Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie mysiego modelu parkinsonizmu. W pierwszej kolejności przygotowuje się leki do zabiegu. Następnym krokiem jest przygotowanie aparatury chirurgicznej, po czym przeprowadza się jednostronną operację uszkodzenia za pomocą 6-hydroksydopaminy, zapewniając odpowiednią opiekę pooperacyjną.

Sześć zwierząt z wywołaną im przerwaną drogą dopaminergiczną za pomocą hydroksydopaminy może zostać wykorzystanych do eksperymentów behawioralnych. Ostatecznie wyniki wykazują ponad 95% deficytu dopaminy jednostronnie w przyśrodkowym pęczku brzusznym mózgu. Dwa najważniejsze aspekty tej procedury, na które należy zwrócić uwagę, to po pierwsze odpowiednia opieka pooperacyjna w celu zapewnienia przeżycia zwierząt.

Po drugie, należy przygotować sprzęt do infuzji 6-hydroksydopaminy, aby zapewnić całkowite dostarczenie neurotoksyny. Aby rozpocząć tę procedurę, wysterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Następnie przemyj wszystkie powierzchnie i sprzęt alkoholem izopropylowym.

Następnie przygotuj etap pooperacyjny, ustawiając klatkę regeneracyjną dla myszy z ręcznikami papierowymi na dnie. Umieść klatkę pod lampą grzewczą lub na podkładce grzewczej, aby przygotować wózek do anestezji. Upewnij się, że dopływ tlenu jest podłączony i otwarty, a zbiornik z izofluranem jest całkowicie pełny.

Następnie ustaw przepływ tlenu na 1% oraz stężenie izofluranu na 2 do 4%. Kolejnym krokiem jest złożenie aparatury infuzyjnej. Nałóż jedną metalową nakrętkę RN na jeden koniec rurki Peak, a następnie pierścień zaciskowy Peak cup. Następnie nałóż pierścień zaciskowy PFA; zorientuj pierścienie tak, aby stożek pierścienia zaciskowego PFA wsunął się w pasującą część pierścienia zaciskowego Peak cup.

Następnie umieść połączoną tulejkę szczytową oraz kanoniczną rurkę z PFA w obu końcach podwójnego łącznika RN o małej średnicy i dokręć metalną nakrętkę RN po przeciwnej stronie łącznika. Wprowadź igłę wstrzykiwacza o rozmiarze 33 G. Przewlecz igłę przez jedną z metalnych nakrętek RN i dokręć ją.

Upewnij się, że igła o rozmiarze 33 G znajduje się pod kątem 180 stopni względem podwójnego sprzęgacza RN o małym hubie. Następnie na drugim końcu rurki Peak nakręć jedną z metalowych nakrętek RN, a następnie pierścień dociskowy Peak cup. Po tym osadź pierścień PFA w głębszym rowku drugiego podwójnego sprzęgacza RN o małym hubie i dokręć metalową nakrętkę RN, aby zabezpieczyć połączenie.

Następnie, po drugiej stronie drugiego małego podwójnego łącznika hub RN, należy włożyć zgłębnik do małego adaptera hub RN i dokręcić metalną nakrętkę RN zgłębnika, aby zabezpieczyć połączenie. Konfiguracja aparatury infuzyjnej jest teraz zakończona. Kolejnym krokiem przygotowawczym jest odpowietrzenie aparatury infuzyjnej.

Najpierw napełnij strzykawki Hamiltona o objętości 250 µL i 1 µL wodą sterylną. Upewnij się, że nie ma w nich pęcherzyków powietrza. Następnie podłącz strzykawkę 250 µL do adaptera luerowego i wciśnij tłok strzykawki 250 µL w taki sposób, aby woda wypłynęła przez igłę wstrzykującą o rozmiarze 33G znajdującą się na drugim końcu rurki.

Nadal tłocz wodę przez system, jednocześnie wyciągając strzykawkę o objętości 250 µL z adaptera typu Luer. Pozostawiając małą kroplę wody na końcu adaptera Luer, naciskaj tłok strzykawki o objętości 1 µL, aż zostanie wydalona mała kropla wody. Następnie ostrożnie włóż strzykawkę o objętości 1 µL do adaptera Luer.

Upewnij się, że kropelka wody na strzykawce o pojemności 1 µL łączy się z kropelką wody na adapterze typu lure. Następnie całkowicie wsuń strzykawkę o pojemności 1 µL do adaptera lure i upewnij się, że w małym podwójnym łączniku typu RN hub nie ma pęcherzyków powietrza. Teraz przymocuj aparat perfuzyjny do ramy stereotaktycznej, a za pomocą zacisku pompy infuzyjnej przytwierdź mały podwójny łącznik typu RN hub z igłą wstrzykującą o rozmiarze 33G do ramienia manipulatora ramy stereotaktycznej.

Następnie przymocuj strzykawkę o objętości 1 µL do pompy perfuzyjnej. Po tym zaprogramuj pompę infuzyjną tak, aby prędkość infuzji wynosiła 0,1 µL/min, na 30 minut przed zabiegiem. Zważ zwierzę i zapisz jego masę.

Podaj myszy mieszaninę chlorowodorku dopaminy w stężeniu 2,5 mg/ml oraz chlorowodorku parlinu w stężeniu 0,5 mg/ml w dawce 10 ml/kg poprzez wstrzyknięcie dosytronne. Następnie umieść pod uchwytami usznymi i uchwytem siekaczy ciepły dysk grzewczy, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas operacji, oraz ustaw zwierzę na idealnej wysokości, dopasowując uchwyty uszne i siekaczy do ramienia stereotaktycznego. Procedurę przeprowadź 15 minut po wstrzyknięciu mieszaniny chlorowodorku dopaminy i chlorowodorku parlinu.

Umieść mysz w zamkniętej komorze do wywoływania drgawek. Zpodaj zwierzęciu znieczulenie poprzez inhalację izofluranem. Zwierzę uznaje się za odpowiednio znieczulone, gdy nie wykazuje reakcji na uciśnięcie tylnej kończyny oraz nie wykazuje odruchu mrugowego.

Następnie zgolić sierść z górnej części głowy myszy. W tym momencie umieścić mysz w aparacie stereotaksycznym. Włożyć pręt do siekaczy do pyska zwierzęcia i nałożyć maskę anestezjologiczną na jego pysk.

Następnie należy dostosować szybkość przepływu izofluranu. Na skórę, przy użyciu waty, nanieść bezpośrednio miejscowe znieczulenie w postaci lidokainy. Wyregulować belkę siekaczy oraz nakładki na uszy, aby wyrównać poziom górnej części czaszki.

Następnie zdezynfekuj skórę roztworem Betadine. Potem wprowadź uchwyty do uszu. Uchwyty są wprowadzone prawidłowo, gdy głowica przylega całkowicie płasko i nie może być przesunięta w żadnym kierunku.

Następnie, wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej głowy za pomocą ostrza skalpela i odchyl skórę. Osusz powierzchnię czaszki za pomocą gazika. Naciśnij tłok strzykawki o objętości 1 µL i wprowadź igłę wstrzykującą o rozmiarze 33 G do probówki o pojemności 1 mL zawierającej roztwór o stężeniu 15 mg/mL.

Roztwór 6-hydroksydopaminy osłonięty folią aluminiową. Powoli odciągnij tłok, utrzymując igłę wstrzykiwacza o rozmiarze 33 G zanurzoną w roztworze 6-hydroksydopaminy. Następnie skieruj końcówkę igły w stronę B bgma i podaj niewielką ilość roztworu 6-hydroksydopaminy, aby utworzyć małą kroplę.

Następnie powoli opuść końcówkę igły do iniekcji w kierunku torema. Gdy koralik dotknie bgma, przestań przesuwać igłę i zapisz te współrzędne. Cofnij igłę do iniekcji o dwa milimetry w kierunku grzbietowym i przesuń się wzdłuż szwu strzałkowego w kierunku rostralnym w stronę Lambda.

Gdy igła znajduje się nad Lambda, dozuj niewielką ilość roztworu sześciohydroksydopaminy z igły wtryskowej, aby utworzyć małą kropelkę. Następnie powoli opuszczaj końcówkę igły w kierunku lambda. W momencie, gdy kropelka dotknie Lambda, przestań posuwać igłę i zapisz te współrzędne.

Współrzędne przyśrodkowo-boczne oraz grzbietowo-brzuszne powinny być identyczne dla BMA i Lambda. Jeśli nie są, odpowiednio wyreguluj poprzeczkę siekaczy. W przypadku współrzędnych przednio-tylnych oraz drążków usznych dla współrzędnych przyśrodkowo-bocznych, przesuń igłę do współrzędnych wstrzyknięcia.

AP -1,2 mm, ML -1,1 mm względem bregmy. Podaj niewielką ilość roztworu z igły wtryskowej, aby utworzyć małą kropelkę. Umieść kropelkę na czaszce, aby zaznaczyć miejsce, w którym zostanie wykonany otwór. Następnie wycofaj igłę i wykonaj otwór w czaszce, używając igły o rozmiarze 25G.

Przywróć igłę wstrzykiwującą do współrzędnych wstrzyknięcia i wprowadź ją na minus pięć milimetrów w kierunku grzbietowo-brzusznym. Następnie podaj jednostronnie 0,2 µl 6-hydroksydopaminy lub nośnika do wiązki przedniego mózgu z prędkością 0,1 µl na minutę. Po zakończeniu podania 6-hydroksydopaminy lub nośnika pozostaw igłę w miejscu wstrzyknięcia przez kolejne pięć minut, aby umożliwić dyfuzję z miejsca iniekcji.

Następnie powoli wycofać igłę, zamknąć nacięcie skóry głowy za pomocą trzech szwów, a następnie podać podskórnie jeden mililitr roztworu Ringer-lakteowego. Na koniec wyjąć zwierzę z ramy stereotaksycznej i umieścić je w klatce regeneracyjnej do czasu odzyskania przytomności. 15 do 21 dni po operacyjnym uszkodzeniu za pomocą 6-hydroksydopaminy.

Po całkowitym ustąpieniu procesu obumierania komórek wywołanego przez neurotoksynę, można zmierzyć spontaniczne rotacje o 360 stopni, aby ocenić skuteczność uszkodzenia wywołanego przez 6-hydroksydopaminę. W tej ocenie behawioralnej myszy z indukowanym przez 6-hydroksydopaminę ubytkiem dopaminy przekraczającym 95% wykazują znacznie więcej rotacji ipsilateralnych niż myszy z częściowym uszkodzeniem 6-hydroksydopaminą lub zwierzęta po zabiegu pozorowanym. Poprzez korelację poziomu dopaminy w jądrze prążkowanym z procentem spontanicznych rotacji ipsilateralnych u każdego zwierzęcia stwierdzono, że myszy, które po uszkodzeniu 6-hydroksydopaminą wykazywały 70% lub więcej rotacji ipsilateralnych, utraciły ponad 95% dopaminy w jądrze prążkowanym.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat skutecznego przeprowadzania stereotaktycznej, z kontrolowaną perfuzją, lekcji 6-hydroksydopaminą u myszy. Pozwoli to na osiągnięcie poziomu wyczerpania dopaminy przekraczającego 95%. Ponadto powinni Państwo zrozumieć, jak przeprowadzić ocenę behawioralną parkinsonizmu u myszy.