Name: Wprowadzenie naprężeń ścinających w badaniu adhezji bakteryjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Poznaj metodę badania adhezji bakteryjnej pod wpływem naprężeń ścinających przy użyciu komór komor przepływowych i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala ilościowo ocenić kolonizację bakterii Neisseria meningitidis na komórkach endotelialnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Emilie Mairey i Emmanuelowi Donnadieu za wstępne opracowanie procedury.

1. Hodowla ludzkich komórek gospodarza i bakterii
<ol>
	<li>Hodować HUVEC w przejściach od 1 do 9 w 37° w inkubatorze z nawilżeniem i zawartością 5% (v/v) CO22Przeszczepić komórki, gdy osiągną 80% konfluencji, używając trypsyny/EDTA, w celu prowadzenia kultur podtrzymujących na naczyniach o powierzchni 75 cm².2 kolby hodowlane i kultury eksperymentalne w jednorazowych komorach przepływowych (μ-preparaty VI).</li>
	<li>Odessać pożywkę z kolb przeznaczonych do pasażowania, przemyć komórki 10 ml PBS, odessać go i zastąpić 1,5 ml trypsyny/EDTA. Pozostawić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej na 5 minut w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Zebrać komórki wraz z 10 ml pożywki hodowlanej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Osadzić komórki poprzez wirowanie przez 5 minut (przy 20 g) w temperaturze pokojowej. Resuspender komórki w 4 ml pożywki Endo-SFM uzupełnionej o 10% (v/v) FBS i policzyć je za pomocą komory Malasseza zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Wprowadzenie 30 μl o stężeniu 1x106 komórek HUVEC na ml zawiesiny do kanału (3x104 (łącznie) i pozostawić komórki do adhezji na 3 godziny w 37° w inkubatorze z nawilżeniem i atmosferą zawierającą 5% (v/v) CO22Dodać dodatkową objętość 120 μl medium Endo-SFM w celu wypełnienia dołków. Komórki powinny tworzyć subkonfluencyjną warstwę jednowarstwową (Rysunek 2).</li>
	<li>Hodowla *N. meningitidis* wyrażającym GFP (w tym przypadku szczep 8013 wyrażający GFP pod kontrolą promotora indukowalnego przez IPTG), na płytkach z agarem GCB z dodatkami Kellogg's i 5 μg/ml chloramphenikolu w stężeniu 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% (v/v) CO22 przez 16 godzin.</li>
</ol>
2. Wstępna adhezja pojedynczych bakterii do komórek gospodarza
<ol>
	<li>Dostosować stężenie bakterii wyhodowanych na płytkach z agarem GCB do wartości OD600 wynoszącej 0,05, używając uprzednio ogrzanego medium Endo-SFM zawierającego 10% (v/v) FBS, a następnie inkubować przez 120 minut w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% (v/v) CO2, przy łagodnym wstrząsaniu (130 rpm). Indukować ekspresję GFP poprzez dodanie 1 mM IPTG do pożywki przez cały okres inkubacji.</li>
	<li>Umieścić jednorazową kasetkę μ-Slide na stole mikroskopu odwróconego wyposażonego w platformę grzewczą w celu utrzymania temperatury próbki na poziomie 37°C.</li>
	<li>Nalać uprzednio ogrzane Endo-SFM uzupełnione o 2% (v/v) FBS do sterylnego zlewki szklanej i napełnić tym medium sterylną strzykawkę 50 ml. Podłączyć przewód „wejściowy” do strzykawki i napełnić go, wprowadzając medium.</li>
	<li>Ostrożnie połączyć przewód „wejściowy” z kasetką μ-Slide, aby uniknąć wprowadzenia powietrza do komory. Następnie przymocować przewód „wyjściowy” do drugiego końca i ostrożnie napełnić kanał medium do odległości około 1 cm od „wyjścia” komory.</li>
	<li>Zmierzyć OD60 bakterii i dostosować do poziomu 0,15 w Endo-SFM zawierającym 2% (v/v) FBS. Aby móc obserwować pojedyncze bakterie, wszelkie agregaty należy rozbić poprzez intensywne mieszanie próbki bakteryjnej na wortexie.</li>
	<li>Wprowadzić 10 μl medium Endo-SFM uzupełnionego o 2% (v/v) FBS do zbiornika, a następnie dodać 100 μl roztworu bakteryjnego pobranego z górnej warstwy roztworu po wortexowaniu, aby uniknąć pobrania pozostałych agregatów bakteryjnych.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadzić objętość 20 μl do kasetki μ-Slide, przekręcając kurek, aby wstrzyknąć bakterie do komory.</li>
	<li>Wprowadzić do komory Endo-SFM zawierające 2% (v/v) FBS, utrzymywane w temperaturze 37°C za pomocą platformy grzewczej, przy użyciu pompy strzykawkowej z naprężeniem ścinającym zgodnym z adhezją wynoszącym 0,04 dynes/cm2 przez 15 minut.</li>
</ol>
Patrz na przykład wideo 1 lub rycinę 3. Po tym kroku przejdź do sekcji 3, 4 lub 6.
3. Ilościowe oznaczenie początkowej adhezji pojedynczych bakterii do komórek gospodarza
<ol>
	<li>Po wstępnej adhezji trwającej 15 minut, należy obrazować dziesięć randomly wybranych pól w czasie, gdy ciecz wciąż krąży.</li>
	<li>Nabyte obrazy analizuje się przy użyciu oprogramowania ImageJ 8 w celu wyznaczenia średniej liczby przytwierdzonych bakterii na pole. Procedura przebiega następująco: najpierw każdy obraz poddaje się progowaniu za pomocą okna „Threshold” w menu „Image”, aby uwydatnić poszczególne przytwierdzone fluorescencyjne bakterie, minimalizując jednocześnie tło pochodzące od komórek. Następnie każdą pojedynczą bakterię przelicza się, korzystając z wtyczki „Cell Counter” (<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a>). Dane dla każdego obrazu zapisuje się w arkuszu Excel, a następnie wyciąga z nich średnią, aby określić średnią liczbę przytwierdzonych bakterii na pole.</li>
</ol>
4. Pomiar oporu przeciwko przepływowi pojedynczych bakterii przylegających do komórek gospodarza
<ol>
	<li>Zaprogramuj zestaw pompy strzykawkowej tak, aby generował naprężenie ścinające w zakresie od 3 do 10 dynes/cm2 przez 5 minut.</li>
	<li>Po upływie 5 minut wykonaj akwizycję dziesięciu pól wybranych losowo zgodnie z opisem w kroku 3.1, jednak z zatrzymaniem przepływu przed rozpoczęciem akwizycji.</li>
	<li>Przeanalizuj pozyskane obrazy zgodnie z opisem w kroku 3.2 i określ średnią liczbę pozostałych bakterii na pole.</li>
</ol>
5. Pomiar wzrostu wyizolowanej bakterii przylegającej do mikrokolonii
<ol>
	<li>Wprowadź do komory medium Endo-SFM zawierające 10% (v/v) FBS, utrzymywane w temperaturze 37°C za pomocą grzewczej platformy, wykorzystując pompę strzykawkową z wybranym naprężeniem ścinającym przez kilka godzin. Rejestruj obrazy do wideomikroskopii w czasie rzeczywistym w odstępach 5 minut między klatkami.</li>
	<li>Po zakończeniu wideomikroskopii przerwij działanie naprężenia ścinającego, wyłączając pompę strzykawkową, wykonaj 2-3 dodatkowe zdjęcia, a następnie zatrzymaj sekwencję akwizycji obrazów w oprogramowaniu. Przykład proliferacji bakterii można zobaczyć na wideo 2.</li>
</ol>
6. Pomiar oporu przeciwko przepływowi przylegających mikrokolonii bakteryjnych
<ol>
	<li>Po utworzeniu się dużych mikrokolonii na powierzchni komórkowej (krok 5.2) należy wykonać 2-3 obrazy zarówno komórek (w kontraście fazowym), jak i bakterii (w fluorescencji GFP) przed zastosowaniem przepływu. W dalszej części eksperymentu protokół akwizycji będzie monitorował wyłącznie fluorescencję.</li>
	<li>Zastosować wysoki naprężenie ścinające przez 5 minut (3-10 dynes/cm2), rejestrując obrazy w odstępach 5 sekund na klatkę.</li>
	<li>Zatrzymać naprężenie ścinające poprzez wyłączenie pompy strzykawkowej, wykonać 2-3 dodatkowe obrazy, a następnie przerwać sekwencję akwizycji obrazów w oprogramowaniu.</li>
	<li>Następnie należy najpierw usunąć przewód wylotowy („exit”), czyniąc to ostrożnie, aby uniknąć opróżnienia kanału, a następnie dodać podgrzane świeże medium do wypełnienia studni przed usunięciem przewodu wlotowego („entry”).</li>
	<li>Aby ilościowo określić wpływ naprężenia ścinającego na oporność bakterii, można przeprowadzić test posiewowy w następujący sposób: zebrać pozostałe medium i dwukrotnie przemyć μ-Slide 120 μl PBS, co usunie pozostałe medium z kanału (oba płukany roztwory są również zbierane).</li>
	<li>Odczepić zainfekowane komórki po dodaniu 50 μl trypsyny/EDTA przez 5 minut w temperaturze 37° i zmieszać tę odczepioną próbkę z zawiesiną zebraną w poprzednim kroku.</li>
	<li>Wykonać rozcieńczenia seryjne w PBS i nanieść frakcję 10 μl na agarowe płytki GCB, w trzech powtórzeniach, aby następnego dnia określić liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) po inkubacji płytek w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% (v/v) CO2.</li>
</ol>
Filmy 3 i 4 porównują szczep typu dzikiego z mutantem pilV.
7. Odczepianie się bakterii z mikrokolonii
<ol>
	<li>Zainfekuj komórki w komorze przepływowej, powtarzając kroki od 2.1 do 2.8, i pozostaw je na 30 minut w celu przeprowadzenia infekcji.</li>
	<li>Usuń niezwiązane bakterie, zwiększając przepływ do 10 dynes/cm2 na okres 2 minut, a następnie pozwól infekcji trwać przez kolejne 2h.</li>
	<li>Zredukuj przepływ do 0,15 dynes/cm2.</li>
	<li>Co godzinę pobieraj kroplę medium wypływającego z komory przepływowej.</li>
	<li>Wykonaj rozcieńczenia seryjne próbek i wyseij je na płytki z agarem GCB.</li>
	<li>Następnego dnia określ liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) po inkubacji płytek w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% (v/v) CO2.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Proces tworzenia się biofilmu bakteryjnego; schemat przedstawiający etapy adhezji, proliferacji i odrywania się." src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Różne etapy tworzenia monowarstwy komórkowej, które można obserwować i pomiarować w obecności przepływu w ramach procedury.
<img alt="Struktura komórki w mikroskopii świetlnej; szczegóły komórkowe, obraz mikroskopowy, badania biologiczne." src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Monowarstwa komórek śródbłonka w komorze przepływowej na początku eksperymentu (brak naprężenia ścinającego). Około 50 komórek śródbłonka tworzy subkonfluentną monowarstwę.
<img alt="Wykres wzrostu bakterii w czasie; czas a liczba bakterii; analiza danych eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Graficzna reprezentacja początkowej adhezji bakterii na powierzchni komórkowej. Wskazano wartości dla trzech pól, aby zobrazować oczekiwaną zmienność między polami (0,04 dynes/cm2).
Wideo 1. Wizualizacja początkowej adhezji bakterii do monowarstwy komórkowej w funkcji czasu (0,044 dynes/cm2). Bakterie wykazujące ekspresję GFP poruszają się zgodnie z kierunkiem przepływu medium. Film został przyspieszony 60-krotnie, rzeczywisty czas trwania nagrania wynosi 10 minut. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.</a>
Wideo 2. Po wstępnej adhezji bakteriom pozwolono na proliferację na powierzchni komórkowej przez okres 7 godzin (przyspieszone 10-krotnie). 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.</a>
Wideo 3. Po proliferacji na powierzchni komórkowej przetestowano odporność mechaniczną mikrokolonii poprzez zwiększenie poziomu naprężenia ścinającego do 10 dynes/cm2 przez 5 minut, jednak mikrokolonie typu dzikiego wykazują 60-krotnie większą odporność. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.</a>
Wideo 4. Mikrokolonie utworzone przez mutant pilV ulegają rozbiciu pod wpływem zwiększenia przepływu (10 dyn/cm²)2). Mutant ten nie indukuje przebudowy błony plazmatycznej pod mikrokoloniami, przez co wykazuje większą wrażliwość na zwiększone naprężenie ścinające (wideo zostało przyspieszone 60-krotnie)5. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Vascular+Beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li>
<li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li>
<li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li>
<li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li>
<li>Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoyer%2C+M+%22Neisseria+meningitidis%3A+Methods+and+Protocols+%28Methods+in+Molecular+Biology%29%22">Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)</a>. Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li>
<li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Coraz częściej dostrzega się znaczenie naprężeń ścinających oraz ogólnie aspektów mechanicznych w biologii. Na przykład wysoce przystosowane właściwości adhezyjne białek z rodziny selektyn w procesie adhezji i toczenia się limfocytów po ścianie naczyniowej zostały rozpoznane poprzez wprowadzenie naprężeń ścinających do tego procesu. Opisana powyżej procedura została zastosowana w odniesieniu do bakterii Gram-ujemnych Neisseria meningitidis, lecz powinna być możliwa do zastosowania w szerokim zakresie patogenów. Znaczenie naprężeń ścinających wykazano również dla innych patogenów i innych miejsc zakażenia. Adhezja bakteryjna warunkowana naprężeniami ścinającymi została opisana w badaniu adhezyny FimH występującej u uropatogennych Escherichia coli (UPEC) 9. Podobnie jak w przypadku selektyn, wykazano, że oddziaływanie między FimH a receptorem komórki gospodarza jest wzmacniane przez indukowane ścinaniem siły mechaniczne 9, a doniesiono również, że adhezyna CfaE enterotoksygenej E.coli pośredniczy w adhezji do komórek nabłonka jelitowego poprzez mechanizm zależny od ścinania 10. Wykazaliśmy, stosując protokół badania w komorze przepływu laminarnego opisany w tym rozdziale, że pili Streptococcus agalactiae są niezbędne do przylegania tego patogenu do komórek nabłonkowych w warunkach przepływu 11. Takie badania potwierdzają, że nasz test z użyciem komory przepływu jest użytecznym narzędziem do badania oddziaływań między komórkami gospodarza a patogenami w warunkach naprężeń ścinających.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do przepływu &amp;mu;-Slide VI&lt;sup&gt;0.4&lt;/sup&gt;</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Plastipak 50 ml Luer-Lock</td><td>BD Biosciences</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>Przewód Tygon R3603 3.2 x 4.8mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>R3603</td><td></td></tr><tr><td>Kurek trójdrożny, 2 żeńskie luer do męskiego luer</td><td>Bio-Rad</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony, Nikon</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse T&lt;em&gt;i&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>ORCA 285 CCD lub ORCA 3-CCD</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>Oprogramowanie bezpłatne (&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;)</td><td></td></tr></tbody></table>

wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Podczas infekcji bakteryjnych dochodzi do sekwencji oddziaływań między patogenem a jego gospodarzem. Adhezja bakterii do powierzchni komórki gospodarza jest często początkowym i decydującym etapem patogenezy. Choć w badaniach eksperymentalnych adhezję analizuje się głównie w warunkach statycznych, w rzeczywistości zachodzi ona w obecności płynącego cieczy. Pierwsze spotkania bakterii z gospodarzem często następują na poziomie błon śluzowych: w jamie ustnej, płucach, jelitach, oczach itp., gdzie śluz przepływa wzdłuż powierzchni komórek nabłonkowych. W późniejszym stadium infekcji patogeny czasem przedostają się do krwiobiegu, wywołując zagrażające życiu schorzenia, takie jak sepsa, posocznica i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Cechą charakterystyczną tych infekcji jest zdolność patogenów do oddziaływania z komórkami śródbłonka w obecności krążącej krwi. Obecność płynącej cieczy, na przykład śluzu lub krwi, determinuje adhezję, ponieważ generuje ona siłę mechaniczną działającą na patogen. Aby scharakteryzować efekt płynącej cieczy, zazwyczaj odwołuje się do pojęcia naprężenia ścinającego, którym jest siła styczna wywierana na jednostkę powierzchni przez płyn poruszający się w pobliżu stacjonarnej ściany, wyrażona w dynes/cm2. Intensywność naprężenia ścinającego znacznie różni się w zależności od typu naczyń, ich wielkości, organu, lokalizacji itp. (0-100 dynes/cm2). Krążenie w naczyniach włosowatych może osiągać bardzo niskie wartości naprężenia ścinającego, a nawet tymczasowo ustawać w okresach trwających od kilku sekund do kilku minut 1. Z drugiej strony spektrum naprężenie ścinające w tętniczkach może osiągać 100 dynes/cm2 2. Wpływ naprężenia ścinającego na różne procesy biologiczne został wyraźnie wykazany, na przykład podczas oddziaływania leukocytów ze śródbłonkiem 3. Aby uwzględnić ten parametr mechaniczny w procesie adhezji bakteryjnej, wykorzystaliśmy procedurę eksperymentalną opartą na zastosowaniu jednorazowej komory przepływowej 4. Komórki gospodarza są hodowane w komorze przepływowej, a fluorescencyjne bakterie są wprowadzane do przepływu sterowanego za pomocą pompy strzykawkowej. Wstępnie skupiliśmy nasze badania na patogenie bakteryjnym Neisseria meningitidis, bakterii Gram-ujemnej odpowiedzialnej za posocznicę i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Opisana tutaj procedura pozwoliła nam zbadać wpływ naprężenia ścinającego na zdolność bakterii do: adhezji do komórek 1, proliferacji na powierzchni komórek 5 oraz odrywania się w celu kolonizacji nowych miejsc 6 (Rysunek 1). Uzupełniające informacje techniczne znajdują się w odniesieniu 7. Przedstawione tutaj wartości naprężenia ścinającego zostały dobrane w oparciu o nasze wcześniejsze doświadczenia1 oraz tak, aby reprezentowały wartości znalezione w literaturze. Protokół powinien być możliwy do zastosowania dla szerokiego zakresu patogenów, z odpowiednimi modyfikacjami w zależności od celów badania.

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Podczas infekcji bakteryjnych dochodzi do sekwencji oddziaływań między patogenem a gospodarzem. Adhezja bakterii do powierzchni komórki gospodarza jest często...

Niniejszy film prezentuje procedurę badania wpływu naprężeń ścinających na adhezję bakteryjną. Podczas ciężkiej infekcji patogenem bakteryjnym, takim jak Neisseria meningitidis, patogen przedostaje się do krwiobiegu, gdzie przyczepia się do komórek gospodarza i kolonizuje je, będąc poddanym mechanicznemu stresowi wynikającemu z przepływu krwi. Po proliferacji część bakterii odrywa się i kolonizuje nowe miejsca, co rozpoczyna cykl od nowa. Aby zbadać czynniki wpływające na adhezję bakterii do komórek gospodarza, komórki śródbłonka wprowadza się do jednorazowych komór przepływowych i inkubuje, aby pozwolić komórkom osiągnąć konfluencję.Dodaje się fluorescencyjne bakterie, a naprężenie ścinające jest kontrolowane eksperymentalnie. Za pomocą pompy strzykawkowej mikroskopowo śledzi się adhezję bakterii do komórek gospodarza oraz ich proliferację. Powstałe nagrania wideo są analizowane w celu określenia wpływu naprężenia ścinającego na proces kolonizacji śródbłonka.Niniejsza procedura może być bardzo przydatna w badaniu patogenezy zapalenia opon mózgowej wywoływanego przez szczepy bakterii, ale może być również zastosowana w przypadku innych bakterii poddawanych naprężeniom ścinającym w trakcie procesu patogenezy. Technika ta może być nieco trudna w wykonaniu, szczególnie w zakresie wprowadzania pęcherzyków powietrza do układu, co może stanowić problem. Dlatego dzisiejszą procedurę zaprezentuje Mega, doktorant pracujący w moim laboratorium.Opisane w tym filmie eksperymenty są przeprowadzane z wykorzystaniem komórek hodowanych w mikroprzesuwce IDI micro slide six 0.4, która składa się z jednorazowej, sterylnej plastikowej płytki zawierającej sześć kanałów o długości 17 mm i szerokości 3,8 mm oraz głębokości 0,4 mm. Każdy kanał posiada dwa porty dostępu z adapterami Luer, po jednym na każdym końcu, służące do wprowadzania komórek; do każdego z kanałów na płytce należy pipetować 30 µL zawiesiny komórkowej o stężeniu 1 × 10⁶ komórek. Następnie należy pozostawić komórki do przyczepienia na trzy godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżeniem i atmosferą 5% CO2.Po inkubacji należy dodać kolejne 120 mikrolitrów endo SFM. Aby wypełnić studzienki, komórki powinny utworzyć subkonfluentną warstwę monowarstwową po około 20 godzinach. W międzyczasie należy zasiać metodą kreskowania ekspresyjące GFP Neisseria meningitidis na APLs; bakteria ta jest patogenem ludzkim.W związku z tym wszelkie manipulacje z tym mikroorganizmem powinny być przeprowadzane w laboratorium o drugim poziomie bezpieczeństwa (BSL-2) przez przeszkolony personel w fartuchach i rękawiczkach; zaleca się szczepienie personelu przeciwko stosowanej grupie seryjnej. Oto szczep 8 0 1 3. Ekspresja GFP odbywa się pod kontrolą indukowalnego promotora IPDG w formie smug.Bakterie inkubowano na podłożach GC BPL z dodatkami Kellogg i 5 µg/mL chloramphenicolu w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO2 przez 16 godzin. Po ustabilizowaniu się kultur komórek ssaczych bakterie dodaje się do komórek gospodarza w kanale. W ramach przygotowania do analizy przepływowej, za pomocą pętli szczepielniczej, pobiera się bakterie z płytki Petriego i przenosi je do probówki stożkowej o pojemności 50 mL zawierającej uprzednio ogrzaną, suplementowaną pożywkę do hodowli komórek śródbłonka.Pożywka Endo SFM. Dostosuj gęstość optyczną do poziomu OD 600 wynoszącego 0,05 poprzez rozcieńczenie próbki w tej samej pożywce do końcowej objętości pięciu mililitrów. Aby indukowć ekspresję GFP, dodaj IPTG do końcowego stężenia jeden milimol i inkubuj kulturę przez 120 minut.W inkubatorze z nawilżaniem, w temperaturze 37 °C i 5% CO2, przy delikatnym wstrząsaniu. Umieścić mikroprzezierkę z wcześniej przygotowanymi hodowlanymi komórkami śródbłonka na stoliku mikroskopu odwróconego, wyposażonego w podgrzewaną platformę w celu utrzymania temperatury próbki na poziomie 37 °C. Nalać uprzednio ogrzane podłoże endo SFM uzupełnione o 2% FBS do sterylnego szklanego naczynia i napełnić strzykawkę 50 ml, ciągnąc za tłok.Przewód wlotowy jest połączony z trójdrożnym kurkiem. Następnie należy podłączyć przewód wlotowy do strzykawki i nacisnąć tłok, aby wypełnić przewód pożywką. Ostrożnie połącz drugi koniec przewodu wlotowego z mikroprzesuwnikiem, używając dołączonych złączy kątowych.Należy unikać wprowadzania powietrza do komory. Umieść strzykawkę na pompie, a następnie w dostępnym gnieździe kurka stopowego umieść odciętą strzykawkę o objętości 1 ml, która będzie służyć jako zbiornik. Następnie przymocuj rurkę wylotową do drugiego końca kanału i ostrożnie napełnij kanał medium, naciskając tłok strzykawki do momentu, aż medium znajdzie się w odległości około 1 cm od wylotu komory.Zmierz gęstość optyczną (OD 600) bakterii i dostosuj ją do wartości 0.15 w medium endo SFM zawierającym 2% FBS, tak jak wcześniej; intensywnie wymieszaj próbkę na wirówce typu vortex, aby rozbić agregaty bakteryjne. Następnie, używając jednorazowej plastikowej pipety Pasteura, przenieś 100 µL medium endo SFM uzupełnionego o 2% FBS do zbiornika. Po tym odessij 100 µL roztworu bakteryjnego z górnej warstwy wymieszanej próbki i dodaj do zbiornika.Ostrożnie przekręć kurek, a następnie wstrzyknij bakterie do komory mikropreparatu, aby umożliwić adhezję w warunkach kontrolowanego poziomu naprężenia ścinającego. Wprowadź do komory endo SFM zawierający 2% FBS za pomocą pompy strzykawkowej z prędkością 3,5 ml/h przez 15 minut. To wideo zostało przyspieszone 60-krotnie.Rzeczywisty czas trwania wynosi 10 minut. Po tym kroku można ocenić oraz opisać adhezję i odrywanie się bakterii od komórek gospodarza w różnych warunkach, co zostanie szczegółowo omówione w dalszych sekcjach filmu. Aby ilościowo określić początkową adhezję poszczególnych bakterii do komórek gospodarza, należy rozpocząć akwizycję obrazów po 15 minutach przepływu, podczas gdy ciecz wciąż krąży; należy wykonać zdjęcia 10 losowych pól, aby wyznaczyć średnią liczbę przytwierdzonych bakterii na obrazowane pole.Zacznij od uruchomienia programu ImageJ i otwórz obraz przeznaczony do analizy. Kliknij w menu obrazu i wybierz opcję dostosuj jasność i kontrast.Zoptymalizuj wizualizację poszczególnych przylegających bakterii fluorescencyjnych na tle, dostosowując poziomy intensywności poprzez przesuwanie kursora. Następnie w wtyczce przejdź do menu analizy licznika komórek (cell counter). Otwórz narzędzie licznika komórek, zainicjuj obraz, wybierz typ obiektu i kliknij na każdą poszczególną bakterię.W oknie pojawia się całkowita liczba bakterii. Na koniec wyeksportuj dane dla każdego obrazu do programu Excel i oblicz średnią, aby określić średnią liczbę bakterii przylegających na pole widzenia w celu zmierzenia odporności poszczególnych przylegających bakterii na przepływ. Po początkowych 15 minutach programu przepływu, pompa strzykawkowa została ustawiona tak, aby generować naprężenie ścinające w zakresie od 3 do 100 dyn/cm² przez pięć minut.Po upływie pięciu minut należy zatrzymać przepływ, a następnie pozyskać i przeanalizować 10 losowych pól, tak jak wcześniej, aby wyznaczyć średnią liczbę pozostałych bakterii na pole. Po wstępnych 15 minutach przepływu należy ustawić pompę strzykawkową na wybrane naprężenie ścinające. Następnie należy kontynuować przepływ przez kilka godzin, rejestrując obrazy w częstotliwości jednej klatki co pięć minut.W idealnym przypadku, jeśli mikroskop jest wyposażony w zmotoryzowaną platformę XY, można śledzić kilka pozycji. Po zakończeniu mikroskopii wideo należy przerwać przykładanie naprężenia ścinającego, wyłączając pompę strzykawkową. Należy niezwłocznie zarejestrować dwa lub trzy dodatkowe obrazy, a następnie zatrzymać sekwencję akwizycji obrazów w oprogramowaniu.Przykład proliferacji bakteryjnej przedstawiono tutaj. Na koniec, w celu analizy obrazów, należy użyć menu „Image Adjust Threshold” w programie ImageJ, aby przekształcić obrazy w format binarny. Następnie w menu „Analyze”, w sekcji „Set Measurements”, należy wybrać pomiar pola powierzchni.Następnie należy użyć narzędzia analyze particle, aby automatycznie określić rozmiar kolonii. Duże mikrokolonie tworzą się na powierzchni komórkowej po pięciu do siedmiu godzinach, niezależnie od tego, czy w tym momencie utrzymywany jest przepływ. Aby zmierzyć odporność mikrokolonii na przepływ, należy najpierw pozyskać dwa lub trzy obrazy obu komórek w kontraście fazowym oraz bakterii w fluorescencji GFP.Stosuj wysokie naprężenie ścinające przez pięć minut, wykonując obrazy fluorescencyjne w tempie jednej klatki co pięć sekund. Przerwij przyłożenie naprężenia ścinającego, wyłączając pompę strzykawkową. Pozyskaj od dwóch do trzech dodatkowych obrazów, a następnie zatrzymaj sekwencję akwizycji obrazu w oprogramowaniu, aby pobrać pożywkę do testu wysiewania.W pierwszej kolejności należy usunąć rurkę wylotową, uważając, aby nie opróżnić kanału. Następnie należy dodać podgrzane świeże medium, aby wypełnić dołki. Po tym usuwamy rurkę wlotową, a pozostałe medium zbieramy za pomocą mikropipety i przenosimy do probówki do mikrocentryfugi. Aby usunąć resztki medium z kanału, należy dwukrotnie przepłukać mikroprzesuwnik, dodając do kanału 120 µL PBS.Dwa razy przechylamy szkiełko i odlewamy medium. Aby zebrać zainfekowane komórki, do mikroszkiełka dodajemy 50 µL trypsyny z EDTA i inkubujemy przez pięć minut w temperaturze 37 °C, aby odspoić je od kanału, a następnie mieszamy tę odspojoną próbkę z zawiesiną zebraną w poprzednim kroku. Po wykonaniu rozcieńczeń szeregowych w PBS, nanosimy frakcje o objętości 10 µL na płytki agarowe GCB i inkubujemy w trzech powtórzeniach w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez noc.Następnego dnia wyznacz liczbę jednostek tworzących kolonie, aby ocenić odrywanie się bakterii z mikrokolonii. Zainfekuj komórki w komorze przepływowej w taki sam sposób jak wcześniej, przy niskim przepływie 3,5 ml/h; po 30 minutach usuń nieprzywiązane bakterie, zwiększając przepływ do 5 ml/min przez dwie minuty, a następnie wróć do niskiego przepływu 3,5 ml/h i pozwól infekcji kontynuować się przez dwie godziny. Następnie przez cztery godziny, co godzinę, zbieraj kroplę pożywki wypływającej z komory przepływowej do probówki do mikrowirówki.Po zebraniu wszystkich próbek należy określić liczbę jednostek tworzących kolonie w sposób opisany wcześniej. Jest to graficzna reprezentacja początkowej adhezji bakterii do powierzchni komórkowej. Każda linia na wykresie przedstawia skumulowaną liczbę bakterii związanych w danym polu w funkcji czasu.Wartości dla trzech pól zostały wskazane, aby zobrazować oczekiwaną zmienność między polami po proliferacji na powierzchni komórkowej. Odporność mechaniczną mikrokolon testowano poprzez zwiększenie poziomu naprężenia ścinającego do 10 dyn na centymetr kwadratowy; podczas gdy mikrokolonie typu dzikiego są odporne, mikrokolonie utworzone przez mutant pill v ulegają rozbiciu pod wpływem zwiększonego przepływu. Mutant ten nie indukuje przebudowy błony plazmatycznej pod mikrokoloniami, przez co po ich rozwoju wykazuje większą wrażliwość na zwiększone naprężenie ścinające.Technika ta utorowała drogę innym badaczom z dziedziny chorób zakaźnych do eksploracji wpływu naprężeń ścinających na interakcje różnych patogenów z różnymi typami komórek. Należy pamiętać, że praca z ludzkimi patogenami może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze powinny być przestrzegane odpowiednie środki ostrożności, takie jak środki bezpieczeństwa poziomu drugiego lub trzeciego.

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentujący naprężenia ścinające w badaniach nad adhezą bakteryjną

Źródło: Ditkowski, B. i in. Model in vitro systemu perfuzji z równoległymi płytkami do badania przyczepności bakterii do tkanek przeszczepów. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje metodę wykorzystania komory przepływu z równoległymi płytami do perfuzji bakterii znakowanych fluorescencją na tkankach przeszczepów naczyń, umożliwiając kontrolowaną analizę adhezji bakteryjnej i wczesnej patogenezy w warunkach przepływu ścinającego.

Model przepływu równoległego z płytkami in vitro do badania przyczepności bakteryjnej na biopsji tkanki

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Aby zbadać interakcję bakterii z naczyniami krwionośnymi pod wpływem naprężeń ścinających, opisano komorę przepływową oraz model mikroskopii przyżyciowej in vivo, które pozwalają na analizę czynników bakteryjnych i gospodarza przyczyniających się do adhezji naczyniowej.

Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Zrosty powierzchniowe komórek są kluczowe w mechanotransdukcji, ponieważ przenoszą napięcie mechaniczne i inicjują szlaki sygnałowe zaangażowane w homeostazę i rozwój tkanek. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparowania szlaków biochemicznych, które są aktywowane w odpowiedzi na napięcie, przy użyciu mikrokulek magnetycznych pokrytych ligandem i przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych.

Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Tutaj opisujemy użycie wysokoprzepustowego bioreaktora mikroprzepływowego połączonego z mikroskopem fluorescencyjnym do analizy wpływu naprężeń ścinających na biofilmy Pseudomonas aeruginosa wyrażające białka zielonej fluorescencji, w tym ustawienie instrumentu, określenie pokrycia biofilmu, tempa wzrostu i właściwości morfologicznych.

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

Ta metoda jest przydatna do ilościowego określania wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na fibronektynie. Ponadto test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu zmienionej homeostazy redoks na rozprzestrzenianie się komórek i/lub wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe związane z adhezją komórek.

Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Poznaj metodę badania adhezji bakteryjnej pod wpływem naprężeń ścinających przy użyciu komór komor przepływowych i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala ilościowo ocenić kolonizację bakterii Neisseria meningitidis na komórkach endotelialnych.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Przeglądaj więcej filmów