Name: Wysokoprzepustowy test scukrzania dla materiałów lignocelulozowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę oceny potencjału sacharyfikacji biomasy roślinnej przy użyciu zautomatyzowanej platformy. Technika ta umożliwia szybkie przesiewanie genotypów pod kątem produkcji biopaliw.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować A Viksø-Nielsen (Novozymes) za przekazanie enzymów celulolitycznych. Praca ta została sfinansowana przez FP7 RENEWAL oraz projekty BBSRC BB/G016178 i BB/G016194.

1. Przygotowanie próbek
Zazwyczaj pracujemy z łodygami roślin zielnych lub zdrewniałych. W przypadku materiałów zielnych rośliny hoduje się do pełnej dojrzałości, a po wykształceniu się nasion zbiera suche łodygi po całkowitym zakończeniu procesu starzenia. Łodygi sieka się na segmenty o długości 4 mm i umieszcza w probówkach o pojemności 2 ml wraz z trzema kulkami mielącymi. W przypadku materiałów zdrewniałych próbki ściera się grubym tarnikiem do drewna do postaci gruboziarnistych trocin, a następnie umieszcza w młynku kulowym w celu dalszej obróbki.
Próbki umieszcza się w statywie w stacji mielenia i formatowania (Rysunek 1). Stacja ta sekwencyjnie mieli, miesza i waży każdą próbkę. Liczbę powtórzeń niezbędnych dla każdej próbki ustala się poprzez badanie zmielonego materiału w serii eksperymentów wstępnych, w których określa się zmienność wewnętrzną dla danej wielkości cząstek. Probówki o pojemności 2 mL są przebijane od spodu, a materiały są dozowane poprzez wibrację probówki nad wybranym dołkiem. Ramię wibrujące jest sterowane sygnałem zwrotnym z wagi, co pozwala na precyzyjne dozowanie proszku. Robot dozuje 4 mg/well w standardowej analizie, a w większości przypadków wymagane są 4 powtórzenia. Pozwala to na analizę 20 próbek roślin/płytkę.
2. Obróbka wstępna
Po sformatowaniu próbek, płytki 96-dołkowe są przetwarzane przez zautomatyzowany system do obsługi cieczy (Rycina 2). Na tym etapie przeprowadza się łagodne wstępne przygotowanie materiałów roślinnych poprzez dodanie 350 μL roztworów kwasowych lub zasadowych i ogrzewanie płytki w dostosowanym bloku. Aby uniknąć parowania podczas analizy, płytki 96-dołkowe uszczelnia się matą silikonową. Temperaturę i czas wstępnego przygotowania można modyfikować w zależności od badanych materiałów. Maksymalna temperatura wynosi jednak 100 °C. Alternatywną procedurą w przypadku testowania bardziej agresywnych metod wstępnego przygotowania jest opracowanie materiałów w trybie off-line i pominięcie etapu wstępnego przygotowania w głównym procesie.
3. Hydroliza
<ol>
 <li>Po wstępnej obróbce materiałów robot automatycznie usuwa roztwór do wstępnej obróbki i płucze wszystkie dołki 5 razy, używając 850 μL 25 mM buforu octanowego. Płukanie odbywa się poprzez dodawanie buforu do roztworu do wstępnej obróbki, a następnie usuwanie 50% całkowitej objętości po odczekaniu do osadzenia się substancji stałych w próbce. Wysokość aspiracji jest ustawiona na połowę masy cieczy, aby uniknąć aspiracji ciał stałych z dna dołka; przy zastosowaniu tej metody strata substancji stałych jest pomijalna. Po tych etapach płukania pH w dołku wynosi 4,5, a materiał jest gotowy do hydrolizy enzymatycznej.</li>
 <li>Robot dodaje mieszaninę enzymów zawierającą roztwór celulaz i hemicelulaz. Do każdego dołka dozowane jest 850 μL mieszaniny enzymów, a płytka jest przenoszona do inkubatora z wytrząsaniem w temperaturze 50 °C. Standardowa hydroliza trwa 8 h, jednak czas ten można dostosować do celu eksperymentu. Standardowe obciążenie enzymem stosowane dla traw wynosi 7 FPU/g materiału.</li>
</ol>
4. Wykrywanie cukrów redukujących
Oznaczenie cukrów redukujących uwolnionych po hydrolizie przeprowadzono przy użyciu zmodyfikowanej metody z wykorzystaniem hydrozonu 3-metylo-2-benzotiazolinonu (MTBH)3. Metodę MBTH wybrano jako najodpowiedniejszą, ponieważ była ona najłatwiejsza do zautomatyzowania i najmniej podatna na zakłócenia powodowane przez związki takie jak białka. Zmodyfikowaliśmy tę wysoce czułą metodę w celu zastosowania jej na platformie robotycznej, aby umożliwić dokładne oznaczanie ilości cukrów w stężeniach występujących w hydrolizatach biomasy, przy końcowej objętości 250 μL, która jest odpowiednia dla standardowej optycznej płytki 96-dołkowej. Wszystkie poniższe etapy są wykonywane automatycznie, a dla każdej reakcji sacharyfikacji przeprowadzono trzy niezależne oznaczenia cukrów redukujących.
<ol>
 <li>30 μL hydrolizatu pobrano z płytki do głębokich studzienek i wymieszano z 45 μL 25 mM buforu octanu sodu w płytce PCR z 96 studzienkami i ramką.</li>
 <li>Dodano 25 μL 1N NaOH oraz 50 μl roztworu zawierającego 0,43 mg/ml MBTH i 0,14 mg/ml DTT.</li>
 <li>Po wymieszaniu płytkę PCR podgrzewano w temperaturze 60°C przez 20 min w termocyklerze lub podobnym urządzeniu, które dostarcza dokładnie taką samą ilość ciepła do wszystkich 96 studzienek.</li>
 <li>Uzyskaną mieszaninę reakcyjną przeniesiono na płytkę optyczną.</li>
 <li>Dodano 100 μl odczynnika utleniającego (0,2% FeNH4(SO4)2, 0,2% kwasu sulfaminowego i 0,1% HCl). Całość dokładnie wymieszano i pozostawiono do rozwoju koloru na co najmniej 1 h.</li>
 <li>Każda płytka powinna zawierać również reakcje wzorcowe z 50 nmol, 100 nmol i 150 nmol glukozy. Płytki optyczne odczytuje się przy 620 nm.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki: 
Przykłady różnych rodzajów analiz przedstawiono na rysunkach 3 i 4. Wszystkie wyniki uzyskano przy użyciu platformy zautomatyzowanej. Rysunek 3 przedstawia wzrost ilości uwalnianych cukrów redukujących podczas 8 h inkubacji zmielonej topoli przy zwiększających się ilościach enzymów celulolitycznych. Rysunek 4 prezentuje wpływ obróbki wstępnej w środowisku kwasowym i zasadowym na próbki topoli. Obróbka wstępna NaOH jest bardziej efektywna niż obróbka rozcieńczonym H2SO4 w ułatwianiu uwalniania cukrów podczas hydrolizy. Ilość cukrów zmierzona po hydrolizie maleje, gdy obróbka wstępna jest przeprowadzana przy stężeniach NaOH wyższych niż 1M.
<img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="Konfiguracja systemu automatyzacji laboratoryjnej; robotyczna obsługa, przetwarzanie próbek; stanowisko z wyposażeniem badawczym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Stacja robotyczna do mielenia i formatowania biomasy do płytek 96-dołkowych
<img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="Zautomatyzowana stacja robocza PCR do amplifikacji DNA w laboratorium genomiki, przedstawiająca konfigurację sprzętu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Stacja do dozowania cieczy w wysokoprzepustowej analizie sacharyfikacji
<img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający wpływ stężenia enzymu na uwalnianie cukrów; słupki błędów wskazują zmienność." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wpływ różnych dawek enzymów na uwalnianie ekwiwalentów cukrów redukujących z próbek topoli
<img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="Wykres słupkowy, analiza danych dotycząca wpływu modulacji. Wykres A: zmienne stężenie; Wykres B: zmienne jednostki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wpływ różnych obróbek wstępnych na sacharyfikację próbek topoli. A. Cukry uwolnione po obróbce wstępnej różnymi stężeniami H2SO4 w temperaturze 90°C przez 30 minut. B. Cukry uwolnione po obróbkach wstępnych NaOH w tej samej temperaturze i czasie, co w przypadku obróbki kwasowej.

<ol><li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Physiol+Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li>
<li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass%3A+the+writing%27s+on+the+walls%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li>
<li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li>
<li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W tej samej platformie można zastosować modyfikacje standardowego protokołu sacharyfikacji w celu określenia aktywności enzymów celulolitycznych (np. poprzez zmianę stężeń enzymów stosowanych w płytce oraz wykorzystanie papieru jako substratu), porównania wydajności kilku mieszanin enzymatycznych na konkretnym materiale, opracowania przebiegu czasowego sacharyfikacji itd.
Standardowy protokół sacharyfikacji służący do porównania potencjału sacharyfikacji w różnych materiałach roślinnych obejmuje ośmiogodzinną hydrolizę (Ryc. 3 i 4). Większość analizowanych materiałów roślinnych wymaga czterech powtórzeń. W tych warunkach platforma może przetwarzać 80 próbek dziennie. Analiza ta jest wykorzystywana do przesiewania dużych populacji jęczmienia, kukurydzy i brachypodium w celu ustalenia zmienności potencjału sacharyfikacji oraz genów zaangażowanych w jego determinację4.

<table><tbody><tr><td>Rozdrabnianie &amp;robot ważący</td><td>Automatyzacja Labman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówka mikrocentryfugowa 2 ml z zakrętkami</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>72.694</td><td></td></tr><tr><td>kulki ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>płytki do przechowywania Abgene z kwadratowymi dołkami o pojemności 1,2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>TUL-050-050C</td><td></td></tr><tr><td>Mata absorbująca Whatman do płytek 96-dołkowych o przekroju kwadratowym </td><td>Fisher Scientific</td><td>7704-0104</td><td></td></tr><tr><td>Robot do pipetowania cieczy</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>Freedom Evo 200</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy </td><td>Fisher Scientific</td><td>S/9231/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu </td><td>Fisher Scientific</td><td>BPE359-500</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0420/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Novozyme 188</td><td>Novozyme</td><td>DCN00214</td><td></td></tr><tr><td>Celluclast 1,5 l</td><td>Novozyme</td><td>CCN03122</td><td></td></tr><tr><td>płytki PCR 96-dołkowe z pełnym obramowaniem</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>72.1980.202</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0450/53</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat chlorowodorku 3-metylo-2-benzotiazolinonu hydrazonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>129739-25G</td><td></td></tr><tr><td>DL-ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9163-1G</td><td></td></tr><tr><td>mikropłytka Corning 96-dołkowa z płaskim dnem </td><td>Fisher Scientific</td><td>TKT-521-050H</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza(III) i amonu dwunastowodny </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1668-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas sulfaminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242772-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>12462-0026</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test sacharyfikacji materiałów lignocelulozowych

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polisacharydy tworzące lignocelulozową biomasę roślinną mogą być rozkładane w celu wytworzenia szeregu cukrów, które następnie mogą zostać wykorzystane do stworzenia biorafinerii. Surowce te stanowiłyby nową platformę przemysłową, która byłaby zarówno zrównoważona, jak i neutralna pod względem emisji węgla, zastępując obecną zależność od paliw kopalnych. Odporność na dekonstrukcję obserwowana w materiałach lignocelulozowych wynika z kilku wewnętrznych właściwości ścian komórkowych roślin. Krystaliczna celuloza jest zatopiona w macierzy polisacharydowej, takiej jak ksylany i arabinoksylany, a cała struktura jest otoczona polimerem fenolowym – ligniną, która również jest trudna do strawienia 1. Aby poprawić strawność materiałów roślinnych, musimy zidentyfikować główne bariery w procesie sacharyfikacji ścian komórkowych, a także przeanalizować populacje mutantów i linie hodowlane w celu oceny zmienności sacharyfikacji 2. Zadania te wymagają podejścia wysokoprzepustowego, dlatego przedstawiamy tutaj platformę analityczną, która umożliwia przeprowadzenie analizy sacharyfikacji w formacie płytki 96-dołkowej. Platforma ta została opracowana w celu umożliwienia przesiewowej oceny strawności lignocelulozy w dużych populacjach różnych gatunków roślin. Zredukowaliśmy objętości reakcji dla łagodnego przygotowania wstępnego, częściowej hydrolizy enzymatycznej oraz oznaczania cukrów, aby umożliwić szybką ocenę dużych liczebności próbek w systemie zautomatyzowanym.
Ta zautomatyzowana platforma pracuje z miligramowymi ilościami biomasy, przeprowadzając mielenie kulowe w kontrolowanych warunkach, aby w sposób powtarzalny zredukować materiały roślinne do ustandaryzowanej wielkości cząstek. Po zmieleniu próbek zautomatyzowany robot formatujący dozuje określone i zapisane ilości materiału do odpowiednich dołków płytki głębokodotykowej 96-dołkowej (Rycina 1). Zazwyczaj dozujemy ten sam materiał do 4 dołków, aby uzyskać 4 powtórzenia do analizy. Gdy płytki zostaną wypełnione materiałem roślinnym zgodnie z pożądanym układem, są one przenoszone ręcznie do stacji obsługi cieczy (Rycina 2). W stacji tej próbki poddawane są łagodnej obróbce wstępnej za pomocą rozcieńczonego kwasu lub odczynnika alkalicznego i inkubowane w temperaturach do 90°C. Następnie roztwór do obróbki wstępnej jest usuwany, a próbki płukane buforem w celu przywrócenia pH odpowiedniego do hydrolizy. Próbki są następnie inkubowane z mieszaniną enzymów przez zmienny czas w temperaturze 50°C. Z hydrolizatu pobierana jest alykwoata, a zawartość cukrów redukujących jest automatycznie oznaczana kolorymetryczną metodą MBTH.

Opisano prostą i szybką metodę określania potencjału sacharyfikacji dla dużej liczby próbek biomasy roślinnej. Zautomatyzowana platforma do tej analizy obejmuje przygotowanie biomasy roślinnej do analizy w płytkach 96-dołkowych, a następnie przeprowadzenie obróbki wstępnej, hydrolizy oraz kwantyfikacji uwolnionych cukrów.

Wysokoprzepustowy test sacharyfikacji materiałów lignocelulozowych

Polisacharydy tworzące lignocelulozową biomasę roślinną mogą zostać rozłożone w celu wytworzenia szeregu cukrów, które następnie mogą być wykorzystane do ustanowienia...

Cześć, jestem Kara Ted, ja jestem Leo. Moja kolej. A ja jestem Simon McQueen Mason.Strawność biomasy roślinnej jest obecnie tematem budzącym duże zainteresowanie. Wynika to z faktu, że w polisacharydach ścian komórkowych roślin tworzących tę biomasę uwię져 jest znaczna ilość cukrów, a jeśli uda nam się pozyskać te cukry w formie przydatnej, możemy poddać je fermentacji w celu produkcji różnorodnych produktów, takich jak paliwa i chemikalia. Niestety, materiały te są niezwykle trudne do strawienia, dlatego pilną kwestią jest lepsze zrozumienie czynników kontrolujących tę strawność.Aby móc wykorzystać materiał roślinny do produkcji grupy odnowy, musimy być w stanie zmierzyć potencjał sakaryfikacji tych roślin. Dlatego tutaj, na Uniwersytecie w Yorku, przesiewamy duże populacje materiału roślinnego, aby określić ich potencjał sakaryfikacji. Sakaryfikacja jest procesem rozkładu złożonych węglowodanów na ich komponenty monosacharydowe w celu wytworzenia cennych chemikaliów za pomocą różnych procesów przemysłowych.Aby zmierzyć potencjał sacharyfikacji, odtwarzamy procesy przemysłowe w skali mikro, poddając biomasę obróbce wstępnej oraz hydrolizie enzymatycznej w celu oznaczenia uwolnionych cukrów. Pozwala to na zidentyfikowanie interesujących wariantów genotypowych. System wysokoprzepustowy pracuje w formacie sześciodołkowej płytki IG.Łagodne warunki hydrolizy są stosowane w celu ujawnienia subtelnych różnic między genotypami; są one również na tyle elastyczne, że pozwalają na wykorzystanie różnych materiałów substratowych oraz ocenę różnych enzymów. Stosowana przez nas metoda polega na sprowadzeniu materiału roślinnego do postaci proszku, który następnie poddaje się wstępnej obróbce rozcieńczonym kwasem lub zasadą w temperaturze 90°C przez 20 minut. Następnie przeprowadzany jest trawienie enzymatyczne z użyciem komercyjnej mieszaniny celulaz w temperaturze 50°C przez osiem godzin.Na koniec, do oznaczenia uwalniania cukrów redukujących stosuje się metodę MBTH. Materiał roślinny jest zbierany w formie suchych łodyg, które tnie się na cząstki o długości 4 mm. Są one umieszczane w fiolkach o pojemności 2 ml wraz z trzema metalowymi kulkami o średnicy 5 mm.Fiolki są indywidualnie oznakowane kodami kreskowymi, które są skanowane w celu zapewnienia identyfikowalności próbek. Próbki są ładowane do robotów do mielenia i formatowania. Próbki są automatycznie mielone i mieszane, aby umożliwić dozowanie biomasy do płytki 96-dołkowej.Fiolki są przebijane, a następnie każda z nich jest ponownie ustawiana w ramieniu robota tak, aby znajdowała się w lejku, który wibruje w celu dozowania proszku. Wibracje lejka są regulowane przez wagę, aby uzyskać docelową masę dozowaną na każdą studzienkę. Biomasa jest dozowana do 10 kolumn płytek, przy czym dwie kolumny pozostają wolne dla standardów.Wykonując cztery powtórzenia dla każdej próbki, ładujemy 20 próbek na jedną płytkę. Hydrolizat z tej płytki zostanie naniesiony w trzech powtórzeniach na płytki PCR, co da trzy płytki optyczne. W ten sposób otrzymujemy trzy oznaczenia cukrów redukujących dla każdej studni biomasy.Po sformatowaniu płytki są uszczelniane matą silikonową, aby zapobiec odparowywaniu. Gdy są gotowe, zostają przeniesione do robota do obsługi cieczy. W robotach do obsługi cieczy obróbka wstępna, hydroliza enzymatyczna oraz oznaczanie uwolnionych cukrów są wykonywane automatycznie.Dwumetrowy stół wyposażony jest w pojemniki na poszczególne niezbędne odczynniki oraz miejsce do przechowywania wyrobów z tworzywa sztucznego. Znajdują się tu inkubatory do obróbki wstępnej i hydrolizy, a także termocyklery do oznaczania zawartości cukrów. Obróbka wstępna jest przeprowadzana w płytce głęboko dołkowej.Poprzez dodanie rozcieńczonych roztworów kwasowych lub zasadowych do proszku z biomasy. Płytki przenosi się do bloku grzejnego i inkubuje w temperaturze 90 °C przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji pozostałości po obróbce wstępnej usuwa się poprzez pięciokrotne płukanie 500 µl buforu octanowego.Po wypłukaniu preparatu wstępnie potraktowanego dodaje się koktajl enzymatyczny. Jest to standardowa mieszanina. Zawiera ona celulazę oraz novozyme 1, 8 8 w stosunku cztery do jednego, przy stężeniu 7 FPU na dołek.Płytki inkubuje się przez osiem godzin w temperaturze 50 °C przy wytrząsaniu. 75 µl otrzymanego hydrolizatu przenosi się na płytkę do PCR. W kolumnach 11 i 12 płytek do PCR dodaje się wzorce glukozy.Następnie do wszystkich studni dodaje się 25 µL 1 M wodorotlenku sodu. Na koniec do płytki PCR pipetuje się 50 µL odczynnika MBTH. Płytka z głębokimi studniami jest przechowywana po zakończeniu przenoszenia hydrolizatu do trzeciej płytki PCR.Płytki PCR przenosi się do termocyklerów w celu inkubacji w temperaturze 60 °C przez 15 minut. Ostatnim etapem procesu jest przeniesienie mieszaniny reakcyjnej na płytki optyczne w celu wywołania barwy. Po inkubacji płytki PCR wyjmuje się z termocyklera.Do przeniesionej mieszaniny reakcyjnej dodaje się 100 µL odczynnika utleniającego. Aby ułatwić rozwój barwy, proces dozowania cieczy jest powtarzany czterokrotnie w ciągu 24 godzin, przy czym płukanie wstępne i dodanie enzymu zajmuje około dwóch godzin. Hydroliza enzymatyczna trwa osiem godzin, a oznaczenie cukrów kolejne dwie godziny.Podczas gdy pierwsza płytka inkubuje się przez osiem godzin, rozpoczyna się proces z kolejną płytką. Dzięki takiemu rozmieszczeniu zasobów robota osiągana jest wydajność na poziomie 80 próbek dziennie w celu określenia ilości uwolnionych cukrów redukujących. Płytki optyczne są odczytywane przy 620 nanometrach.Uzyskane wyniki są analizowane w celu określenia ilości uwolnionych cukrów jako nanomoli na miligram na godzinę reakcji. Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że zainspiruje to Państwa badania nad biopaliwami.

high-throughput-saccharification-assay-for-lignocellulosic-materials

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokowydajne badanie sacharyfikacji materiałów lignocelulozowych

Biomasa roślinna jest głównym, neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla odnawialnym zasobem, który może być wykorzystywany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu węglowodanów pochodzących ze ścian komórkowych.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowy screening aktywności celulolitycznej z biblioteki metagenomicznej eksprymowanej w Escherichia coli. Screening opiera się na analizie w roztworze, jest wysoce zautomatyzowany i wykorzystuje chemię jednopojemnikową w mikropłytkach 384-dołkowych, z końcowym odczytem w postaci pomiaru absorbancji.

Wysokoprzepustowy screening aktywności celulazy w procesie biominingu z bibliotek metagenomicznych

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Ten film demonstruje test do badania enzymów skutecznych w degradacji złożonych polisacharydów w biomasie roślinnej przy użyciu nierozpuszczalnej biomasy chromogenicznej lub ICB. Enzymy hydrolizują ICB w celu uwolnienia rozpuszczalnych oligosacharydów związanych z barwnikiem, a aktywność enzymu ocenia się za pomocą analizy kolorymetrycznej produktu reakcji.

Badania przesiewowe nierozpuszczalnych enzymów chromogennych na bazie biomasy: test oceniający aktywność degradacji enzymów rozkładających biomasę roślinną

Odpady przemysłowe mogą być zbierane i modyfikowane w celu analizy rozwoju mikroorganizmów. Techniki ekstrakcji lignocelulozy dostarczają składników do analizy określonej zdolności biodegradacji. Chromatografia gazowa ze spektrometrią mas identyfikuje produkty fermentacji mikroorganizmów wyhodowanych na odpadach z roztwarzania. Metody te określają zdolność metaboliczną mikroorganizmów do rozkładu odpadów z roztwarzania.

Metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Techniki adaptacyjnej ewolucji i izolacji są opisane i zademonstrowane, aby uzyskać pochodne szczepu Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, które są w stanie szybko zużywać mieszaninę cukrów heksozowych i pentozowych w enzymatycznych scukrzanych niedetoksykowanych hydrolizatach i gromadzić ponad 40 g/L etanolu.

Techniki ewolucji wytrzymałych drożdży fermentujących pentozy do biokonwersji lignocelulozy do etanolu

Pokazano wstępną obróbkę biomasy lignocelulozowej za pomocą protonowych, tanich płynów jonowych, w wyniku czego powstaje deligtynizowana miazga bogata w celulozę i oczyszczona lignina. Miazga powoduje wysoką wydajność glukozy po scukrzaniu enzymatycznym.

Wstępna obróbka biomasy lignocelulozowej za pomocą tanich cieczy jonowych

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

OrganoCat to metoda wstępnej obróbki i frakcjonowania lignocelulozy w łagodnych warunkach na ligninę, cukry fermentacyjne i miazgę celulozową. W biogennym, dwufazowym układzie rozpuszczalnikowym składającym się z wody i 2-metylotetrahydrofuranu z kwasem 2,5-furankarboksylowym jako katalizatorem, produkty OrganoCat są rozdzielane in situ w celu łatwego odzyskania produktu.

Frakcjonowanie biomasy lignocelulozowej w procesie OrganoCat

Poznaj wysokoprzepustową metodę oceny potencjału sacharyfikacji biomasy roślinnej przy użyciu zautomatyzowanej platformy. Technika ta umożliwia szybkie przesiewanie genotypów pod kątem produkcji biopaliw.

Wysokoprzepustowy test sacharyfikacji materiałów lignocelulozowych

Przeglądaj więcej filmów