Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie bioluminescencyjne z podwójnym podłożem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego z podwójnym podłożem do wizualizacji i ilościowego oznaczania aktywności lucyferaz w komórkach raka piersi in vivo. Technika umożliwia dynamiczną, długoterminową obserwację regulacji genów podczas wzrostu guza i przerzutów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

W.P.S. otrzymał częściowe wsparcie z grantów National Institutes of Health (CA129359), Susan G. Komen for the Cure Foundation (BCTR0706967), Departamentu Obrony (BC084561) oraz Seidman Cancer Center, natomiast M.K.W. otrzymał wsparcie w ramach stypendium z American Cancer Society (PF-09-120-01). Dodatkowe wsparcie dla niniejszej pracy zapewniły Case Center for Imaging Research, Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703) oraz Cystic Fibrosis Center (P30 DK027651).

1. Stabilna ekspresja lucyferazy Renilla pod promotorem CMV
<ol>
	<li>Transfekcja i selekcja stabilnej populacji klonalnej jest preferowaną metodą ekspresji tego reportera lucyferazy renilla. Podejście to zapewnia bardziej spójną i jednolitą ekspresję lucyferazy renilla po późniejszym wprowadzeniu dodatkowych wtórnych konstruktów reporterowych (np. lucyferazy świetlika lub białek fluorescencyjnych).</li>
	<li>Przetransfekuj interesujące badanie komórki nowotworowe wektorem ekspresyjnym kodującym lucyferazę renilla, takim jak pcDNA3.1-Hygro lub innym plazmidem zawierającym marker selekcyjny.</li>
	<li>Po transfekcji poddaj transfektanty optymalnemu stężeniu antybiotyku przez kilka dni lub tygodni, aby ułatwić izolację pojedynczych kolonii, które następnie są izolowane indywidualnie i poddawane pasażowaniu.</li>
	<li>Wyselekcjonuj ≥10 pojedynczych kolonii wykazujących ekspresję lucyferazy renilla, aby monitorować stopień tej ekspresji.</li>
	<li>Kolonie wykazujące wysoką ilość lucyferazy renilla są następnie poddawane analizom funkcjonalnym, aby upewnić się, że (i) zachowane zostały właściwości patofizjologiczne ich odpowiedników rodzicielskich oraz (ii) wartości ekspresji renilla nie wykazują odchyleń ani nie zmieniają się w czasie. Kroki te są absolutnie niezbędne, aby uniknąć izolacji i badania wariantów/dewiantów klonalnych oraz aby potwierdzić prawidłową integrację konstruktu renilla z genomem.</li>
	<li>Po wyizolowaniu i zweryfikowaniu stabilnego transfektanta można usunąć presję selekcyjną, mając pewność, że ekspresja lucyferazy renilla pozostanie stała przez dłuższy czas zarówno in vitro, jak i in vivo.</li>
</ol>
2. Ekspresja, selekcja i weryfikacja funkcjonalna lucyferazy świetlika sterowanej przez promotor indukowalny
<ol>
	<li>Subklonuj badany promotor do plazmidu reporterowego pGL4-luciferase zawierającego marker selekcyjny (np. puromycynę), który różni się od markera użytego do selekcji stabilnej ekspresji lucyferazy renilla (np. hygromycyny).</li>
	<li>Wykonaj transfekcję komórek nowotworowych zgodnie z Krokiem I, a następnie dokonaj selekcji stabilnej poliklonalnej populacji komórek wykazujących ekspresję lucyferazy świetlikowej. Ponieważ miejsce integracji genu reporterowego w genomie może wywoływać błędne efekty w zakresie jego ekspresji i regulacji, zdecydowanie zaleca się selekcję poliklonalnych populacji komórek wykazujących ekspresję lucyferazy świetlikowej zamiast populacji klonalnych, aby zapewnić, że (i) ekspresja genu reporterowego dokładniej odzwierciedla ekspresję genu endogennego w komórkach rodzicielskich oraz (ii) efekty integracji wpływające na ekspresję genów zostaną uśrednione i zminimalizowane w heterogenicznej populacji komórek.</li>
	<li>Komórki nowotworowe zmodyfikowane w celu stabilnej ekspresji zarówno lucyferazy renilla, jak i świetlikowej, określa się zbiorczo jako podwójne komórki reporterowe bioluminescencyjne lub komórki DBR.</li>
	<li>Wykorzystując tradycyjne in vitro testy reporterowe lucyferazy w komórkach, zweryfikuj, czy komórki DBR regulują ekspresję lucyferazy świetlikowej, dodatnio lub ujemnie, w sposób zgodny z tym zaobserwowanym w komórkach rodzicielskich przejściowo transfekowanych tymi wektorami. Podobnie zweryfikuj, czy ekspresja lucyferazy renilla pod kontrolą promotora CMV nie jest regulowana przez różne stymulacje komórkowe lub warunki traktowania.</li>
	<li>W tym celu hoduj komórki DBR oraz komórki rodzicielskie na płytkach 24-dołkowych, a następnie wykonaj przejściową kotransfekcję komórek rodzicielskich oryginalnymi konstruktami CMV-renilla i promoter-firefly, które zostały użyte do wytworzenia komórek DBR.</li>
	<li>Następnie potraktuj komórki DBR i transfekowane komórki rodzicielskie czynnikami lub środkami farmakologicznymi znanymi z regulacji badanego promotora, a następnie zmierz luminescencję lucyferazy świetlikowej i renilla, korzystając z zestawu Promega Dual Luciferase Assay Kit.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie pierwotnych guzów piersi 4T1
<ol>
	<li>Komórki przerzutowego raka piersi 4T1, w których stwierdzono brak przywspółistniejących patogenów gryzoni, zostały zmodyfikowane w celu stabilnej ekspresji lucyferazy renilla pod promotorem CMV (pcDNA3.1-CMV-renilla luciferase-hygro) oraz lucyferazy świetlikowej pod promotorem SBE (pGL4.2-SBE-firefly luciferase-puro), zgodnie z powyższym opisem. Ortotopowe przeszczepienie tych komórek raka piersi prowadzi do powstania spontanicznych przerzutów, głównie w płucach.</li>
	<li>Podczas namnażania komórek 4T1 w tradycyjnych dwuwymiarowych systemach hodowli tkankowych nie należy dopuścić do osiągnięcia przez nie konfluencji; należy je pasażować w dniu poprzedzającym inokulację in vivo.</li>
	<li>Komórki 4T1 należy rozdzielić poprzez trypsynizację, dokładnie wypłukać w pożywce wzrostowej, a następnie rozcieńczyć w PBS do stężenia 2x105 komórek/ml i niezwłocznie przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Samice myszy Balb/C (w wieku 4-6 tygodni) należy znieczulić dawką indukcyjną 3% izofluranu i utrzymywać w znieczuleniu przy dawce 1% izofluranu. Miejsce wstrzyknięcia należy przygotować, przecierając je 70% alkoholem izopropylowym. Używając pęsety, należy delikatnie chwycić i unieść czwarty gruczał piersiowy pachwinowy. Ostrożnie wprowadzić igłę o rozmiarze 27,5 G ściętym końcem do góry i wstrzyknąć w tkankę tłuszczową gruczołu piersiowego bezpośrednio pod brodawką, dbając szczególnie o to, aby nie wprowadzić igły do jamy brzusznej. Puścić gruczoł i powoli wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej (1x104 komórek) do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego.</li>
</ol>
4. Wstępne obrazowanie podwójnie luminescencyjne
<ol>
	<li>Bezpośrednio po wszczepieniu komórek 4T1 do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego, gdy myszy nadal znajdują się pod wpływem znieczulenia, wstrzyknąć 100 μl RediJect Coelenterazine do bocznej żyły ogonowej. Jest to optymalne stężenie substratu zalecane przez dostawcę i najlepiej tolerowane przez zwierzę.</li>
	<li>Natychmiast umieść mysz w stożku nosowym z izofluranem w systemie obrazowania IVIS-20 i wykonaj obraz luminescencyjny trwający od 0,5 do 1 minuty. Szybkość działania pomiędzy wstrzyknięciem a akwizycją obrazu jest bardzo istotna, ponieważ sygnał lucyferazy renilla gwałtownie spada około 30 sekund po wstrzyknięciu. Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól jej dojść do siebie przez ≥1 godzinę, co zapewni rozproszenie pozostałego sygnału lucyferazy renilla oraz pełne wybudzenie myszy z anestezji.</li>
	<li>Podać 150 mg/kg soli potasowej D-lucyferyny poprzez Wykonać wstrzyknięcie d.o.m. (dos brzuszny) i odczekać 5 minut. Jest to optymalne stężenie D-lucyferyny, które zapewnia stabilny sygnał luminescencyjny przez 5–15 minut po wstrzyknięciu do zwierząt badawczych. Zanestezjować mysz izofluranem i umieścić ponownie w urządzeniu IVIS-20, dbając o to, aby zwierzę znajdowało się w pozycji bardzo zbliżonej do pozycji podczas pierwotnej akwizycji sygnału renilli. Całkowita intensywność sygnału świetlika będzie zależeć od aktywności badanego promotora, w związku z czym wizualizacja aktywności lucyferazy świetlika może wymagać dłuższego czasu akwizycji.</li>
	<li>Używając oprogramowania IVIS Living Image w trybie „photons”, należy wyznaczyć wartości dla akwizycji renilla oraz firefly w celu ustalenia bazowych względnych stosunków luminescencji (RLR).</li>
</ol>
5. Podłużne obrazowanie luminescencyjne
<ol>
	<li>Komórki 4T1 są wysoce agresywne, przez co inokulacja 1x104 komórek zazwyczaj prowadzi do powstania wyczuwalnego guza w ciągu 1 tygodnia oraz do śmierci zwierzęcia w ciągu 4-5 tygodni. Guzy 4T1 wykazują naturalną tendencję do owrzodzenia w 4. tygodniu. Wzrost i utrzymywanie owrzodziałych guzów może wymagać oddzielnej zgody IACUC. Przedstawione tutaj badania nad guzami 4T1 zostały zatwierdzone przez IACUC na Case Western Reserve University.</li>
	<li>Zgodnie z powyższym opisem, myszy powinny być co tydzień wstrzykiwane RediJect Coelenterazine w celu monitorowania ogólnego wzrostu guza i przerzutów, a także D-lucyferyną w celu monitorowania sygnalizacji specyficznej dla danej ścieżki w różnych etapach rozwoju guza. Należy każdorazowo zadbać o to, aby sygnał lucyferazy renilla całkowicie zanikł przed akwizycją sygnału lucyferazy świetlikowej.</li>
	<li>W miarę rozwoju i progresji guzów 4T1, akwizycje lucyferazy renilla powinny być normalizowane względem początkowych wartości renilla zmierzonych w momencie inokulacji komórek nowotworowych, aby znormalizować i śledzić wzrost guza pierwotnego. Co ważniejsze, obliczanie wartości RLR w czasie pozwoli ustalić regulację czasową poszczególnych systemów sygnalizacyjnych w odniesieniu do wzrostu i progresji guza.</li>
	<li>Jawne przerzuty do płuc stają się widoczne w ciągu 3-4 tygodni po wszczepieniu komórek 4T1 do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego. Porównanie wartości RLR w płucach w stosunku do wartości obliczonych dla guza pierwotnego pozwala ustalić regulację przestrzenną poszczególnych systemów sygnalizacyjnych w odniesieniu do wzrostu guza i przerzutów.</li>
</ol>
6. Podwójne obrazowanie bioluminescencyjne dwóch unikalnych typów komórek w jednym organizmie
<ol>
	<li>Zmodyfikuj jedną linię komórkową raka piersi w celu stabilnej ekspresji lucyferazy renilla pod promotorem CMV, zgodnie z powyższym opisem. Powtórz ten proces modyfikacji, wykorzystując lucyferazę świetlikową pod promotorem CMV w drugiej, odrębnej linii komórkowej raka piersi.</li>
	<li>W niniejszym badaniu zmieszano komórki 4T1 wykazujące ekspresję lucyferazy renilla z ich nieprzerzutowymi i izogenicznymi odpowiednikami 4T07 wykazującymi ekspresję lucyferazy świetlikowej 10, 1. Różne proporcje tych zmieszanych populacji komórek raka piersi są następnie wstrzykiwane do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Natychmiast wykonaj obrazy bioluminescencyjne dla lucyferazy świetlikowej i renilla, aby ustalić początkowe RLR reprezentatywne dla danej mieszaniny wszczepionych komórek.</li>
	<li>Podłużne obrazowanie dualne bioluminescencją pozwoli zwizualizować i śledzić zmiany w składzie komórkowym w obrębie guza pierwotnego, a także czasowo-przestrzenną przerzutowość każdej z pochodnych raka piersi w odniesieniu do wzrostu i progresji nowotworu.</li>
	<li>Alternatywnie, poszczególne populacje komórek raka piersi można wszczepić w różne miejsca u myszy ( np. do prawego i lewego podbrzusznego tłuszczu gruczołu piersiowego), aby ocenić wpływ systemowy, jaki te dwie populacje wywierają na siebie nawzajem podczas różnych etapów wzrostu guza i przerzutowania.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Główną zaletą podwójnego obrazowania bioluminescencyjnego jest fakt, że każdy obraz jest wewnętrznie spójny i kontrolowany, dzięki czemu utrzymujące się sygnały pochodzące z guza pierwotnego służą jako istotny miernik oceny ogólnego sukcesu lub niepowodzenia każdej akwizycji dla lucyferazy renilla oraz firefly. Ten aspekt procedury obrazowania jest szczególnie ważny podczas rejestrowania aktywności lucyferazy renilla, której substrat, coelenterazyna, jest wysoce wrażliwy na utlenianie, co prowadzi do zjawiska autoluminescencji. Rysunek 1A przedstawia przykład tego efektu ubocznego, który objawia się natychmiast jako niespecyficzne sygnały luminescencyjne pochodzące z przewodu pokarmowego, a nie z ustalonego guza pierwotnego. Zazwyczaj niespecyficzne sygnały coelenterazyny występują po nieudanych wtryskach dożylnych substratu lucyferazy renilla. Jednak po uzyskaniu silnych sygnałów renilla pochodzących z guza pierwotnego (Rysunek 1B, lewy obraz), można bezpiecznie przystąpić do pomiarów sygnalizacji specyficznej dla danej ścieżki uzyskanych z obrazowania lucyferazy firefly (Rysunek 1B, prawy panel), której substrat D-lucyferyna jest wysoce stabilny po wstrzyknięciu dojamowym i generuje pomijalne poziomy tła autoluminescencyjnego.
<img alt="Obrazowanie bioluminescencyjne: testy CMV-renilla i SBE-firefly, wykrywanie nowotworów, wykres analizy sygnału." src="/files/ftp_upload/3245/3245fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Pozyskiwanie obrazów bioluminescencyjnych pochodzących z renilli i świetlika w celu obliczenia in vivo RLRs. (A) Przykład nieudanej iniekcji dożylnej koelenterazyny, która doprowadziła do niespecyficznego sygnału z przewodu pokarmowego. Okrąg i PT wskazują przybliżoną lokalizację guza pierwotnego. (B) Udany obraz renilla myszy z guzem pierwotnym 4T1 i przerzutami do płuc (panel lewy; 4 tygodnie po wszczepieniu do tkanki tłuszczowej). Odpowiadający temu obraz firefly umożliwia obliczenie stosunków RLR dla guza pierwotnego oraz jego przerzutów do płuc. (C) Graficzna reprezentacja współczynników RLR guza pierwotnego i przerzutów do płuc obliczonych dla myszy przedstawionych na panelu B (n=4).

<ol><li>Wetterwald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cancer+metastasis+to+bone+marrow%3A+a+mouse+model+of+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cancer metastasis to bone marrow: a mouse model of minimal residual disease.</a> Am. J. Pathol. 160, 1143-1153 (2002).</li>
<li>Wendt, M. K., Drury, L. J., Vongsa, R. A., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+CXCL12+Expression+Induces+Anoikis+in+Colorectal+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Constitutive CXCL12 Expression Induces Anoikis in Colorectal Carcinoma Cells.</a> Gastroenterology. 135, 508-508 (2008).</li>
<li>Wendt, M., Schiemann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+the+focal+adhesion+complex+prevents+oncogenic+TGF-beta+signaling+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of the focal adhesion complex prevents oncogenic TGF-beta signaling and metastasis.</a> Breast Cancer Research. 11, R68-R68 (2009).</li>
<li>Korpal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transforming+growth+factor-beta+signaling+dynamics+and+therapeutic+response+in+breast+cancer+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging transforming growth factor-beta signaling dynamics and therapeutic response in breast cancer bone metastasis.</a> Nat Med. , (2009).</li>
<li>Giampieri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li>
<li>Giampieri, S., Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+illuminates+transforming+growth+factor+beta+signaling+switches+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging illuminates transforming growth factor beta signaling switches during metastasis.</a> Cancer Res. 70, 3435-3439 (2010).</li>
<li>DeNardo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+T+cells+regulate+pulmonary+metastasis+of+mammary+carcinomas+by+enhancing+protumor+properties+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enhancing protumor properties of macrophages.</a> Cancer Cell. 16, 91-102 (2009).</li>
<li>Wyckoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Paracrine+Loop+between+Tumor+Cells+and+Macrophages+Is+Required+for+Tumor+Cell+Migration+in+Mammary+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A Paracrine Loop between Tumor Cells and Macrophages Is Required for Tumor Cell Migration in Mammary Tumors.</a> Cancer Res. 64, 7022-7029 (2004).</li>
<li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139, 1315-1326 (2009).</li>
<li>Aslakson, C. J., Miller, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+events+in+the+metastatic+process+defined+by+analysis+of+the+sequential+dissemination+of+subpopulations+of+a+mouse+mammary+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor.</a> Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).</li>
<li>Wendt, M. K., Smith, J. A., Schiemann, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+facilitates+epidermal+growth+factor-dependent+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent breast cancer progression.</a> Oncogene. 29, 6485-6498 (2010).</li>
<li>Hawkins, E., Unch, J., Murhpy, N., Vidugiriene, J., Scurria, M., Klaubert, D., Wood, K. Bright Light, No Lysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+E+%22Measuring+Renilla+Luciferase+Luminescence+in+Living+Cells%22">Measuring Renilla Luciferase Luminescence in Living Cells</a>. , Promega. (2005).</li>
<li>Roncali, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+device+for+real-time+bioluminescence+imaging+in+moving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">New device for real-time bioluminescence imaging in moving rodents.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niezaprzeczalna siła technik obrazowania bioluminescencyjnego tkwi w ich zdolności do ilościowego określania wzrostu i przerzutowania nowotworów w złożonych badaniach podłużnych, które w niniejszym przypadku obejmowały wykorzystanie agresywnych komórek raka piersi 4T1. Ponieważ procedury te opierają się na stabilnej integracji obu konstruktów reporterowych lucyferazy, techniki te mogą być łatwo adaptowane i przeniesione na inne linie komórek nowotworowych o różnym czasie latencji i potencjale przerzutowym. Podobnie jak w wynikach przedstawionych w niniejszej pracy, obliczanie specyficznych RLR w wolno rozwijających się guzach pierwotnych i ich końcowych przerzutach umożliwia spatiotemporalną identyfikację w czasie rzeczywistym specyficznych zdarzeń sygnalizacyjnych, które zachodzą podczas progresji przerzutowej nowotworów, niezależnie od czasu ich latencji. Po zidentyfikowaniu specyficznych zdarzeń regulacyjnych promotora istotne jest wycięcie zarówno guza pierwotnego, jak i jego zmian przerzutowych w celu przeprowadzenia standardowych analiz immunohistochemicznych oraz analiz różnicowej ekspresji genów, aby zweryfikować podobną regulację endogennego genu i/lub białka.
Mówiąc ściśle, głównym wyzwaniem w podwójnych analizach bioluminescencyjnych jest stosunkowo krótki czas trwania sygnałów lucyferazy renilla. W związku z tym technika obrazowania ta wymaga znacznej optymalizacji procedury wstrzykiwania do żyły ogonowej, a także natychmiastowego obrazowania poszczególnych wstrzykniętych zwierząt, co jest procesem czasochłonnym i nieco mniej wydajnym w porównaniu z obrazowaniem lucyferazy świetlika. Niedawno firma Promega wprowadziła „Viviren”, który stanowi drugą generację substratu lucyferazy, w którym miejsca utleniania są zablokowane poprzez estryfikację do momentu wniknięcia cząsteczki do komórek, kiedy to ulega ona szybkiej deestryfikacji. Łącznie ten nowy substrat skutecznie obniża autoluminescencję oraz niespecyficzną modyfikację i/lub degradację powiązaną z autoluminescencją indukowaną przez renilla 12. Dzięki temu nowy substrat lucyferazy renilla generuje jaśniejsze sygnały luminescencyjne; jednak nadmierne koszty związane z nabyciem i stosowaniem „Viviren” sprawiły, że przeprowadzono stosunkowo niewiele badań niezbędnych do oceny ogólnej użyteczności tego substratu w podwójnych analizach bioluminescencyjnych. Wreszcie, czułość każdego testu bioluminescencyjnego jest krytycznie zależna od kamery CCD wykorzystywanej do rejestrowania pojedynczych jednostek światła. W istocie, wraz z udoskonalaniem tych technologii, przewidujemy moment w przyszłości, w którym nasza zdolność do wizualizacji złożonych, zapośredniczonych przez światło reakcji bioluminescencyjnych będzie mogła być efektywnie realizowana u zwierząt swobodnie poruszających się 13.

<table><tbody><tr><td>pGL4.2-Puro [&lt;em&gt;luc2&lt;/em&gt;Wektor [/Puro]</td><td>Promega Corp.</td><td>E6751</td><td></td></tr><tr><td>System wielowykrywalny Glomax</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seria IVIS 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System dwucyfrowego testu reporterowego lucyferazy</td><td>Promega Corp.</td><td>E1960</td><td></td></tr><tr><td>Rediject c&amp;#8211;lenterazyna-h</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>760506</td><td></td></tr><tr><td>Sól potasowa D-lucyferyny</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>122796</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Nasze rozumienie tego, jak i kiedy komórki raka piersi przechodzą z utrwalonych guzów pierwotnych do ognisk przerzutowych, wzrosło w wyjątkowym tempie od czasu pojawienia się technologii obrazowania bioluminescencyjnego in vivo 1-3. Rzeczywiście, możliwość lokalizacji i ilościowego określania wzrostu guza podłużnie w jednej kohorcie zwierząt aż do zakończenia badania, w przeciwieństwie do poświęcania poszczególnych grup zwierząt w określonych punktach czasowych analizy, zrewolucjonizowało sposób, w jaki badacze analizują przerzuty raka piersi. Niestety, obecne metodologie wykluczają ocenę w czasie rzeczywistym krytycznych zmian zachodzących w systemach sygnalizacji komórkowej, gdy komórki raka piersi (i) ewoluują w obrębie guzów pierwotnych, (ii) rozprzestrzeniają się po organizmie i (iii) ponownie inicjują programy proliferacyjne w miejscach powstania zmian przerzutowych. Jednakże niedawne postępy w obrazowaniu bioluminescencyjnym umożliwiają obecnie jednoczesne ilościowe określanie specyficznych zmian spatiotemporalnych w ekspresji genów w funkcji rozwoju guza i progresji przerzutowej poprzez zastosowanie reakcji luminescencyjnych z wykorzystaniem podwójnego substratu. W tym celu badacze wykorzystują dwa enzymy lucyferazy wytwarzające światło, wyizolowane ze świetlika (Photinus pyralis) i morskiego kwiatuszka (Renilla reniformis), z których oba reagują na wzajemnie wykluczające się substraty, co wcześniej ułatwiło ich szerokie zastosowanie w analizach genów reporterowych w układach komórkowych in vitro 4. Przedstawiamy tutaj użyteczność in vivo tych dwóch enzymów w taki sposób, że jedna reakcja luminescencyjna specyficznie oznacza rozmiar i lokalizację rozwijającego się guza, podczas gdy druga reakcja luminescencyjna służy jako sposób wizualizacji stanu aktywacji specyficznych systemów sygnalizacyjnych podczas odrębnych etapów rozwoju guza i przerzutów. Zatem cele niniejszego badania są dwukrotne. Po pierwsze, opiszemy kroki niezbędne do stworzenia podwójnych linii komórkowych reporterów bioluminescencyjnych, a także kroki potrzebne do ułatwienia ich zastosowania w wizualizacji regulacji spatiotemporalnej ekspresji genów podczas specyficznych etapów kaskady przerzutniczej. Wykorzystując model przerzutów raka piersi 4T1, wykazujemy, że aktywność in vivo syntetycznego promotora elementu wiążącego Smad (SBE) była znacznie zmniejszona w przerzutach płucnych w porównaniu z aktywnością mierzoną w guzie pierwotnym 4-6. Niedawno wykazano, że przerzuty raka piersi są regulowane przez zmiany w mikrośrodowisku guza pierwotnego i reaktywnym zrębie, w tym te zachodzące w fibroblastach i infiltrujących komórkach odpornościowych 7-9. W związku z tym naszym drugim celem będzie wykazanie użyteczności podwójnych technik bioluminescencyjnych w monitorowaniu wzrostu i lokalizacji dwóch unikalnych populacji komórek znajdujących się w jednym zwierzęciu podczas wzrostu i przerzutowania raka piersi.

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Nasze zrozumienie tego, w jaki sposób i kiedy komórki raka piersi przechodzą z utrwalonych guzów pierwotnych do miejsc przerzutowych, wzrosło w wyjątkowym tempie ...

Niniejsza procedura służy do wizualizacji i kwantyfikacji lucyferazy ran oraz lucyferazy świetlika. W celu opracowania guzów ortotopowych in vivo należy rozpocząć od stworzenia stabilnych linii komórkowych wykazujących ekspresję lucyferazy ran vanilla, lucyferazy świetlika lub obu tych enzymów. Następnie należy funkcjonalnie zweryfikować in vitro regulację stabilnie wyrażanego konstruktu reporterowego.Kolejnym krokiem jest przeszczepienie komórek do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego oraz pozyskanie i ilościowe określenie odczytów dla lucyferazy ran oraz świetlika. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia, jest umożliwienie podłużnej i dynamicznej obserwacji regulacji genów in vivo podczas progresji guza i przerzutowania. Należy rozpocząć od wyselekcjonowania czterech kultur komórek raka piersi T1 z wektorem ekspresyjnym kodującym lucyferazę vanilla.Inkubuj transfektanty w optymalnym stężeniu antybiotyku przez kilka dni. Następnie wybierz około 10 pojedynczych kolonii wykazujących ekspresję lucyferazy ran vanilla w celu monitorowania stopnia ekspresji. Kontynuuj namnażanie kolonii wykazujących wysoką ekspresję lucyferazy ran vanilla do analiz funkcjonalnych.Podklonuj interesujący region promotora do plazmidu reporterowego lucyferazy PGL 4 zawierającego marker selekcyjny inny niż ten użyty do selekcji stabilnej ekspresji waniliny, przetransfekuj komórki nowotworowe i wyselekcjonuj stabilną populację poliklonalną lucyferazy świetlika, wykorzystując tradycyjne in vitro testy reporterowe genu lucyferazy w płytkach 96-dołkowych; zweryfikuj, czy komórki DBR regulują ekspresję lucyferazy świetlika w sposób zgodny z obserwowanym w komórkach rodzicielskich poddanych transfekcji przejściowej. Z tymi wektorami umieść komórki na wytrząsarce orbitalnej na 15 minut w celu lizy komórek.Należy również zweryfikować, czy ekspresja vanilla napędzana przez CMV nie jest regulowana przez różne stymulacje komórkowe lub warunki traktowania. Dzień przed planowanym zabiegiem namnożyć komórki raka pamięci 41 DBR o niskiej fluorescencji współwyrażanej. Przed pasażem do inokulacji in vivo, zdysocjować komórki 41 za pomocą trypsyny.Dokładnie wypłukać w pożywce wzrostowej i natychmiast rozcieńczyć komórki w PBS. Przechowywać na lodzie. Znieczulić izofluranem samice myszy bowel C w wieku od czterech do sześciu tygodni.Używając pęsety, delikatnie chwyć i unieś czwartą poduszkę tłuszczową pachwinową. Ostrożnie wprowadź igłę o rozmiarze 27,5 G ściętym końcem do góry i wykonaj wstrzyknięcie do poduszki tłuszczowej bezpośrednio pod sutkiem.Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie wprowadzić igły do jamy brzusznej. Uwolnić gruczoł i powoli wstrzyknąć 50 µL zawiesiny komórkowej do poduszki tłuszczowej obszaru pamięci, gdy myszy są nadal pod wpływem znieczulenia. Wstrzyknąć 100 µL red eject cine do bocznej żyły ogonowej.Natychmiast umieść mysz w systemie obrazowania IVIS 200 i wykonaj jednominutowy obraz luminescencyjny. Przenieś mysz z powrotem do klatki na około godzinę, co zapewni rozproszenie pozostałego sygnału ran vanilla Lucifer. Następnie podaj D Lucifer potassium salt drogą dożylną (IP); po pięciu minutach znieczul mysz za pomocą isof fluorine.Przenieś do IVUS 200 w pozycji odpowiadającej oryginalnej akwizycji obrazu RAN vanilla. Używając oprogramowania IVUS living image ustawionego w trybie fotonowym, określ wartości dla akwizycji zarówno standardowej, jak i firefly.Wysoce agresywne komórki 41 tworzą wyczuwalne guzy w ciągu tygodnia. Dlatego co tydzień należy wstrzykiwać myszom red eject cine, aby monitorować ogólny wzrost guza oraz przerzuty. Następnie wstrzykuje się d Lucifer, aby monitorować sygnalizację specyficzną dla danej ścieżki w różnych etapach rozwoju nowotworu.Monitor wzrost guza pierwotnego poprzez normalizację pomiarów lucyferazy RAN do pierwszych pomiarów wykonanych podczas inokulacji komórek nowotworowych. Co ważniejsze, oblicz wartości RLR w czasie, aby określić regulację czasową poszczególnych układów sygnalizacyjnych w odniesieniu do wzrostu i progresji guza. Następnie porównaj wartości RLR w płucach z wartościami obliczonymi dla guza pierwotnego, aby określić regulację przestrzenną poszczególnych układów sygnalizacyjnych w odniesieniu do wzrostu guza i przerzutowania.Podwójne obrazy bioluminescencyjne są wykorzystywane do wizualizacji i monitorowania zmian w składzie komórkowym w obrębie guza pierwotnego. Najpierw zmieszaj komórki 4T1 wykazujące ekspresję waniliowej lucyferazy z ich nieprzerzutowymi i izogenicznymi odpowiednikami 4T07 wykazującymi ekspresję lucyferazy świetlikowej, a następnie wstrzyknij różne proporcje tych zmieszanych populacji komórek raka piersi do poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego, zgodnie z wcześniejszym opisem. Natychmiast wykonaj obrazy dla obu lucyferaz (świetlikowej i waniliowej), aby ustalić początkowe RS reprezentatywne dla danej inokulowanej mieszaniny komórek.Nadal należy pozyskiwać podłużne obrazy dualnej bioluminescencji, aby przedstawić skład komórkowy w obrębie guza pierwotnego. Należy również ocenić czasoprzestrzenną przerzutność każdego pochodnego raka piersi w odniesieniu do wzrostu i progresji guza. Ponieważ każdy obraz jest wewnętrznie spójny i kontrolowany, trwały sygnał z guza pierwotnego stanowi istotny wskaźnik pozwalający ocenić ogólną porażkę następcy w przypadku każdej akwizycji danych typu vanilla i firefly.Podłoże lucyferazy jest bardzo wrażliwe na utlenianie, co prowadzi do autoluminescencji. W tym przypadku nieudany wtrysk dożylny lucyferazy powoduje pojawienie się niespecyficznego sygnału z przewodu pokarmowego, a nie z zlokalizowanego guza pierwotnego. Podczas tego udanego obrazowania nerek myszy z guzami pierwotnymi 41 oraz przerzutami do płuc, możliwe jest uzyskanie pomiarów sygnałów specyficznych dla danej ścieżki dzięki obrazowaniu lucyferazy świetlika.Dane te pozwalają na obliczenie RS zarówno dla guza pierwotnego, jak i dla jego przerzutów do płuc. Po zakończeniu tego eksperymentu można zastosować inne techniki, takie jak immunohistochemia i hybrydyzacja in situ, aby zweryfikować, czy poziom mRNA i białka jest regulowany w sposób podobny do zgłoszonego konstruktu.

in-vivo-dual-substrate-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

In vivo Podwójne Obrazowanie Bioluminescencyjne Substratu

Komórki guza piersi wykazujące ekspresję lucyferazy są wszczepiane myszom podskórnie i obrazowane za pomocą obrazowania optycznego w celu nieinwazyjnego monitorowania wzrostu i rozwoju guza w badaniu podłużnym.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne guzów piersi z użyciem systemu IVIS Spectrum

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Źródło: de Vries, C. R. i in., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje bioluminescencyjną technikę obrazowania monitorującego postęp infekcji bakteryjnej na żywym modelu myszy. Bakterie patogenne opracowane z systemem raportu luxABCDE emitują światło w miejscu zakażenia, umożliwiając wizualizację bakterii aktywnych przemianownie. Obrazując mysz w czasie, naukowcy mogą nieinwazyjnie śledzić dynamikę infekcji i...

Bioluminescencja zakażeń bakteryjnych u myszy

Źródło: Valentine, M. E. i in., Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa oraz testowanie tłumienia zjadliwości w prostym modelu infekcji myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje zastosowanie podejścia obrazowania opartego na bioluminescencji do monitorowania zakażenia bakteryjnego w modelu żywej myszy. Sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne i rentgenowskie umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oraz anatomiczną lokalizację infekcji rozprzestrzeniającej...

Obrazowanie w czasie rzeczywistym infekcji bakteryjnej w modelu myszy z użyciem bioluminescencji

Źródło: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę obrazowania bioluminescencyjnego in vivo genetycznie zmodyfikowanych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych wstrzykniętych do mózgu myszy. Proces obejmuje wstrzyknięcie lucyferyny, przygotowanie obrazowania i wykrywanie sygnałów bioluminescencyjnych z przeszczepionych komórek w miejscu...

Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Połączone obrazowanie optyczne i μCT w mysim modelu infekcji implantu ortopedycznego, wykorzystujące bioluminescencyjny zmodyfikowany szczep Staphylococcus aureus, zapewniło możliwość nieinwazyjnego i podłużnego monitorowania dynamiki infekcji bakteryjnej, jak również odpowiadającej jej reakcji zapalnej i zmian anatomicznych w kości.

Połączone obrazowanie optyczne in vivo i μCT w celu monitorowania infekcji, stanu zapalnego i anatomii kości w zakażeniu implantu ortopedycznego u myszy

Ten protokół opisuje stworzenie mysiego modelu z guzem do monitorowania progresji guza i angiogenezy w czasie rzeczywistym za pomocą podwójnego obrazowania bioluminescencyjnego.

Podwójne obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza i angiogenezy

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego z podwójnym podłożem do wizualizacji i ilościowego oznaczania aktywności lucyferaz w komórkach raka piersi in vivo. Technika umożliwia dynamiczną, długoterminową obserwację regulacji genów podczas wzrostu guza i przerzutów.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Przeglądaj więcej filmów