2 ml buforu poduszkowego, z wyjątkiem tego, że w krokach 4.4 i 4.5 zamiast buforu poduszkowego należy użyć 10 μl buforu do przechowywania (50 mM HEPES -KOH pH 7.6, 50 mM NH4Cl, 5 mM Mg(OAc)2, 1 mM DTT, 25% glicerolu).</li>
<li>Oznacz ilość oczyszczonych rybosomów spektrofotometrycznie (1 A260 = 20 pmoli rybosomów drożdżowych) i przechowuj w temperaturze -80°C. Typowe wyniki z 1 grama drożdży to 300-40 pmoli rybosomów.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Przykład frakcji RNA wyekstrahowanych z każdego z trzech głównych etapów protokołu przedstawiono na Rysunku 2. Choć rRNAs stanowią główny składnik obecny w całkowitych lizatach komórkowych (T), zawierają one również dużą liczbę innych gatunków RNA. Rybosomy oczyszczone na kolumnie Sulfolink (SL) również zawierają znaczną ilość tRNAs ze względu na wysokie powinowactwo złoża kolumny do tych cząsteczek. Traktowanie tej frakcji puromycyną prowadzi do hydrolizy peptydów z peptydylo-tRNAs i sprzyja dysocjacji tych gatunków z rybosomów. Próbki traktowane puromycyną (Pm) nie zawierają współoczyszczonych tRNAs, a zatem reprezentują całkowicie czyste rybosomy. Jak raportowano wcześniej8, rybosomy te są wysoce nienaruszone i biochemicznie aktywne, co czyni je idealnymi substratami do szczegółowych analiz funkcjonalnych i strukturalnych.
<img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig1.jpg" alt="Schemat oczyszczania rybosomów drożdżowych: wzrost OD595, wirowanie, kulki sulfolink, traktowanie puromyciną." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rysunek 1. Schemat blokowy metody. Przedstawiono chromatograficzne oczyszczanie rybosomów z wykorzystaniem żywicy Sulfolink wiązanej poprzez cysteinę.
<img src="/files/ftp_upload/3214/3214fig2.jpg" alt="Wyniki elektroforezy żelowej RNA, prążki dla 25S, 18S rRNA, tRNA, innych RNA; markery masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2. Reprezentatywna analiza preparatów rybosomów. Ekstrahowano całkowite frakcje RNA z lizatów komórkowych (T), rybosomów oczyszczonych za pomocą Sulfolink (SL) oraz rybosomów oczyszczonych za pomocą Sulfolink, które następnie poddano działaniu puromycyny i sedymentowano na poduszce glicerolowej (Pm). Ścieżka M przedstawia markery wielkości RNA. Wskazano prążki odpowiadające rRNA 25S i 18S, a także tRNA i inne frakcje RNA. Na wszystkie ścieżki naniesiono 2 μg RNA.

<ol><li>Palade, G. E., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microsomes%3B+an+integrated+morphological+and+biochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).</li>
<li>Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interactions+of+Escherichia+coli+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).</li>
<li>Jelenc, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+highly+active+ribosomes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli.</a> Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).</li>
<li>Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+ribosomes+using+chloramphenicol+and+erythromycin+columns%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns.</a> Biochimie. 62, 69-77 (1980).</li>
<li>Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+important+amino+acids+of+ribosomal+protein+L3+by+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis.</a> Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).</li>
<li>Algire, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reconstituted+yeast+translation+initiation+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system.</a> RNA. 8, 382-397 (2002).</li>
<li>Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chromatography+system+to+isolate+active+ribosomes+from+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria.</a> RNA. 14, 188-195 (2008).</li>
<li>Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purity%2C+activity+and+structural+integrity+of+yeast+ribosomes+purified+using+a+general+chromatographic+method%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method.</a> RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).</li>
<li>Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+binding+to+80S+ribosomes+from+yeast%3A+evidence+for+three+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).</li>
<li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+puromycin+action%3A+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).</li>
<li>Nathans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromuycin+inhibition+of+protein+synthesis%3A+incorporation+of+puromycin+into+peptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).</li>
<li>Rabinovitz, M., Fisher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociative+effect+of+puromycin+on+the+pathway+of+protein+synthesis+by+Ehrlich+ascites+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).</li>
<li>Allen, D. W., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+puromycin+on+rabbit+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).</li>
<li>Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+puromycin+of+amino+acid+incorporation+into+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).</li>
<li>Becker-Ursic, D., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+phosphorylation+of+ribosomal+proteins+by+protein+kinases+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae.</a> Biochemistry. 15, 2289-2296 (1976).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Protokoły oczyszczania rybosomów polegają zasadniczo na lizie komórek, pozyskaniu frakcji cytozolowej poprzez wirowanie z niską prędkością, a następnie osadzaniu rybosomów metodą wirowania z wysoką prędkością 1. Choć do oczyszczania rybosomów bakteryjnych zastosowano kilka nowych metod, nie miało to miejsca w przypadku eukariotów 2-4. Mimo że na przestrzeni lat dodawano kolejne etapy, np. przemywanie solą oraz poduszki glicerolowe (np. patrz 5), badania biochemiczne i strukturalne rybosom...

<table><tbody><tr><td>Żywica Sulfolink Coupling</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>20402</td><td></td></tr><tr><td>Mini bead-beater 16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentryfuga Optima Max E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki szklane 0.5 mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7255</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Fermentas</td><td>R0461</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatograficzne oczyszczanie wysoce aktywnych rybosomów drożdżowych

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Rybosomy eukariotyczne są znacznie bardziej labilne w porównaniu do swoich odpowiedników eubakteryjnych i archealnych, co stanowi istotne wyzwanie dla badaczy. Szczególnie problematyczny jest fakt, że liza komórek uwalnia dużą liczbę proteaz i nukleaz, które mogą degradować rybosomy. Dlatego ważne jest jak najszybsze oddzielenie rybosomów od tych enzymów. Niestety konwencjonalne metody różnicowego ultrawirowania narażają rybosomy na działanie tych enzymów przez niedopuszczalnie długi czas, co wpływa na ich integralność strukturalną i funkcjonalność. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystujemy metodę chromatograficzną z użyciem żywicy Sulfolink naładowanej cysteiną. To proste i szybkie zastosowanie znacząco redukuje współoczyszczającą aktywność proteolityczną i nukleolityczną, zapewniając wysoką wydajność nienaruszonych, wysoce aktywnych biochemicznie rybosomów drożdżowych. Sugerujemy, że metoda ta powinna być również możliwa do zastosowania w przypadku rybosomów ssaków. Prostota metody oraz zwiększona czystość i aktywność rybosomów oczyszczonych chromatograficznie stanowią znaczący postęp techniczny w badaniach nad rybosomami eukariotycznymi.

Zanieczyszczenie preparatów rybosomów eukariotycznych oczyszczonych metodami tradycyjnymi współoczyszczającymi nukleazami i proteazami negatywnie wpływa na późniejsze analizy biochemiczne i strukturalne. W celu rozwiązania tego problemu zastosowano szybką i prostą metodę oczyszczania chromatograficznego, wykorzystując rybosomy drożdżowe jako system modelowy.

Chromatograficzne oczyszczanie wysoce aktywnych rybosomów drożdżowych

Rybosomy eukariotyczne są znacznie bardziej labilne w porównaniu z ich odpowiednikami eubakteryjnymi i archeonowymi, co stanowi istotne wyzwanie dla badaczy.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oczyszczenie nienaruszonych, wysoce aktywnych rybosomów drożdżowych. Jest to realizowane poprzez najpierw lizę komórek i klarowanie lizatu za pomocą wirowania przy wysokich prędkościach. W celu uzyskania frakcji S 30 wykorzystuje się następnie kolumnę z łącznikiem SFO załadowaną cysteiną do oczyszczenia rybosomów.Następnie, w ramach końcowego etapu oczyszczania, usuwa się zanieczyszczające tRNA poprzez traktowanie pumycyną. Rybosomy poddaje się ultrawirowaniu przy wysokiej prędkości. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak oczyszczanie metodą ultrawirowania, jest fakt, że zastosowanie kolumny z łącznikiem siarkowym pozwala na szybkie oddzielenie rybosomów od zanieczyszczających egzonukleaz i proteaz.Ponadto etap traktowania purmycyną oddziela rybosomy od zanieczyszczających gatunków RNA, takich jak tRNA. Kroki te zapewniają uzyskanie wysokiej wydajności wysoce aktywnych, nienaruszonych oczyszczonych rybosomów do zastosowań w badaniach biochemicznych i strukturalnych. Procedurę zaprezentuje Jonathan Leschen, adiunkt w moim laboratorium.Rozpocznij ten protokół, pipetując 50% zawiesinę żelu sprzęgającego sulfa link (według specyfikacji producenta) do dwóch plastikowych fiolek o pojemności 10 ml, rozdzielając po 5 ml do każdej z nich. Po krótkim odwirowaniu fiolek przy 850 ×g ostrożnie usuń nadsącz. Przemyj żel trzy razy w buforze sprzęgającym, resuspendTime kulek w 5 ml buforu, a następnie krótko wirując przy 850 ×g. Usuń nadsącz za pomocą pipety. Po przemyciu żywicy dodaj do każdej probówki 5 ml 50 mM roztworu L-cysteiny w buforze sprzęgającym.Mieszaj zawiesinę przez jedną godzinę w temperaturze 25 °C. Następnie usuń resztki L-cysteiny, przemywając żywicę trzykrotnie samym buforem sprzęgającym. Potem ponownie zawieś żel w 10 ml buforu wiążącego i zrównoważ żywicę, przemywając ją trzykrotnie.Na koniec przelej żywicę do kolumny wirówkowej o pojemności 10 mililitrów i ją zakryj. Żywicę można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza; jej pojemność wynosi około 20-60 jednostek na mililitr podczas chromatograficznego oczyszczania rybosomów, przy użyciu żywicy sulfa-link naładowanej cystyną.Wszystkie komponenty należy przechowywać w lodzie, a wszystkie roztwory przygotować przy użyciu wody wolnej od RNaz oraz poprzez filtrację sterylną. Drożdże należy hodować przez noc aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej w odpowiednich podłożach. Po zebraniu komórek poprzez wirowanie, jeden gram komórek należy przemyć buforem wiążącym i ponownie odwirować, a następnie resuspender komórki w jednym mililitrze buforu wiążącego do całkowitej objętości wynoszącej około dwóch mililitrów.Zniszcz komórki, stosując równą objętość szklanych kulek o średnicy 0,5 mm schłodzonych do 4 °C oraz mini homogenizator kuleczkowy (bead beader). Usuń niezniszczone komórki, organelle i resztki komórkowe poprzez wirowanie w ultrawirowarce przy 30 000 ×g przez 30 minut. W międzyczasie odwiruj żywicę przez jedną minutę przy 1000 ×g. Usuń roztwór do przechowywania bezpośrednio przed użyciem.Do każdego jednego grama komórek należy użyć dwóch mililitrów żywicy. Po ultrawirowaniu próbek należy oddzielić nadsączki lizatu komórkowego z wirowania przy 30 000 ×g, nazywane S 30. Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować zanieczyszczenie frakcją lipidową znajdującą się na samej górze lub resztkami komórkowymi na dnie probówek.Przenieś nadsącz bezpośrednio do przygotowanej zawiesiny SFO link. Inkubuj mieszaninę S 30 SFO link na lodzie przez 15 minut. Umieść kolumny w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i wiruj przy 1000 ×g przez jedną minutę, przenieś frakcje przepływowe z powrotem do kolumn, zakryj kolumny i odwróć je, aby wymieszać zawartość.Inkubować próbki przez kolejne 15 minut na lodzie. Następnie umieścić kolumny w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i wirować przy 1000 ×g przez jedną minutę, a następnie odrzucić filtrat. Po dodaniu 5 ml buforu wiążącego zakręcić kolumny i odwrócić je w celu wymieszania do całkowitego resuspensowania.Zdejmij nakrętki i wiruj kolumny przy 1000 ×g przez jedną minutę. Powtórz ten protokół płukania jeszcze dwa razy. Następnie dodaj 1,5 ml buforu elucyjnego do każdej kolumny.Wymieszać zawiesiny ręcznie i inkubować na lodzie przez dwie minuty. W ostatnim kroku umieścić kolumny w nowych probówkach stożkowych o pojemności 50 ml i wirować z przeciążeniem 1000 ×g przez jedną minutę, zebrać eluat i powtórzyć etap elucji jeszcze raz, tak aby końcowe połączone objętości próbek wynosiły około trzech ml. W celu usunięcia rybosomów z endogennego tRNA, przeprowadza się traktowanie purmycyną.Najpierw zneutralizuj 100 mM roztwór purmycyny do pH 7,5, dodając kroplami 1 M wodorotlenek potasu. Przechowuj w temperaturze pokojowej. Dodaj zneutralizowany roztwór purmycyny do eluatego, tak aby osiągnąć końcowe stężenie około 1 mM.Następnie dodaj 100 mM GTP do stężenia końcowego 1 mM. Inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 30 °C. Po inkubacji przelej 1 ml buforu poduszkowego do poliwęglanowej probówki do ultrawirówki o objętości 4 ml.Ostrożnie nanieś frakcje elucji traktowane purmycyną na warstwę poduszkową i wiruj próbki z prędkością 100 000 ×g przez noc. Po odessaniu nadosadów przemyj osady zawierające oczyszczone rybosomy jednym mililitrem buforu poduszkowego. Powtórz to przemywanie z użyciem drugiego mililitra buforu poduszkowego.Następnie Reza zawiesił rybosomy w 100 µL buforu poduszkowego, delikatnie rozbijając grudki za pomocą szklanej rurki. Następnie probówki przykryto Parafilmem i mieszano z umiarkowaną prędkością w vortexie w pomieszczeniu chłodniczym. Po godzinie mieszania zawartość przeniesiono do probówki do mikrocentryfugi i wirowano przez pięć minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.Przenieś nadnadkładniki do nowych probówek. Nałóż nadnadkładniki na 2 mL buforu poduszkowego w probówce do ultrawirówki, a następnie przeprowadź wirowanie przy 100 000 ×g przez noc. Następnego dnia wyjmij probówki z rotora wirówki i odessij nadnadkładniki.Stosując opisaną przed chwilą metodę, należy przemyć osady i resuspender rybosomy w buforze do przechowywania. Na koniec, przed zamrożeniem w temperaturze -80 °C, należy przeprowadzić fotometryczne oznaczanie ilości oczyszczonych rybosomów.Przedstawiono tutaj przykład frakcji RNA wyekstrahowanych z każdego z trzech głównych etapów protokołu, w tym z całkowitych lizatów komórkowych, z sufu link, oczyszczonych rybosomów oraz oczyszczonych rybosomów z sufu link, które następnie poddano działaniu purmycyny i sedymentacji na poduszce glicerolowej. Przedstawiono również markery wielkości RNA, podczas gdy nasze cząsteczki RNA stanowią główne frakcje obecne w całkowitych lizatach komórkowych. Zawierają one również znaczną liczbę innych gatunków RNA.Rybosomy oczyszczone przy użyciu kolumny sulfa link zawierają dużą ilość tRNA ze względu na wysokie powinowactwo złoża kolumny do tych cząsteczek. Traktowanie tej frakcji puromycyną prowadzi do hydrolizy peptydów z peptydylo-tRNA i sprzyja dysocjacji tych cząsteczek z rybosomów. Próbki traktowane puromycyną są pozbawione współoczyszczających gatunków tRNA i tym samym reprezentują całkowicie czyste rybosomy.Jak wykazano wcześniej, rybosomy te są w wysokim stopniu nienaruszone i biochemicznie aktywne, co czyni je idealnymi substratami do szczegółowych analiz funkcjonalnych i strukturalnych. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak testy monitorujące wiązanie ligandów z rybosomami oraz analizy strukturalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące właściwości biochemicznych i biofizycznych rybosomów eukariotycznych.

chromatographic-purification-of-highly-active-yeast-ribosomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Chromatograficzna czyszczenie wysoce aktywnych rybosomów drożdżowych

Opisujemy szybką i skuteczną metodę oczyszczania mitochondriów z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta umożliwia wysokowydajną izolację czystych mitochondriów, które są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami i zachowują swoją integralność strukturalną oraz funkcjonalną po oczyszczeniu.

Oczyszczanie mitochondriów z komórek drożdży

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą...

 Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

Przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z komórek drożdży jest niezbędnym pierwszym krokiem w analizie pojedynczych białek lub całych proteomów.  Tutaj opisujemy szybki, wydajny i niezawodny protokół homogenizacji pączkujących komórek drożdży, który został zoptymalizowany w celu zachowania funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych.

Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Tutaj prezentujemy przebieg procesu ekspresji, oczyszczania i wiązania liposomów heterodimerów SNX-BAR w drożdżach.

Ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów SNX-BAR drożdży

Prezentujemy szybką i opłacalną metodę produkcji rekombinowanego, bezkomórkowego systemu TX-TL PURE przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

System OnePot PURE bezkomórkowy

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Ten protokół przedstawia metodę izolacji chromatyny specyficzną dla locus, opartą na rekombinacji specyficznej dla miejsca, w celu oczyszczenia interesującego miejsca pojedynczej kopii genu w jego natywnym kontekście chromatyny z pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae.

Oczyszczanie chromatyny locus genu z pojedynczą kopią u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj szybką chromatograficzną metodę oczyszczania rybosomów drożdży, która eliminuje zanieczyszczenia nukleazami i proteazami. Technika ta zapewnia wysoką aktywność biochemiczną i integralność strukturalną rybosomów.

Chromatograficzne oczyszczanie wysoce aktywnych rybosomów drożdżowych

Przeglądaj więcej filmów