Name: Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym do inżynierii tkankowej serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj izolację kardiomiocytów szczurzych i ich enkapsulację w hydrożelu fibrynowym do inżynierii tkankowej serca. Ta metoda umożliwia ocenę siły skurczowej i żywotności komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez National Institutes of Health - National Heart, Lung and Blood Institute (grant nr R00HL093358 dla L.D.B.).

<ol><li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical%2C+biochemical%2C+and+extracellular+matrix+effects+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype.</a> Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).</li>
<li>Guarnieri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+RGD+gradient+on+PEG+hydrogel+scaffold+influences+cell+migration+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters.</a> Acta. 6, 2532-2539 (2010).</li>
<li>Krebs, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+poly%28lactic-co-glycolic%29+acid+scaffolds+with+in+situ+pore+formation+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering.</a> Acta. 5, 2847-2859 (2009).</li>
<li>Zimmermann, W. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Three-Dimensional+Hyaluronic+Acid+Stem+Cell+Chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis.</a> Tissue engineering. 15, (2009).</li>
<li>Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).</li>
<li>Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+distension+of+fibrin-based+tissue+constructs%3A+evidence+of+adaptation+during+growth+of+engineered+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).</li>
<li>Jockenhoevel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+gel+-+advantages+of+a+new+scaffold+in+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cardio-thoracic+surgery+%3A+official+journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering.</a> European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).</li>
<li>Ryan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sourcing+and+culture+conditions+for+fibrin-based+valve+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs.</a> Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).</li>
<li>Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin-based+arterial+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+66+%28Part+A%22%5BJournal%5D)">A fibrin-based arterial media equivalent.</a> Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22%3ELIVE%2FDEAD+Viability%2FCytotoxicity+Kit+%2Afor+mammalian+cells%22">>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells</a>. , Invitrogen. (2005).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Enkapsulacja kardiomiocytów noworodków szczura w żelach fibrynowych pozwala na uzyskanie spójnego i żywotnego trójwymiarowego modelu in vitro systemu mięśnia sercowego. Fibryna jest preferowanym biomateriałem, ponieważ uwięzione w niej komórki pozostają metabolicznie aktywne i są zdolne do kompakcji, przebudowy oraz odtworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnej z natywną tkanką serca 12. Dzięki temu, że kardiomiocyty mogą układać się w tym środowisku w sposób uporządkowany, ich funkcjonalność jest bardziej charakterystyczna dla mięśnia sercowego, co skutkuje większą siłą skurczu w porównaniu z tkankami izotropowymi 6. W przypadku potencjalnych zastosowań terapeutycznych niezbędne jest enkapsulowanie komórek w materiale, który sprzyja zarówno ich żywotności, jak i funkcjonalności. Przedstawione tutaj protokoły demonstrują wydajny i precyzyjny sposób tworzenia sieci fibrynowej w celu kontrolowania zachowania komórek serca w trójwymiarowym mikrośrodowisku.
Podczas tworzenia i hodowli tych konstruktów mogą wystąpić pewne potencjalne problemy. Jednym z nich jest utrzymanie żywotności komórek przed enkapsulacją, co znacząco wpływa na funkcjonalność konstruktu. Należy dążyć do ograniczenia śmierci komórek po izolacji poprzez skrócenie czasu między izolacją a enkapsulacją komórek w żelu fibrynowym. Konstrukty powinny otrzymywać świeżą pożywkę co drugi dzień zgodnie ze ścisłym harmonogramem. Ponadto ważne jest zapewnienie homogeniczności wszystkich używanych roztworów. Jeśli mieszanina fibrynogenu, trombiny i komórek utworzy niejednorodne środowisko, zdolność komórek do przebudowy ECM, sprzężenia mechanicznego i kontrakcji może zostać ograniczona. Istotne jest również zapobieganie powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas wstrzykiwania konstruktów, aby uniknąć przerw w ciągłości inżynieryjnej tkanki. Jednym ze sposobów na rozwiązanie tego problemu jest nabranie do strzykawki większej ilości żelu, niż jest wymagane do wykonania konstruktu, i powolne wstrzykiwanie. Na koniec, gdy matryca fibrynowa stężeje i pozostanie w pożywce przez 24 godziny, niezbędne jest oddzielenie konstruktu od ścianek formy pierścieniowej, aby wspomóc komórkową kompakcję żelu fibrynowego. Utrzymanie konstruktu w środku formy ułatwia wymianę gazową i dostarczanie składników odżywczych. Przyleganie do ścianek formy pierścieniowej może również zakłócić pożądane ustawienie komórek.
Należy zauważyć, że w niniejszym protokole jako metoda eutanazji stosowana jest dekapitacja w stanie świadomości, co jest metodą dopuszczalną zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health oraz American Veterinary Medical Association. Niemniej jednak niektóre instytucje zalecają stosowanie znieczulenia przed dekapitacją u noworodków szczurów. Wybraliśmy dekapitację w stanie świadomości, ponieważ zapewnia ona minimalny czas przebywania w warunkach hipoksji dla wyciętej tkanki/komórek serca. Relatywnie niewielki stopień hipoksji może prowadzić do niedokrwienia miocytów i potencjalnie do ich śmierci, co mogłoby znacząco wpłynąć na wyniki niniejszego protokołu.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>91308-12</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>pinceta precyzyjna</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>nożyczki duże</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-14</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>mikronożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>91501-09</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>uchwyt do skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10008-13</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>ostrze skalpela</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-918-5A</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>Chłonna podkładka laboratoryjna</td><td>VWR international</td><td>56617-014</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>sterylna sterylnym obłożeniem</td><td>Fisher Scientific</td><td>GM42526</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>worek do autoklawowania</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>gazik</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-761-52</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>betadyna</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-150-01</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>rękawiczki sterylne</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-020</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>sterylna pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>9962</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>kolagenaza</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLS2</td><td>Izolacja</td></tr><tr><td>pręt teflonowy o średnicy 1/4 cala</td><td>McMaster-Carr</td><td>8546K11</td><td>Część formy</td></tr><tr><td>rurka teflonowa ID 1/4 cala, OD 1/2 cala</td><td>McMaster-Carr</td><td>8547K31</td><td>Część formy</td></tr><tr><td>silikonowy pierścień O-Ring ID 1/4 cala, OD 1/2 cala</td><td>McMaster-Carr</td><td>9396K204</td><td>Część formy</td></tr><tr><td>rurka teflonowa ID 1/4 cala, OD 5/16 cala</td><td>McMaster-Carr</td><td>52355K14</td><td>Część formy</td></tr><tr><td>strzykawki Kendall monoject 6cc</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-41</td><td>Część formy</td></tr><tr><td>strzykawka BD 3cc</td><td>Fisher Scientific</td><td>309585</td><td>Część formy</td></tr><tr><td>Fibrynogen wołowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>Trombina wołowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7513</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10569</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383147</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>filtr 0,2 mikrona</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVT05RE</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>sitka do komórek 40 mikronów</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>filtr nakrętkowy 0,45 mikrona</td><td>Corning</td><td>430627</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>szklany przefiltrowywacz</td><td>EMD Millipore</td><td>AP2007500</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>igła 18G o długości 1 1/2 cala</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5D</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>igła 21G o długości 1 cala</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826C</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>słoiki do konstruktów</td><td>Fisher Scientific</td><td>2116</td><td>Konstrukt</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>surowica konia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1138</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>płodowa surowica wołowa</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>kwas aminokapronowy</td><td>Acros Organics</td><td>103305000</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td>Pożywka</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Optimal cutting temperature (OCT)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27050</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Fisher Scientific</td><td>03551-4</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko mysiemu MYH1/2/4/6</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-32732</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko króliczej Koneksynie 43</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3512</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne anty-mysie od osła sprzężone z Dylight 549</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-505-151</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne anty-królicze od osła sprzężone z Dylight 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-485-152</td><td>Histologia</td></tr><tr><td>Test Live/dead</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td>Analiza</td></tr></tbody></table>

enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

Hodowla komórek w trójwymiarowym środowisku hydrożelowym jest istotną techniką opracowywania konstruktów do inżynierii tkankowej, a także badania odpowiedzi komórkowych w różnych warunkach hodowli in vitro. Środowisko trójwymiarowe dokładniej naśladuje warunki, z jakimi komórki spotykają się in vivo, dzięki zastosowaniu bodźców mechanicznych i chemicznych we wszystkich wymiarach 1. Trójwymiarowe hydrożele mogą być wykonane z polimerów syntetycznych, takich jak PEG-DA 2 i PLGA 3, lub z wielu białek naturalnie występujących, takich jak kolagen 4, kwas hialuronowy 5 czy fibryna 6,7. Hydrożele stworzone z fibryny, naturalnie występującego białka krzepnięcia krwi, mogą polimeryzować, tworząc siatkę będącą częścią naturalnych procesów gojenia ran w organizmie 8. Fibryna jest degradowalna przez komórki i potencjalnie autologiczna 9, co czyni ją idealnym tymczasowym rusztowaniem w inżynierii tkankowej.
W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych z trzydniowych szczurząt oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego do inżynierii tkankowej. Miocyty noworodkowe są powszechnie stosowanym źródłem komórek w badaniach in vitro nad formowaniem i inżynierią tkanki serca 4. Żel fibrynowy powstaje poprzez zmieszanie fibrynogenu z enzymem trombiną. Trombina odcina fibrynopeptydy FpA i FpB z fibrynogenu, odsłaniając miejsca wiązania, które oddziałują z innymi monomerami 10. Oddziaływania te powodują samozłożenie monomerów w włókna, które tworzą sieć hydrożelu. Ponieważ czas trwania tej reakcji enzymatycznej można regulować poprzez zmianę stosunku trombiny do fibrynogenu lub stosunku wapnia do trombiny, możliwe jest formowanie wtryskowe konstrukcji o wielu różnych geometriach 11,12. Ponadto możemy uzyskać wyrównanie powstałej tkanki poprzez odpowiednie ograniczenie żelu podczas hodowli 13.
Po dwutygodniowej hodowli zmodyfikowanych konstruktów tkanki serca w warunkach statycznych, komórki serca zaczynają przebudowywać konstrukt i mogą generować siłę skurczu w warunkach stymulacji elektrycznej 6. W ramach niniejszego protokołu opisujemy również metody analizy wytworzonego w procesie inżynierii tkankowej mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym analizę funkcjonalną siły aktywnej generowanej przez konstrukt mięśnia serca pod wpływem stymulacji elektrycznej, a także metody określania końcowej żywotności komórek (test Live-Dead) oraz barwienia immunohistochemiczne w celu zbadania ekspresji i morfologii typowych białek istotnych dla skurczu (ciężki łańcuch miozyny lub MHC) oraz sprzężenia komórkowego (koneksyna 43 lub Cx43) między miocytami.

Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Hodowla komórek w trójwymiarowym środowisku hydrożelowym jest istotną techniką opracowywania konstruktów do inżynierii tkankowej, a także badania...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest enkapsulacja kardiomiocytów noworodków szczura w hydrożelu FI na potrzeby inżynierii tkanki serca. Jest to osiągane poprzez wstępne wyizolowanie serc z noworodków szczura w wieku od dwóch do trzech dni. Następnie serca poddawane są trawieniu kolagenazą.Aby oddzielić komórki serca od macierzy zewnątrzkomórkowej, komórki te zostają następnie zamknięte w hydrożelu fibrynowym. Na koniec konstrukty są hodowane przez dwa tygodnie. Ostatecznie wyniki pokazują, że konstrukty mają zdolność do generowania siły skurczu rzędu około 1,3 milli Newtons w odpowiedzi na stymulację elektryczną.Ponadto, uporządkowaną strukturę konstruktu można zaobserwować za pomocą barwienia histologicznego białek miocytów. Inżynierowane konstrukty mięśnia sercowego mogą służyć jako potencjalna terapia zawału mięśnia sercowego, umożliwiając naprawę lub zastąpienie bliznowatej tkanki tkanką inżynieryjną, co poprawia funkcję serca po urazie lub chorobie. Konstrukty te mogą stanowić cenny system modelowy in vitro do badania wpływu różnych bodźców na siły skurczu oraz prawidłowy i patofizjologiczny rozwój serca.Po przygotowaniu pożywki i wysterylizowaniu instrumentów chirurgicznych dla każdej osoby, należy położyć chłonny podkład na powierzchni roboczej komory z laminarnym przepływem powietrza i przykryć go jałowym obrusem. Na jałowy obrus należy położyć sterylne instrumenty chirurgiczne oraz gazik o wymiarach 4x4 cale. Bez dotykania instrumentów, należy otworzyć sterylne ostrze skalpela nr 20 i położyć je na obrusie.Po odcięciu głowy szczenięcia, przemyj klatkę piersiową gazą nasączoną Betadyną. Unieruchom zwierzę, ściskając łopatki. Wykonaj częściową torakotomię, aby odsłonić serce, zwiększając nacisk na łopatki, co wypchnie serce poza żebra.W celu przeprowadzenia sekcji łopatki, poprowadź ostrze skalpela za sercem, aby przeciąć duże naczynia i usunąć organ. Umieść serce w temperaturze lodu w szalce Petriego zawierającej PBS z glukozą. Po wyizolowaniu serc usuń pozostałości krwi i tkanki łącznej, płucząc je w lodowatym PBS z glukozą.Usuń górną jedną trzecią każdego serca, tak aby pozostały dolne dwie trzecie. Pozwoli to na wyizolowanie głównie tkanki komór. Umieść tkankę w nowej płytce Petriego z lodowatym roztworem PBS z glukozą. Używając sterylnych mikronapinek i pęsety, ostrożnie posiekaj serca na kawałki o wielkości około jednego milimetra sześciennego.Przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki stożkowej i odlej cały bufor, pozostawiając jedynie 10 mililitrów. Dodaj siedem mililitrów roztworu kolagenazy. Wstrząsaj mieszaninę tkanki z kolagenazą w temperaturze 37 °C przez siedem minut.Delikatnie pipetuj 10 razy, aby rozbić fragmenty tkanki. Pozostaw fragmenty do osadzenia, a następnie odessań i wylej ciecz. Dodaj siedem mililitrów kolagenazy do fragmentów tkanki i ponownie traw przez siedem minut.W każdym z pozostałych etapów należy delikatnie pipetować próbkę 10 razy, aby rozbić fragmenty tkanki. Po ich opadnięciu należy odessać nadsącz i zebrać go. Do oddzielnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml należy dodać siedem mililitrów kolagenazy do fragmentów tkanki i ponownie inkubować w celu trawienia przez siedem minut. Do każdej probówki z nadsączem należy dodać 10 mililitrów roztworu zatrzymującego, używając nowej pipety serologicznej po każdym dodaniu nadsączu z procesu trawienia.Aby przygotować się do odlewania konstrukcji z żelu fibrynowego, należy zapoznać się z pisemną częścią protokołu. Umieść wcześniej przygotowane trzpienie w obudowach strzykawki o pojemności 6 cc, używając strzykawki o pojemności 3 cc jako tłoka w celu uzyskania szczelnego połączenia między pierścieniami O-ring a podkładkami teflonowymi. Aby przygotować 1 ml żelu fibrynowego, sporządź roztwór F w probówce stożkowej, dodając 112 µL roztwoku fibrynogenu do 558 µL 20 mM HEPES.Bufor w 0,9% roztworze soli fizjologicznej w oddzielnej probówce stożkowatej. Przygotować roztwór T, dodając 17 µL roztwoku trombiny i 1,3 µL dwukrotnego roztworu wapnia do 135 µL DMEM. W trzeciej probówce stożkowatej odwirować komórki i resuspendować je do stężenia 29,4 mln komórek na ml, czyli sześciokrotności pożądanej końcowej koncentracji komórek w konstrukcie.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności na etapie wytwarzania konstrukcji. Po zmieszaniu roztworów fibrinogenu i trombiny polimeryzacja fibryny zachodzi szybko. W związku z tym należy pracować sprawnie, aby zapewnić jednorodność roztworu, jednocześnie zapobiegając przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do hydrożelu podczas wstrzykiwania go do formy odlewniczej.Przed przystąpieniem do odlewania konstrukcji z żelu fibrynowego, należy przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 18 G o długości 1,5 cala. Należy przygotować również igłę 21 G o długości 1 cala. Aby przygotować 1 ml roztworu żelu fibrynowego, należy dodać 667 µL roztworu F do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie dodać 167 µL zawiesiny komórkowej.I na koniec 167 µL roztworu T. Ostrożnie pipetuj mieszaninę, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. W tym momencie reakcja została rozpoczęta i należy niezwłocznie przystąpić do wstrzyknięcia konstruktu.Używając strzykawki z igłą 18G, pobierz roztwór fibryny. Należy uważać, aby nie odwracać strzykawki do góry dnem, aby zapobiec przedostaniu się pęcherzyków powietrza do igły. Zastąp igłę 18G igłą 21G.Delikatnie ostukaj strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie wprowadź strzykawkę do formy pomiędzy korki, prowadząc ją wzdłuż rowka uszczelki z Teflonu, i wstrzyknij roztwór do formy. Przechyl formę, aby zapewnić jej całkowite wypełnienie.Następnie wypełnij pozostałe formy. Owiń formy parafilmem w grupach po trzy i umieść je w inkubatorze lub piecu w temperaturze 37 °C. Inkubuj żele przez 20 minut, aby zapewnić fibrynie czas niezbędny do pełnej polimeryzacji.Napełnij każdy słoik hodowlany 21 ml pożywki do konstruktów mięśnia sercowego na jeden konstrukt. Użyj sterylnej obudowy strzykawki o pojemności trzech cc jako tłoka, aby wprowadzić trzpień z konstruktem do dużej szalki Petriego z DMEM. Następnie umieść konstrukt w słoiku z próbką.Inkubować słoiki w temperaturze 37 °C przez dwa tygodnie. Aby rozpocząć analizę zacisku konstrukcji fibrynowej, należy przypiąć żabki z przewodu prowadzącego od stymulatora do przewodów elektrod w kąpieli. Włączyć płytkę akwizycji danych, generator impulsów oraz przetwornik siły.Ustaw przetwornik siły na zakres 5G i wyzeruj go. Otwórz dedykowany program LabVIEW, który wyświetla i zapisuje dane z przetwornika siły. Utwórz nowy, pusty plik tekstowy w folderze danych dla każdej próbki. Używając pęsety, zdejmij konstrukt z podpory trzpienia, delikatnie zsuwając pierścień konstruktu z podpory teflonowej i umieszczając go na stałym metalowym słupku w systemie pomiaru siły.Kąpiel w pożywce. Użyj pincety, aby przesunąć i unieść konstrukt wokół trzpienia przetwornika siły. Umieść drugi koniec konstruktu na ramieniu przetwornika i dokręć, aż przetwornik zacznie wskazywać odczyt.1.0 G siły na stymulator serca. Ustaw napięcie impulsu na 20 V, czas trwania na 6 ms oraz częstotliwość na 1 Hz. Rozpocznij stymulację elektryczną, naciskając przycisk włączania/wyłączania wyjścia.Rozpocząć rejestrację i kontynuować do momentu, aż przebieg fali stanie się regularny. Przeanalizować przebieg fali w programie MATLAB, aby określić szybkość skurczu i szybkość rozkurczu siły. Konstrukt z fibryny i kardiomiocytów początkowo pokrywa całą szerokość formy.Po dwóch tygodniach hodowli konstrukcja kurczy się do około jednej piątej początkowej szerokości. Stymulacja elektryczna konstrukcji generuje dane dotyczące siły skurczu, jak pokazano tutaj. Oczekiwane siły skurczu wynoszą około 1,3 millinewtona.Żywotność komórek w konstrukcie zależy od ich odległości od powierzchni konstruktu mającej kontakt z pożywką hodowlaną, co wynika z ograniczeń dyfuzyjnych tlenu do wnętrza konstrukcji. Na powierzchni konstruktu, przy użyciu mikroskopii konfokalnej, zaobserwowano wysoką żywotność komórek. Uporządkowana struktura konstruktu jest widoczna dzięki barwieniu na ciężkie łańcuchy miozyny w kolorze czerwonym; Connexin 43, niezbędne do sprzęgania komórek między miocytami, barwi się na zielono.Po opanowaniu techniki cały protokół powinien zająć około pięciu godzin. Część dotycząca izolacji zajmie około trzech godzin, natomiast przygotowanie konstruktu zajmie około dwóch godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby igła była zawsze skierowana w dół, co zapobiegnie wnikaniu pęcherzyków powietrza do sieci fibrynowej.Ponadto, przechylenie formy sprawi, że otwór igły będzie zawsze znajdował się w najwyższym punkcie podczas wstrzykiwania, co zapewni całkowite wypełnienie odlewu formy roztworem fibryny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak enkapsulować kardiomiocyty w pierścieniowate hydrożele fibrynowe, najpierw izolując kardiomiocyty ze szczurów noworodkowych, a następnie wtryskując roztwór fibryny do łatwo montowalnych form cylindrycznych.

encapsulation-cardiomyocytes-fibrin-hydrogel-for-cardiac-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wdrożanie kardiomiocytów w żelu fibrynowym dla inżynierii tkankowej serca

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Implantacja biogramu do leczenia zawału mięśnia sercowego wywołanego podwiązaniem LAD w modelu gryzoni tradycyjnie wymagała dwóch operacji na otwartym sercu. W celu zmniejszenia śmiertelności i zapewnienia optymalnych warunków do utrwalania stałych i galaretowatych biomatryc związanych z komórkami, opracowano procedury małoinwazyjne.

Terapia komórkowa niewydolności serca u szczurów: podwójna torakotomia w przypadku zawału mięśnia sercowego i implantacji nasierdzia komórek i biomatrycy

Ten protokół ma na celu złagodzenie ograniczeń związanych z nieprawidłowym przeszczepem komórek macierzystych w leczeniu zawałów mięśnia sercowego za pomocą systemu hydrożelowego i kleju na bazie fibryny. Dzięki takiemu podejściu można utrzymać kontakt komórka-tkanka po zawale choroby, zwiększając potencjał terapeutyczny korzystnych środków w miejscu urazu.

Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy szybką, łatwą i tanią metodę wytwarzania niestandardowych form polidimetylosiloksanowych, które mogą być używane do produkcji hydrożelowych tkanek inżynieryjnych o skomplikowanej geometrii. Dodatkowo opisujemy wyniki ocen mechanicznych i histologicznych przeprowadzonych na zmodyfikowanych tkankach serca wytworzonych tą techniką.

Specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo

Terapia oparta na komórkach macierzystych pojawiła się jako skuteczna strategia naprawy uszkodzonych tkanek serca po zawale mięśnia sercowego. Zapewniamy optymalną aplikację in vivo do przeszczepu komórek macierzystych przy użyciu hydrożeli żelatynowych, które mogą być sieciowane enzymatycznie.

Domięśniowe przeszczepienie hydrożeli iniekcyjnej obciążających MSC po zawale mięśnia sercowego w modelu mysim

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj izolację kardiomiocytów szczurzych i ich enkapsulację w hydrożelu fibrynowym do inżynierii tkankowej serca. Ta metoda umożliwia ocenę siły skurczowej i żywotności komórek.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Przeglądaj więcej filmów