Metoda genotypowania oparta na PCR w celu rozróżnienia między odmianami dzikimi i ozdobnymi Imperata cylindrica

Głównym celem tej procedury jest zapewnienie opłacalnego i szybkiego protokołu genotypowania molekularnego, który może rozróżnić odmiany Retta cylindrica, zwykle nazywane trawą gon, których nie można odróżnić na podstawie samej morfologii. Osiąga się to poprzez uprzednią identyfikację i wyizolowanie tkanki z interesującej nas odmiany trawy gon. Kolejnym krokiem jest ekstrakcja jądrowego i otynkowanego DNA z pobranej tkanki.

Następnie przeprowadza się reakcję łańcuchową polimerazy na wyekstrahowanym DNA przy użyciu starterów specyficznych dla odmiany, które celują w różnice sekwencji w regionie PLA zamienia się w region LF, a także odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych. Ostatnim krokiem jest wykonanie elektroforezy żelowej w każdej z czterech reakcji PCR w celu wizualizacji amplifikowanych produktów PCR. Ostatecznie odmiana zebranej trawy gon jest określana poprzez analizę wynikowych zakazów stosowania produktów PCR specyficznych dla odmiany na żelu Plany inwazyjne kosztują Stany Zjednoczone około 3,4 miliarda rocznie, powodując znaczne szkody zarówno w zasobach rolnych, jak i naturalnych.

Dzika trawa imparato Electrica, znana również jako Cogan, jest jednym z 10 najgorszych inwazyjnych chwastów na świecie. Trawa Cogan szybko rozprzestrzenia się w mono drzewostanach, które wypierają rodzimą roślinność, a z kolei zwierzęta, które są zależne od tej rodzimej roślinności Trawa GaN atakuje obecnie 490 milionów hektarów na całym świecie i około 500 000 hektarów w Stanach Zjednoczonych, a ozdobna odmiana ti tus centrica jest szeroko sprzedawana pod nazwami tus Centrica, Arbra, czerwony Baren i japońska krwawa grubiańskość, jak nazwiemy to JBG. Odmiana ta jest przypuszczalnie sterylna i nieinwazyjna i jest uważana za pożądaną ze względu na czerwone liście.

W pewnych warunkach japońska trawa krwista może wytwarzać żywotne nasiona i powrócić do całkowicie zielonej formy, która jest nie do odróżnienia od dzikiej trawy cogan. Jak widać, obie mają zielone liście i są większe niż tradycyjna odmiana ozdobna z większymi liśćmi. Dodatkowo rośliny typu odwróconego i dzikiego mają większe kłącza, a odmiana ozdobna zwiększa swój bezpłciowy potencjał rozrodczy.

Rewersja dokonuje identyfikacji na podstawie samej morfologii. Trudne zadanie. Metody molekularne zapewniają środki do dokładnego rozróżniania inwazyjnych roślin i materiałów roślinnych, których nie można zidentyfikować za pomocą normalnych środków wizualnych.

Metody molekularne mają kluczowe znaczenie dla ochrony przed rozprzestrzenianiem się i wprowadzaniem roślin inwazyjnych. Zastosowanie tego protokołu molekularnego zapewnia sposób na dokładne odróżnienie japońskiej trawy krwistej od trawy Kogan. Protokół ten może pomóc w zapobieganiu współwystępowaniu z trawą Kogan i możliwemu tworzeniu żywotnych hybryd.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak amplifikowany polimorfizm długości fragmentów lub analiza FLP A i takie rzeczy jak sekwencjonowanie DNA, jest to, że zapewnia bardzo opłacalną i szybką technikę genotypowania molekularnego, która może łatwo odróżnić dziką trawę kogan od odmian japońskiej trawy krwistej. Technikę zademonstruje Joseph Hery, student z naszego laboratorium. Najpierw zidentyfikuj okaz z miejsca, w którym rośnie trawa gon lub japońska trawa krwista i należy je od siebie odróżnić.

Japońska trawa krwista jest łatwa do odróżnienia od dzikiej trawy gon po jaskrawoczerwonych liściach. Jednak powrót japońskiej trawy krwistej jest prawie nie do odróżnienia od trawy Kogan, ponieważ obie mają dłuższe zielone liście, większą powierzchnię liści i większe kłącza niż ozdobna japońska trawa krwista. Ta metoda może być stosowana na świeżych, mrożonych i niedawno wysuszonych tkankach liści.

W przypadku przechowywania tkanek do ekstrakcji DNA w późniejszym terminie, najlepszą metodą jest natychmiastowe zamrożenie i przechowywanie tkanki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Jeśli konieczne jest przechowywanie w suchym miejscu, umieść chusteczkę w papierowej kopercie i przechowuj ją w odwodnionym żelu krzemionkowym lub innych aktywnych środkach osuszających w temperaturze pokojowej. Jeżeli ma być użyta świeża tkanka, należy upewnić się, że DNA zostało wyekstrahowane w ciągu trzech godzin od pobrania, aby zapobiec degradacji.

W tej procedurze wykorzystuje mini zestaw DNEZ plants firmy Kyogen zgodnie z instrukcjami producenta z jedną drobną modyfikacją. Tu. Procedura została dostosowana w taki sposób, że używa się więcej niż 100 miligramów świeżej lub zamrożonej tkanki lub więcej niż 20 miligramów suchej tkanki. Najpierw zmielić więcej niż 100 miligramów świeżej lub zamrożonej tkanki liścia lub więcej niż 20 miligramów suchej tkanki liścia na drobny proszek, używając trzech rund ciekłego azotu z mieleniem w schłodzonym moździerzu i tłuczku.

Odważyć zamrożony proszek ze świeżej lub zamrożonej tkanki na 100 miligramów porcji. Jeśli używasz suchej tkanki liścia, zważyć proszek na 20 miligramów porcji. Po tym kroku przystąp do ekstrakcji DNA zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą spektrofotometru, takiego jak test spektrofotometru NanoDrop, DNA, jakość i ilość dobra wydajność DNA powinna wynosić od 50 do 150 nanogramów na mikrolitr, przy czym dwa 60 na dwa 80 i 2 32 80 są bliskie 2,0, jak widać. Tu.

Przeprowadź elektroforezę przy użyciu standardowego 1% żelu AROS. Sprawdź obecność stosunkowo dużych prążków większych niż 10 KB bez lub z niewielkimi smugami spowodowanymi zanieczyszczeniem RNA, jeśli stężenie DNA jest wysokie, rozcieńczyć próbki do 70 nanogramów na mikrolitr dla kolejnych etapów. Startery PCR używane w tym protokole, oznaczone czerwoną i zieloną strzałką, opierają się na różnicach sekwencji między otynkowanym regionem dystansowym LF trawy Cogana a japońskim genotypem trawy krwistej.

Różnice te występują w postaci polimorfizmów pojedynczych nukleotydów oraz insercji i delecji wskazywanych przez pionowe czarne strzałki, które umożliwiają rozwój starterów specyficznych dla odmiany. Lokalizując startery w miejscach unikalnych sekwencji, sekwencje starterów są zawarte w pisemnej części protokołu dla każdej izolowanej próbki DNA, ustaw dwie 50-mikrolitrowe reakcje PCR w 0,2 mililitrowych cienkościennych probówkach PCR na ICE przy użyciu każdego zestawu starterów zgodnie z pisemnym protokołem. Jeśli stężenie DNA jest niskie, do każdej reakcji można dodać więcej DNA, dostosowując ilość podwójnie destylowanej wody wolnej od nukleaz, tak aby całkowita objętość reakcji pozostała 50 mikrolitrów.

Nie używaj więcej niż pięciu mikrolitrów DNA lub 10% całkowitej objętości na reakcję, ponieważ zanieczyszczenia zawarte w próbkach DNA mogą hamować reakcje PCR, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki PCR działają, dobrze ustawić kontrolę pozytywną. Używając starterów kontroli dodatniej, ustaw kontrolę ujemną przy użyciu tego samego zestawu starterów kontrolnych, co kontrola pozytywna, ale z podwójnie destylowaną wodą zamiast wyekstrahowanego DNA w tym momencie, dla każdej badanej próbki zachodzą łącznie cztery reakcje PCR. Następnie należy przeprowadzić amplifikacje PCR w termocyklerze wyposażonym w podgrzewaną pokrywę, wykorzystując parametry cykliczne PCR w pisemnym protokole, optymalizacja pod kątem temperatury klęczenia, czasów wydłużenia i liczby cykli może być potrzebna w zależności od jakości starterów DNA, polimerazy przyczepnej lub rodzaju użytego termocyklera.

Po zakończeniu reakcji PCR oddziel produkty PCR na 1% żelu za pomocą standardowej elektroforezy. Uruchom próbki pod napięciem około 120 woltów, aż czoło D osiągnie trzy czwarte całkowitej długości żelu. Wizualizuj żel w świetle UV i sprawdź powstałe prążki, aby zobaczyć, czy odpowiedni fragment DNA został amplifikowany.

Ten reprezentatywny żel pokazuje wyniki elektroforezy produktów PCR pochodzących z trawy Kogan, japońskiej trawy krwistej i próbek DNA odwracających japońską trawę krwionośną w połączeniu z trawą Kogan i starterami specyficznymi dla JBG, a także kontrolę pozytywną LF i kontrolę ujemną bez matrycy. Zestaw starterów kontroli pozytywnej LF działa równie dobrze dla trawy Cogan, japońskiej trawy krwi, japońskiej trawy krwistej i innych traw, a w rezultacie uzyska pasmo 890 par zasad. Jeśli wszystkie odczynniki PCR są wolne od zanieczyszczeń DNA, reakcja kontroli ujemnej nie doprowadzi do powstania produktu PCR.

Jeśli próbka DNA pochodzi z trawy kogan typu dzikiego, reakcja PCR przy użyciu zestawu starterów specyficznych dla trawy Kogan spowoduje powstanie pojedynczego pasma przy około 595 parach zasad, podczas gdy startery specyficzne dla JBG spowodują brak prążka. Podobnie, jeśli próbka DNA pochodzi z JBG lub odwróconej reakcji J-B-G-A-P-C-R, użycie zestawu starterów specyficznych dla JBG spowoduje powstanie pojedynczego pasma o około 594 parach zasad. Podczas gdy podkłady specyficzne dla trawy Kogan spowodują brak pasma.

Ponieważ JBG i odwrócony JBG mają identyczną sekwencję kwasu nukleinowego, będą miały identyczne wzorce prążków. Jednak różnice morfologiczne między JBG i rewertami JBG są dość oczywiste, więc chociaż wyniki PCR będą takie same, odmiany JBG są łatwe do odróżnienia na poziomie rośliny. Sekwencjonowanie DNA produktów PCR może zidentyfikować możliwe zmiany w sekwencjach DNA dla różnych ekotypów trawy cogan

Rozwój tej techniki zapewnia pierwszą uproszczoną metodę molekularną, która może dokładnie odróżnić dziki typ K od trawy od odwróconej formy jej ozdobnej odmiany japońskiej trawy krwistej. Zachęcamy użytkowników tego protokołu do skontaktowania się z nami w celu zgłoszenia wyników uzyskanych w wyniku korzystania z tego protokołu. Takie udostępnione informacje pomogą w dostarczeniu informacji na temat rozmieszczenia japońskiej trawy krwistej.

Pomoże to również organom regulacyjnym w USDA w podejmowaniu świadomych decyzji dotyczących działań, które mogą być potrzebne do obejścia rozprzestrzeniania się i potencjalnej hybrydyzacji wysoce inwazyjnych odmian trawy Cogan.