Wprowadzenie naprężeń ścinających w badaniu adhezji bakteryjnej

Ten film przedstawia procedurę badania wpływu zwykłego stresu na adhezję bakterii. Podczas ciężkiej infekcji patogenem bakteryjnym, takim jak Nice sirium mens, patogen dociera tam do krwiobiegu, przyłącza się i kolonizuje komórki gospodarza, podczas gdy pod wpływem stresu mechanicznego spowodowanego przepływającą krwią po proliferacji, niektóre bakterie odrywają się i kolonizują nowe miejsca, a cykl rozpoczyna się od nowa, aby zbadać czynniki wpływające na adhezję bakterii do komórek gospodarza. Komórki śródbłonka są wprowadzane do jednorazowych komór przepływowych i hodowli, aby umożliwić komórkom osiągnięcie zbieżności.

Dodaje się bakterie fluorescencyjne i eksperymentalnie kontroluje się czysty stres. Za pomocą pompy strzykawkowej adhezja bakterii do komórek gospodarza i proliferacja są śledzone pod mikroskopem. Powstałe filmy są analizowane w celu określenia wpływu naprężeń ścinających na proces kolonizacji śródbłonka.

Ta procedura może być bardzo przydatna do badania patogenezy zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, ale może być również stosowana w przypadku innych bakterii, które są poddawane stresowi ścinającemu w całym procesie patogenezy. Ta technika może być nieco trudna do wykonania, szczególnie jeśli chodzi o wprowadzanie bąbelków do systemu, co może stanowić problem. Tak więc dzisiaj demonstracja procedury będzie mega, doktorantka pracująca w moim laboratorium.

Eksperymenty opisane w tym filmie są przeprowadzane przy użyciu komórek hodowanych w mikroszkiełku IDI 6 0,4 składającym się z jednorazowego sterylnego plastikowego szkiełka zawierającego sześć kanałów o długości 17 milimetrów i szerokości 3,8 milimetra o głębokości 0,4 milimetra. Każdy kanał ma dwa porty dostępowe z adapterami przynęty, po jednym na każdym końcu, aby wprowadzić komórki uve, pipetę 30 mikrolitrów jednorazowo 10 do zawiesiny sześciu komórek do każdego z kanałów. Na szkiełku pozwól komórkom przylegać przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni i w nawilżonym inkubatorze z atmosferą 5% CO2.

Po inkubacji dodaj dodatkowe 120 mikrolitrów endo SFM. Aby wypełnić studzienki, komórki powinny po około 20 godzinach utworzyć sub konfluentną monowarstwę. W międzyczasie smuga GFP wyrażająca przyjemne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych sirium na APL, bakteria jest ludzkim patogenem.

W związku z tym wszelkie manipulacje tym mikroorganizmem powinny być przeprowadzane w obiekcie o zabezpieczeniu drugiego poziomu z przeszkolonym personelem noszącym fartuch i rękawiczki, zaleca się szczepienie personelu przeciwko zastosowanej grupie serologicznej. Oto szczep 8 0 1 3. Ekspresja GFP jest hodowana pod kontrolą indukowanego przez IPDG pasma promotorów.

Bakterie na GC BPL zawierające suplementy Kellogga i pięć mikrogramów na mililitr chloramfenikolu w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 16 godzin. Po ustaleniu kultur komórkowych ssaków bakterie są dodawane do komórek gospodarza w kanale. Przygotowując się do testu przepływowego, za pomocą pętli zaszczepiającej, zbierz bakterie z szalki Petriego, przenieś je do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej wstępnie podgrzaną, uzupełnioną hodowlę komórek śródbłonka.

Średnie Endo SFM. Dostosuj gęstość optyczną do OD 600 0,05, rozcieńczając próbkę w tym samym podłożu do końcowej objętości pięciu mililitrów. Aby wywołać ekspresję GFP, należy dodać IPTG do końcowego stężenia jednego milimola i inkubować kulturę przez 120 minut.

W nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% CO2 z delikatnym potrząsaniem. Umieścić mikroszkiełko z wyhodowanymi wcześniej komórkami śródbłonka na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w podgrzewaną platformę, aby utrzymać temperaturę próbki na poziomie 37 stopni Celsjusza. Wlej wstępnie ciepłe endo SFM uzupełnione 2% FBS do sterylnego szklanego głośnika i napełnij 50-mililitrową strzykawkę, pociągając za tłok.

Rurka wejściowa jest podłączona do trójdrogowego kurka odcinającego. Następnie podłączyć rurkę wejściową do strzykawki i nacisnąć tłok, aby napełnić rurkę medium. Ostrożnie podłącz drugi koniec rurki wejściowej do mikroprowadnicy za pomocą dostarczonych łączników kątowych.

Unikaj wprowadzania powietrza do komory. Umieść strzykawkę na pompie, a następnie umieść pokrojoną strzykawkę o pojemności jednego mililitra w dostępnej szczelinie na kurku odcinającym jako zbiornik. Następnie przymocuj rurkę wylotową do drugiego końca kanału i ostrożnie napełnij kanał medium, naciskając tłok strzykawki na odległość około jednego centymetra od wyjścia komory.

Zmierz bakteryjny OD 600 i dostosuj do 0,15 i endo SFM zawierającego 2% FBS, jak poprzednio, energicznie wiruj próbkę, aby rozbić agregaty bakteryjne. Następnie za pomocą jednorazowej plastikowej pipety pastwiskowej przenieś 100 mikrolitrów endos fm, uzupełnionego 2% pożywką FBS do zbiornika. Następnie odessać 100 mikrolitrów roztworu bakteryjnego od góry roztworu wirowego i dodać go do zbiornika.

Ostrożnie przekręć kurek, wstrzyknij bakterie do komory mikroszkiełka, aby umożliwić postęp adhezji w obecności kontrolowanego poziomu naprężeń lemiesza. Wprowadzić endo SFM zawierające 2%FBS do komory za pomocą pompy strzykawkowej w ilości 3,5 mililitra na godzinę przez 15 minut. Ten film jest przyspieszany 60 razy.

Rzeczywisty czas trwania to 10 minut. Po tym kroku można ocenić przyleganie i odklejanie się bakterii do komórek gospodarza w różnych warunkach, a także opisać je w kolejnych sekcjach filmu. Aby określić ilościowo początkową adhezję poszczególnych bakterii do komórek gospodarza, rozpocznij pozyskiwanie obrazów po 15 minutach przepływu, gdy ciecz nadal krąży, uzyskaj obrazy 10 losowych pól, aby określić średnią liczbę przylegających bakterii na obrazowane pole.

Zacznij od otwarcia oprogramowania do robienia zdjęć i otwórz obraz, który chcesz przeanalizować. Zacznij od kliknięcia menu obrazu i wybrania. Dostosuj kontrast jasności.

Zoptymalizuj wizualizację poszczególnych przylegających bakterii fluorescencyjnych na tle, dostosowując poziomy intensywności poprzez przesuwanie kursora. Następnie we wtyczce przeanalizuj menu licznika komórek. Otwórz narzędzie licznika komórek, zainicjuj obraz, wybierz obiekt, wpisz i kliknij każdą pojedynczą bakterię.

W oknie pojawi się całkowita liczba bakterii. Na koniec wyeksportuj dane dla każdego obrazu, aby uzyskać wyniki i uśrednić, aby określić ilościowo średnią liczbę przylegających bakterii na pole, aby zmierzyć odporność poszczególnych przylegających bakterii na przepływ. Po początkowych 15 minutach programu przepływu, pompa strzykawkowa ustawia się tak, aby generować naprężenia ścinające w zakresie od trzech do 100 centów na centymetr kwadratowy przez pięć minut.

Pod koniec pięciu minut zatrzymaj przepływ i pobierz i przeanalizuj 10 losowych pól, tak jak poprzednio, aby określić średnią liczbę pozostałych bakterii na polu. Po początkowych 15 minutach przepływu wyreguluj pompę strzykawkową do wybranego naprężenia ścinającego. Pozwól mu płynąć przez kilka godzin, rejestrując obrazy z szybkością jednej klatki co pięć minut.

Idealnie byłoby, gdyby mikroskop był wyposażony w zmotoryzowaną platformę XY, można było śledzić kilka pozycji. Po mikroskopii wideo zatrzymaj czysty stres, wyłączając pompę strzykawkową. Natychmiast uzyskaj dwa lub trzy dodatkowe obrazy, a następnie zatrzymaj sekwencję akwizycji obrazu w oprogramowaniu.

Przykład namnażania się bakterii można zobaczyć tutaj. Na koniec, aby przeanalizować obrazy, użyj menu progu regulacji obrazu J, aby przekonwertować obrazy na binarne. Następnie w menu analizy w obszarze ustaw pomiar wybierz pomiar obszaru.

Następnie użyj narzędzia do analizy cząstek, aby automatycznie określić rozmiar kolonii. Duże mikrokolonie tworzą się na powierzchni komórki po pięciu do siedmiu godzinach, niezależnie od tego, czy przepływ jest w tym momencie utrzymany, czy nie. Aby najpierw zmierzyć odporność mikrokolonii na przepływ, należy uzyskać dwa do trzech obrazów obu komórek za pomocą kontrastu fazowego, a bakterii za pomocą fluorescencji GFP.

Stosuj duże naprężenia ścinające przez pięć minut i wykonuj obrazy fluorescencyjne w jednej klatce co pięć sekund. Zatrzymaj naprężenie ścinające, wyłączając pompę strzykawkową. Uzyskaj dwa lub trzy dodatkowe obrazy, a następnie zatrzymaj sekwencję akwizycji obrazu w oprogramowaniu obok, aby zebrać pożywkę do testu posiewu.

Najpierw wyjmij rurkę wyjściową, uważając, aby nie opróżnić kanału. Dodaj podgrzane świeże podłoże, aby napełnić dołki. Następnie wyjmij rurkę wejściową i zbierz pozostałą pożywkę za pomocą mikropipety i przenieś do mikroprobówki wirówkowej Aby usunąć pozostałą pożywkę z kanału, przepłucz mikroszkiełko dwukrotnie, dodając 120 mikrolitrów do PBS do kanału.

Dwukrotne przechylenie suwaka i wyrzucenie medium. Aby zebrać zainfekowane komórki, dodaj 50 mikrolitrów tripsin EDTA do mikroszkiełka i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni, aby odłączyć je od kanału i wymieszać tę oderwaną próbkę z zawiesiną zebraną w poprzednim kroku. Po wykonaniu seryjnego rozcieńczania na płytce PBS 10 mikrolitrowych frakcji na płytkach rolniczych GCB i trzykrotnym inkubowaniu w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5%CO2 przez noc.

Następnego dnia określ liczbę jednostek tworzących kolonie, aby ocenić oderwanie się bakterii od mikrokolonii. Zainfekuj komórki w komorze przepływowej jak poprzednio przy niskim przepływie 3,5 mililitra na godzinę po 30 minutach, usuń niezwiązane bakterie, zwiększając przepływ do pięciu mililitrów na minutę przez okres dwóch minut, a następnie wróć do niskiego przepływu 3,5 mililitra na godzinę i pozwól infekcji trwać przez dwie godziny. Następnie co godzinę zbieraj kroplę pożywki wychodzącą z komory przepływowej w mikroprobówce wirówkowej przez cztery godziny.

Po pobraniu wszystkich próbek określ liczbę jednostek tworzących kolonię, tak jak poprzednio. Jest to graficzne przedstawienie początkowej adhezji bakterii do powierzchni komórki. Każda linia na wykresie reprezentuje skumulowaną liczbę bakterii związanych w danym polu w funkcji czasu.

Wartości dla trzech pól są wskazane, aby dać wyobrażenie o zmienności między polami, która jest oczekiwana po proliferacji na powierzchni komórki. Odporność mechaniczna mikrokolonii została przetestowana poprzez zwiększenie poziomu naprężeń ścinających do 10 dinów na centymetr kwadratowy, ale podczas gdy mikrokolonie typu są odporne, mikrokolonie utworzone przez mutanta pigułki v są zakłócane przez wzrost przepływu. Ten mutant nie indukuje przebudowy błony plazmatycznej pod mikrokoloniami i dlatego jest bardziej wrażliwy na wzrost naprężeń ścinających po jego rozwoju.

Technika ta utorowała drogę innym badaczom zajmującym się chorobami zakaźnymi do zbadania wpływu naprężeń ścinających na interakcję różnych patogenów z różnymi typami komórek. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi patogenami może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak poziom drugi lub trzeci.