In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne
11 października 2011
W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.
Niniejsza procedura służy do wizualizacji i kwantyfikacji lucyferazy ran oraz lucyferazy świetlika. W celu opracowania guzów ortotopowych in vivo należy rozpocząć od stworzenia stabilnych linii komórkowych wykazujących ekspresję lucyferazy ran vanilla, lucyferazy świetlika lub obu tych enzymów. Następnie należy funkcjonalnie zweryfikować in vitro regulację stabilnie wyrażanego konstruktu reporterowego.
Kolejnym krokiem jest przeszczepienie komórek do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego oraz pozyskanie i ilościowe określenie odczytów dla lucyferazy ran oraz świetlika. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia, jest umożliwienie podłużnej i dynamicznej obserwacji regulacji genów in vivo podczas progresji guza i przerzutowania. Należy rozpocząć od wyselekcjonowania czterech kultur komórek raka piersi T1 z wektorem ekspresyjnym kodującym lucyferazę vanilla.
Inkubuj transfektanty w optymalnym stężeniu antybiotyku przez kilka dni. Następnie wybierz około 10 pojedynczych kolonii wykazujących ekspresję lucyferazy ran vanilla w celu monitorowania stopnia ekspresji. Kontynuuj namnażanie kolonii wykazujących wysoką ekspresję lucyferazy ran vanilla do analiz funkcjonalnych.
Podklonuj interesujący region promotora do plazmidu reporterowego lucyferazy PGL 4 zawierającego marker selekcyjny inny niż ten użyty do selekcji stabilnej ekspresji waniliny, przetransfekuj komórki nowotworowe i wyselekcjonuj stabilną populację poliklonalną lucyferazy świetlika, wykorzystując tradycyjne in vitro testy reporterowe genu lucyferazy w płytkach 96-dołkowych; zweryfikuj, czy komórki DBR regulują ekspresję lucyferazy świetlika w sposób zgodny z obserwowanym w komórkach rodzicielskich poddanych transfekcji przejściowej. Z tymi wektorami umieść komórki na wytrząsarce orbitalnej na 15 minut w celu lizy komórek.
Należy również zweryfikować, czy ekspresja vanilla napędzana przez CMV nie jest regulowana przez różne stymulacje komórkowe lub warunki traktowania. Dzień przed planowanym zabiegiem namnożyć komórki raka pamięci 41 DBR o niskiej fluorescencji współwyrażanej. Przed pasażem do inokulacji in vivo, zdysocjować komórki 41 za pomocą trypsyny.
Dokładnie wypłukać w pożywce wzrostowej i natychmiast rozcieńczyć komórki w PBS. Przechowywać na lodzie. Znieczulić izofluranem samice myszy bowel C w wieku od czterech do sześciu tygodni.
Używając pęsety, delikatnie chwyć i unieś czwartą poduszkę tłuszczową pachwinową. Ostrożnie wprowadź igłę o rozmiarze 27,5 G ściętym końcem do góry i wykonaj wstrzyknięcie do poduszki tłuszczowej bezpośrednio pod sutkiem.
Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie wprowadzić igły do jamy brzusznej. Uwolnić gruczoł i powoli wstrzyknąć 50 µL zawiesiny komórkowej do poduszki tłuszczowej obszaru pamięci, gdy myszy są nadal pod wpływem znieczulenia. Wstrzyknąć 100 µL red eject cine do bocznej żyły ogonowej.
Natychmiast umieść mysz w systemie obrazowania IVIS 200 i wykonaj jednominutowy obraz luminescencyjny. Przenieś mysz z powrotem do klatki na około godzinę, co zapewni rozproszenie pozostałego sygnału ran vanilla Lucifer. Następnie podaj D Lucifer potassium salt drogą dożylną (IP); po pięciu minutach znieczul mysz za pomocą isof fluorine.
Przenieś do IVUS 200 w pozycji odpowiadającej oryginalnej akwizycji obrazu RAN vanilla. Używając oprogramowania IVUS living image ustawionego w trybie fotonowym, określ wartości dla akwizycji zarówno standardowej, jak i firefly.
Wysoce agresywne komórki 41 tworzą wyczuwalne guzy w ciągu tygodnia. Dlatego co tydzień należy wstrzykiwać myszom red eject cine, aby monitorować ogólny wzrost guza oraz przerzuty. Następnie wstrzykuje się d Lucifer, aby monitorować sygnalizację specyficzną dla danej ścieżki w różnych etapach rozwoju nowotworu.
Monitor wzrost guza pierwotnego poprzez normalizację pomiarów lucyferazy RAN do pierwszych pomiarów wykonanych podczas inokulacji komórek nowotworowych. Co ważniejsze, oblicz wartości RLR w czasie, aby określić regulację czasową poszczególnych układów sygnalizacyjnych w odniesieniu do wzrostu i progresji guza. Następnie porównaj wartości RLR w płucach z wartościami obliczonymi dla guza pierwotnego, aby określić regulację przestrzenną poszczególnych układów sygnalizacyjnych w odniesieniu do wzrostu guza i przerzutowania.
Podwójne obrazy bioluminescencyjne są wykorzystywane do wizualizacji i monitorowania zmian w składzie komórkowym w obrębie guza pierwotnego. Najpierw zmieszaj komórki 4T1 wykazujące ekspresję waniliowej lucyferazy z ich nieprzerzutowymi i izogenicznymi odpowiednikami 4T07 wykazującymi ekspresję lucyferazy świetlikowej, a następnie wstrzyknij różne proporcje tych zmieszanych populacji komórek raka piersi do poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego, zgodnie z wcześniejszym opisem. Natychmiast wykonaj obrazy dla obu lucyferaz (świetlikowej i waniliowej), aby ustalić początkowe RS reprezentatywne dla danej inokulowanej mieszaniny komórek.
Nadal należy pozyskiwać podłużne obrazy dualnej bioluminescencji, aby przedstawić skład komórkowy w obrębie guza pierwotnego. Należy również ocenić czasoprzestrzenną przerzutność każdego pochodnego raka piersi w odniesieniu do wzrostu i progresji guza. Ponieważ każdy obraz jest wewnętrznie spójny i kontrolowany, trwały sygnał z guza pierwotnego stanowi istotny wskaźnik pozwalający ocenić ogólną porażkę następcy w przypadku każdej akwizycji danych typu vanilla i firefly.
Podłoże lucyferazy jest bardzo wrażliwe na utlenianie, co prowadzi do autoluminescencji. W tym przypadku nieudany wtrysk dożylny lucyferazy powoduje pojawienie się niespecyficznego sygnału z przewodu pokarmowego, a nie z zlokalizowanego guza pierwotnego. Podczas tego udanego obrazowania nerek myszy z guzami pierwotnymi 41 oraz przerzutami do płuc, możliwe jest uzyskanie pomiarów sygnałów specyficznych dla danej ścieżki dzięki obrazowaniu lucyferazy świetlika.
Dane te pozwalają na obliczenie RS zarówno dla guza pierwotnego, jak i dla jego przerzutów do płuc. Po zakończeniu tego eksperymentu można zastosować inne techniki, takie jak immunohistochemia i hybrydyzacja in situ, aby zweryfikować, czy poziom mRNA i białka jest regulowany w sposób podobny do zgłoszonego konstruktu.
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje metodę konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlika i renilla w komórkach przerzutowego raka piersi. Podejście to umożliwia dynamiczny wgląd w regulację genów podczas wzrostu guza i metastazy in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Obrazowanie bioluminescencyjne
Wprowadzenie
- Obrazowanie bioluminescencyjne dostarcza informacji na temat progresji guza.
- Enzymy lucyferazy służą jako skuteczne reportery ekspresji genów.
- Badania in vivo umożliwiają monitorowanie dynamiki guza w czasie rzeczywistym.
- Istniejące metody, takie jak immunohistochemia, nie posiadają możliwości prowadzenia badań podłużnych.
Cel badania
- Wizualizacja i ilościowe określenie aktywności lucyferazy w modelach raka piersi.
- Monitorowanie wzrostu guza i przerzutów w czasie.
- Porównanie szlaków sygnalizacyjnych w guzach pierwotnych i przerzutach.
Zastosowane metody
- Konstrukcja stabilnych linii komórkowych wykazujących ekspresję enzymów lucyferazy.
- Przeszczepianie komórek do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego myszy.
- Wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do monitorowania wzrostu guza.
- Kwantyfikacja sygnałów lucyferazy w celu oceny regulacji genów.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja dynamiki wzrostu guza z wykorzystaniem obrazowania podwójną lucyferazą.
- Opracowanie metody śledzenia regulacji przestrzennej szlaków sygnałowych.
- Wykazanie zalet obrazowania bioluminescencyjnego w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Identyfikacja zmian czasowych w ekspresji lucyferazy podczas progresji nowotworu.
Wnioski
- Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania biologii nowotworów.
- Obrazowanie bioluminescencyjne pozwala na lepsze zrozumienie procesów przerzutowania.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do oceny skuteczności terapeutycznej.
Często Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie bioluminescencyjne z wykorzystaniem podwójnego substratu umożliwia monitorowanie wzrostu guza oraz dynamiki szlaków sygnalizacyjnych in vivo w czasie rzeczywistym i w ujęciu podłużnym, co wypełnia istotną lukę w badaniach nad przerzutowym rakiem piersi. Dzięki jednoczesnej kwantyfikacji masy guza oraz ekspresji genów specyficznych dla danego szlaku, podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego i zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu. Stanowi ono skalowalną i powtarzalną platformę do oceny interwencji terapeutycznych na etapach odkrywania leków oraz w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez wizualizację czasoprzestrzennej regulacji systemów sygnalizacyjnych podczas ewolucji i przerzutowania nowotworu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie aktywności szlaków w guzach pierwotnych i przerzutach w obrębie tej samej kohorty zwierząt.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w doborze celu terapeutycznego poprzez korelację aktywności promotora elementu wiążącego Smad z progresją przerzutową w zmianach płucnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, wewnętrznie kontrolowane odczyty luminescencyjne dla szlaków lucyferazy świetlika i renilla.
- Wartość operacyjna: Ustanawia zestandaryzowane protokoły obrazowania dla pozyskiwania i normalizacji sygnałów z podwójnego substratu.
- Skalowalność: Umożliwia podłużną ocenę wzrostu guza i przerzutów przy użyciu seryjnego obrazowania bioluminescencyjnego w ciągu wielu tygodni.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dynamikę sygnalizacji in vivo z przerzutowym wzrostem poprzez porównanie wartości RLR w płucach z wartościami bazowymi w guzie pierwotnym.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Monitoruje sygnalizację specyficzną dla danej ścieżki w różnych etapach rozwoju i rozsiewu nowotworu.
- System istotny dla przebiegu choroby: Wykorzystuje ortotopowy model raka piersi 4T1 do badania zmian w ekspresji genów istotnych dla procesu przerzutowania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć, umożliwiając testowanie hipotez we wczesnej walidacji celów, wspierając gotowość testów w badaniach przesiewowych oraz dostarczając informacji dla decyzji o przejściu do fazy przedklinicznej poprzez ilościową analizę szlaków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wizualizację aktywności promotora elementu wiążącego Smad w kontekście nowotworów i przerzutów.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne sygnały bioluminescencyjne do śledzenia regulacji genów podczas progresji nowotworu.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary fotonów oraz normalizację RLR w celu porównania dynamiki sygnałowej w różnych miejscach występowania guza i w różnych punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy odczyty sygnałowe lucyferazy z obciążeniem przerzutowym i rozwojem zmian w płucach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do podłużnych badań wzrostu guza i modulacji szlaków sygnałowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez korelację wzrostu guza ze zmianami w sygnalizacji specyficznej dla danej ścieżki w czasie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację dzięki wewnętrznym kontrolom sygnału i spójności obrazowania podłużnego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając dynamicznych, ilościowych informacji o zaangażowaniu celu i potencjale przerzutowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o czasową i przestrzenną regulację szlaków onkogennych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w klonowaniu molekularnym, generowaniu stabilnych linii komórkowych oraz walidacji reporterów lucyferazy.
- Zależność od systemów obrazowania bioluminescencyjnego zdolnych do detekcji fotonów z dwóch substratów oraz sekwencyjnego podawania substratów.
- Konieczność standaryzacji międzyzespołowej w zakresie protokołów obrazowania, dawkowania substratów oraz procedur normalizacji sygnału.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji dla różnych konstruktów promotor-reporter oraz modeli nowotworowych innych niż rak piersi 4T1.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak wrażliwość substratów na utlenianie oraz potencjalne zakłócenia sygnału wynikające z nieprawidłowej techniki iniekcji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Stable Expression of CMV-Driven Renilla Luciferase
1:36
Expression, Selection, and Functional Verification of Inducible Promoter-Driven Firefly Luciferase
2:32
Establishing 4T1 Primary Mammary Tumors
3:25
Initial Dual Luminescent Imaging
4:22
Longitudinal Luminescent Imaging
5:17
Dual Bioluminescent Imaging of Two Unique Cell Types in a Single Animal
6:16
In vivo RLRs from Dual Bioluminescent Imaging
7:10
Conclusion
