Name: Metoda genotypowania oparta na PCR w celu rozróżnienia między odmianami dzikimi i ozdobnymi Imperata cylindrica (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Poznaj metodę genotypowania PCR do rozróżniania dzikich i ozdobnych odmian Imperata cylindrica. Technika ta umożliwia szybką i ekonomiczną identyfikację gatunków inwazyjnych na podstawie różnic w regionie trnL-F.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alanowi Taskerowi (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephenowi Comptonowi (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craigowi Ramseyowi (USDA-APHIS, Fort Collins, CO) oraz Betty Marose (UMD) za pomoc w pozyskaniu okazów. Dziękujemy studentom Andrew’owi Adrianowi (UA-Huntsville) i Derekowi Thackerowi (UA-Huntsville) za pomoc w testowaniu tego protokołu, a Josephowi Herdy'emu za pracę przy nagrywaniu filmu. Praca ta była finansowana przez National Fish and Wildlife Foundation.

<ol><li>Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).</li>
<li>CABI, Crop Protection Compendium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCABI%2C++%22Commonwealth+Agricultural+Bureau+International+%28CABI%29%22">Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI)</a>. , Wallingford, UK. (2007).</li>
<li>MacDonald, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+-+Biology%2C+ecology%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).</li>
<li>Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Fort+Collins+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).</li>
<li>Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogongrass+in+the+United+States%3A+History%2C+ecology%2C+impacts%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management.</a> Weed Technology. 12, 737-743 (1998).</li>
<li>Chikoye, D., Ekeleme, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weed+flora+and+soil+seedbanks+in+fields+dominated+by+Imperata+cylindrica+in+the+moist+savannah+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa.</a> Weed Research. 41, 475-490 (2001).</li>
<li>Weber, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeber%2C+E+%22Invasive+Plant+Species+of+the+World%3A+A+Reference+Guide+to+Environmental+Weeds%22">Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds</a>. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).</li>
<li>Patterson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shading+effects+on+growth+and+partitioning+of+plant+biomass+in+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+from+shaded+and+exposed+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats.</a> Weed Science. 28, 735-740 (1980).</li>
<li>Cole, J. T., Cole, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ornamental+grass+growth+response+to+three+shade+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Horticulture%22%5BJournal%5D)">Ornamental grass growth response to three shade intensities.</a> Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).</li>
<li>Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+exposure+period+to+heat+on+cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability.</a> Weed Technology. 21, 141-144 (2007).</li>
<li>Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+Dynamics+and+Genotypic+Diversity+of+Cogongrass+%28Imperata+cylindrica%29+at+the+Point+of+Introduction+in+the+Southeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Invasive+Plant+Science+and+Management%22%5BJournal%5D)">Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States.</a> Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).</li>
<li>Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTalley%2C+SM+%22CPHST+Laboratory+2009+Annual+Report%22">CPHST Laboratory 2009 Annual Report</a>. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).</li>
<li>Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetics+of+Miscanthus%2C+Saccharum+and+related+genera+%28Saccharinae%2C+Andropogoneae%2C+Poaceae%29+based+on+DNA+sequences+from+ITS+nuclear+ribosomal+DNA+and+plastid+trnLintron+and+trnL-F+intergenic+spacers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Res%22%5BJournal%5D)">Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers.</a> J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).</li>
<li>Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+DNA+barcodes+to+identify+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Use of DNA barcodes to identify flowering plants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).</li>
<li>Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+relationships+in+southern+African+chloridoid+grasses+%28Poaceae%29+based+on+nuclear+and+chloroplast+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Systematics+and+Biodiversity%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data.</a> Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).</li>
<li>Brody, J. R., Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+boric+acid%3A+a+Tris-free%2C+cooler+conductive+medium+for+DNA+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis.</a> BioTechniques. 36, 214-216 (2004).</li>
<li>Chou, C. -H., Tsai, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+intergenic+spacer+of+ribosomal+DNA+of+Imperata+cylindrica+%28L.%29+Beauv.+var.+major+%28Cogongrass%29+populations+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Bulletin+of+Academia+Sinica+%28Taipei%29%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan.</a> Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Amerykański przemysł szkółkarski i ogrodniczy opiera się na uprawie i sprzedaży egzotycznych i nowych gatunków roślin. To, w połączeniu z rosnącą globalizacją handlu, zwiększa prawdopodobieństwo, że inwazyjny gatunek rośliny przedostanie się do USA, zakorzeni się i rozprzestrzeni. Możliwość federalnej regulacji takich roślin zależy od informacji, które często nie są dostępne, w tym od potencjału do stania się inwazyjnym, poprawnej taksonomii oraz odrębności genetycznej od taksonów rodzimych i znaturalizowanych. Ponieważ nasza wiedza na temat roślin inwazyjnych jest często ograniczona, importowano rośliny o ukrytych cechach inwazyjnych, aby dopiero później odkryć, że niszczą one nasze zasoby rolnicze i naturalne. Niniejszy protokół ma na celu rozwiązanie takich problemów związanych z odmianami I. cylindrica poprzez przedstawienie pierwszej uproszczonej metody molekularnej, która pozwala precyzyjnie odróżnić dziką formę trawy cogon od formy powrotnej jej ozdobnego odpowiednika JBG.
Do opracowania niniejszego protokołu w czerwcu 2008 roku pobrano cogongrass typu dzikiego z populacji znaturalizowanych w jednostce leśnej Pond Creek w hrabstwie Santa Rosa w pobliżu Jay, FL. JBG pozyskano w czerwcu 2008 roku z komercyjnej szkółki (Bluebird Nursery, Inc.) oraz z kolekcji prywatnej w Columbia, MO. Rewersanty JBG pobrano w czerwcu 2008 roku z dziedzińca Muzeum Geologicznego Campbella na Uniwersytecie Clemson, SC; w czerwcu 2009 roku z University Park w Riverdale, MA; oraz w 2009 roku z przedogródka prywatnego właściciela w Columbia, MO (zidentyfikowane przez Lelanda Cseke). Wszystkie rośliny utrzymywano w szklarni znajdującej się na Uniwersytecie Alabamy w Huntsville (Huntsville, AL).
Sekwencjonowanie genetyczne DNA pobranego z tych roślin obejmowało szczegółowe porównania 9 niezależnych regionów DNA powszechnie stosowanych do kodowania kreskowego roślin2. We wszystkich przypadkach sekwencje JBG były w 100% zgodne z sekwencjami powrotnych form JBG, co pomogło potwierdzić, że JBG rzeczywiście powraca do zielonej, inwazyjnej formy. Jedynie jądrowe regiony ITS oraz chloroplastowe regiony trnL-F wykazują różnice, które mogą być wykorzystane do genetycznego rozróżnienia między cogongrass a JBG. Region ITS posiada łącznie 3 SNP (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu) pomiędzy cogongrass a JBG, natomiast region trnL-F posiada 2 SNP oraz 2 InDel (insercje i delecje). Różnice genetyczne te pozwoliły na opracowanie specyficznych dla danej odmiany starterów PCR, które umożliwiają rozróżnienie między cogongrass typu dzikiego a powrotnymi formami JBG. Najbardziej wiarygodne wyniki uzyskano przy użyciu starterów pochodnych z plastydowego regionu trnL-F. Zatem niniejszy protokół opiera się na różnicach w sekwencjach regionów trnL-F genomu chloroplastowego cogongrass, JBG oraz powrotnego JBG (Rycina 4).
Aby pomóc w zaprojektowaniu starterów o większej specyficzności względem analizowanych odmian oraz uniknąć wyników fałszywie dodatnich pochodzących od blisko spokrewnionych gatunków, wszystkie znane sekwencje trnL-F odmian I. cylindrica porównano z sekwencjami trnL-F pokrewnych gatunków traw (43 niezależne sekwencje z 29 gatunków, np., Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix lacryma-jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, Sorghum halepense). Chociaż przeanalizowano sekwencje starterów specyficznych dla odmian w obrębie 29 gatunków traw, specyficzność tych starterów nie została kompleksowo zbadana pod kątem zdolności do amplifikacji DNA z większości pozostałych gatunków traw. W związku z tym tkanka wykorzystywana do ekstrakcji DNA powinna zostać starannie zidentyfikowana jako I. cylindrica przed rozpoczęciem niniejszego protokołu. Jeśli trawy nie można jednoznacznie zidentyfikować jako cogongrass lub JBG, sugerujemy sekwencjonowanie produktu PCR, aby upewnić się, że sekwencje dokładnie odpowiadają cogongrass lub JBG. Obecnie najdokładniejszą metodą weryfikacji tożsamości danego okazu trawy jest przeprowadzenie PCR dla regionów trnL-F oraz ITS, a następnie weryfikacja sekwencji produktów PCR i porównanie ich z sekwencjami znanymi dla dokładnie zidentyfikowanych taksonów. DNA można amplifikować za pomocą starterów kontrolnych opisanych w niniejszym protokole (dla regionu trnL-F) lub innych starterów dostępnych w innych publikacjach13-15. Sekwencjonowanie jest znacznie bardziej pracochłonne i kosztowne niż zastosowanie naszej uproszczonej procedury.
Jakość starterów wykorzystywanych w reakcji PCR ma krytyczne znaczenie dla powodzenia procedury. Startery do niniejszej procedury zostały udostępnione przez firmę Oblique Bio, Inc. (<a href="http://www.obliquebio.com/web/" target="_blank">http://www.obliquebio.com/web/</a>, Huntsville, AL). Przewagą zamawiania starterów w Oblique Bio jest to, że firma ta przechowuje dużą liczbę alikwotów każdego startera z tej samej serii produkcyjnej, co startery użyte przez nas do optymalizacji w naszym laboratorium. W rezultacie startery mają nie tylko tę samą sekwencję, ale pochodzą z dokładnie tej samej partii produkcyjnej, która została wykorzystana w tym protokole. Stosowanie starterów z tej samej partii pozwala uniknąć dodatkowych zmiennych w procedurze, które mogą wynikać z różnic w jakości starterów do PCR. Podobnie, choć inne polimerazy Taq powinny sprawdzić się w PCR, jakość użytej polimerazy Taq wpłynie na jakość wyników PCR. Aby zapewnić lepszą spójność odczynników do PCR, zoptymalizowaliśmy protokół, korzystając z odczynników firmy Clontech. Polimeraza Advantage 2 (Clontech, Mountain View, CA, nr kat. 639201 lub 639202) jest mieszaniną wydajnej polimerazy Taq typu hot-start oraz enzymu korygującego (proof-reading), co pomaga zapewnić wysoką specyficzność i bardziej precyzyjne amplifikacje.
Ponieważ protokół ten opiera się na DNA chloroplastowym, które u traw jest dziedziczone w linii żeńskiej, zdarzenia hybrydyzacji między genotypami cogongrass i JBG mogą nie zostać wykryte za pomocą naszej procedury identyfikacji molekularnej. W przypadkach, gdy podejrzewa się hybrydyzację, zalecamy zastosowanie regionów jądrowych, które są dziedziczone od obojga rodziców. Najczęściej stosowanym zmiennym regionem nieplastydowym rozważanym w genotypowaniu roślin jest jądrowy region ITS rybosomalny13-15,17. Obecnie pracujemy nad wprowadzeniem multipleksowania amplifikacji regionu chloroplastowego trnL-F wraz z regionem jądrowym ITS w jednej probówce PCR. Multipleksowanie regionów DNA plastydowego i jądrowego mogłoby potencjalnie obejść ograniczenia wynikające ze stosowania każdego z nich z osobna; jednak takie metody wymagają optymalizacji i dodatkowej oceny w celu określenia ich wykonalności w każdym konkretnym przypadku. Oceniane są również zastosowania ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) oraz nowszych technologii, takich jak sondy molekularne (fluorescencyjne sondy starterowe), jako niezawodne i dokładne metody genotypowania roślin.
Przedstawiony tutaj protokół zapewnia szybkie i niezawodne podejście do odróżnienia rewerty JBG od dzikiego typu trawy cogon. Zachęcamy użytkowników tego protokołu do kontaktu z nami w celu zgłoszenia wyników uzyskanych dzięki jego zastosowaniu. Tak udostępnione dane pomogą w określeniu rozprzestrzenienia się rewerty JBG. Pomoże to również organom regulacyjnym USDA w podejmowaniu świadomych decyzji dotyczących działań, które mogą być konieczne, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się i potencjalnej hybrydyzacji wysoce inwazyjnych odmian trawy cogon.

<table><tbody><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104 lub 69106</td><td>Wszelki renomowany zestaw do izolacji genomowego DNA roślin, który pozwala na uzyskanie DNA dobrej jakości, powinien być odpowiedni do tych procedur.</td></tr><tr><td>trnF(GAA)-F</td><td>Oblique Bio, Inc.</td><td>3-0578</td><td>Forwardowy starter kontroli pozytywnej</td></tr><tr><td>trnL(5&amp;rsquo; exon)-C</td><td>Oblique Bio, Inc.</td><td>3-0579</td><td>Reverse'owy starter kontroli pozytywnej</td></tr><tr><td>trnLF-C-F1</td><td>Oblique Bio, Inc.</td><td>3-0864</td><td>Forwardowy starter dla dzikiego typu cogongrass</td></tr><tr><td>trnLF-C-R1</td><td>Oblique Bio, Inc.</td><td>3-0865</td><td>Reverse'owy starter dla dzikiego typu cogongrass</td></tr><tr><td>trnLF-R-F2</td><td>Oblique Bio, Inc.</td><td>3-0866</td><td>Forwardowy starter dla JBG i rewerty JBG</td></tr><tr><td>trnLF-R-R2</td><td>Oblique Bio, Inc.</td><td>3-0867</td><td>Reverse'owy starter dla JBG i rewerty JBG</td></tr><tr><td>Advantage UltraPure PCR dNTP Mix</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639125</td><td> </td></tr><tr><td>Advantage 2 Polymerase</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639201 lub 639202</td><td>Wysokiej jakości polimeraza Taq typu hot-start z aktywnością korekcyjną (proof-reading)</td></tr></tbody></table>

metoda genotypowania oparta na pcr do rozróżniania odmian dzikich i ozdobnych imperata cylindrica

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Dziki typ I. cylindrica (trawa słoniowa) jest jedną z dziesięciu najgroźniejszych roślin inwazyjnych na świecie, negatywnie wpływającą na zasoby rolnicze i naturalne w 73 krajach w Afryce, Azji, Europie, Nowej Zelandii, Oceanii i obu Amerykach1-2. Trawa słoniowa tworzy szybko rozprzestrzeniające się, monodominujące zbiorowiska, które wypierają szeroką gamę rodzimych gatunków roślin, a w konsekwencji zagrażają rodzimym zwierzętom, które dla pożywienia i schronienia są zależne od tych gatunków. Co więcej, odmiana ozdobna [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] jest szeroko sprzedawana pod nazwami Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron oraz japońska trawa krwi (JBG). Odmiana ta jest uważana za sterylną i nieinwazyjną oraz pożądana jako roślina ozdobna ze względu na czerwone liście. Jednak w odpowiednich warunkach JBG może wytwarzać żywotne nasiona (Carol Holko, 2009 komunikacja osobista) i może powrócić do zielonej formy inwazyjnej, która często jest nieodróżnialna od trawy słoniowej, ponieważ przejmuje ona charakterystyczne cechy dzikiego typu inwazyjnego4 (Rysunek 1). Sprawia to, że identyfikacja morfologiczna jest trudnym zadaniem, nawet dla doświadczonych taksonomów roślin. Powrót JBG do agresywnego zielonego fenotypu nie jest również zjawiskiem rzadkim. Wykorzystując porównania sekwencji regionów kodujących i zmiennych w DNA jądrowym i chloroplastowym, potwierdziliśmy, że JBG powróciła do formy zielonej inwazyjnej w stanach Maryland, Karolina Południowa i Missouri. JBG była sprzedawana i sadzona niemal w każdym stanie kontynentalnych USA, w których nie występuje aktywna infestacja trawy słoniowej. Skala problemu powrotu do formy dzikiej nie jest dobrze zbadana, ponieważ rośliny te pozostają nieudokumentowane i często są niszczone.
Zastosowanie niniejszego protokołu molekularnego zapewnia metodę identyfikacji powrotów JBG i może pomóc zapobiec współwystępowaniu oraz możliwej hybrydyzacji tych odmian. Trawa cogon jest obligatoryjnym zdalnym zapylaczem i po skrzyżowaniu z innym genotypem może wytworzyć zdolne do kiełkowania, roznoszone przez wiatr nasiona, które rozprzestrzeniają tę roślinę na duże odległości5-7. JBG posiada nieco inny genotyp niż trawa cogon i może być w stanie tworzyć zdolne do przeżycia hybrydy z trawą cogon. Co więcej, JBG jest bardziej tolerancyjna na zimno i cień niż trawa cogon8-10, a przepływ genów między tymi dwiema odmianami prawdopodobnie doprowadzi do powstania hybryd bardziej agresywnych, tolerujących cień i odpornych na zimno niż trawa cogon typu dzikiego. Podczas gdy trawa cogon typu dzikiego zajmuje obecnie ponad 490 milionów hektarów na całym świecie, w południowo-wschodnich stanach USA zajmuje ona ponad 500 000 hektarów i jest w stanie opanować większość obszaru USA, ponieważ szybko rozprzestrzenia się na północ ze względu na szeroką niszę ekologiczną i potencjał geograficzny3,7,11. Potencjał krzyżowania genetycznego jest poważnym problemem dla Federal Noxious Weed Program organizacji USDA-APHIS. Obecnie USDA-APHIS zakazuje uprawy JBG w stanach, w których występują poważne inwazje trawy cogon (np. Floryda, Alabama, Missisipi). Jednak zapobieganie łączeniu się tych dwóch odmian może okazać się trudniejsze w miarę rozszerzania się zasięgu występowania trawy cogon i JBG. Co więcej, dystrybucja powrotów JBG jest obecnie nieznana, a bez możliwości identyfikacji tych odmian za pomocą morfologii, niektóre inwazje trawy cogon mogą być wynikiem powrotów JBG. Niestety, obecne molekularne metody identyfikacji opierają się zazwyczaj na AFLP (polimorfizmie długości fragmentów amplifikowanych) i sekwencjonowaniu DNA, z których obie są czasochłonne i kosztowne. Przedstawiamy tutaj pierwszą kosztowo efektywną i niezawodną metodę genotypowania molekularnego opartą na PCR, która pozwala precyzyjnie odróżnić trawę cogon od powrotów JBG.

Przedstawiamy tani i szybki protokół genotypowania molekularnego, który wykorzystuje specyficzne dla odmiany startery PCR celujące w różnice w sekwencji DNA w obrębie regionu spacerowego trnL-F chloroplastu, aby odróżnić odmiany Imperata cylindrica (trawa cogon), których nie można rozpoznać wyłącznie na podstawie morfologii. Odmiany te obejmują wpisaną na listę federalną roślinę inwazyjną, trawę cogon, oraz blisko spokrewnioną, powszechnie występującą odmianę ozdobną, I. cylindrica var. koenigii (trawa japońska).

Metoda genotypowania oparta na PCR do rozróżniania odmian dzikich i ozdobnych Imperata cylindrica

Dzika odmiana I. cylindrica (trawa cogon) należy do dziesięciu najgroźniejszych roślin inwazyjnych na świecie, negatywnie wpływając na zasoby rolnicze i naturalne w...

Głównym celem niniejszej procedury jest zapewnienie kosztowo efektywnego i szybkiego protokołu genotypowania molekularnego, który pozwala na rozróżnienie odmian Retta cylindrica, powszechnie nazywanej trawą gon, których nie można odróżnić wyłącznie na podstawie morfologii. Osiąga się to poprzez uprzednią identyfikację i izolację tkanki z interesującej odmiany trawy gon. Kolejnym krokiem jest ekstrakcja DNA jądrowego i plazmidowego z pobranej tkanki.Następnie przeprowadza się reakcję łańcuchową polimerazy na wyekstrahowanym DNA, wykorzystując primery specyficzne dla danej odmiany, które celują w różnice sekwencji w regionie PLAs turn LF, a także odpowiednie kontrole pozytywne i negatywne. Ostatnim krokiem jest wykonanie elektroforezy żelowej dla każdej z czterech reakcji PCR w celu wizualizacji amplifikowanych produktów PCR. Ostatecznie odmiana zebranego trawy gon określa się poprzez analizę wynikowych prążków produktów PCR specyficznych dla odmiany na żelu. Gatunki inwazyjne kosztują Stany Zjednoczone około 3,4 miliarda rocznie, wyrządzając znaczne szkody zarówno w zasobach rolniczych, jak i naturalnych.Dziki typ Imperata cylindrica, znany również jako trawa Cogana, znajduje się wśród 10 najgroźniejszych inwazyjnych chwastów na świecie. Trawa Cogana szybko rozprzestrzenia się, tworząc monokultury, które wypierają rodzimą roślinność, a w konsekwencji zwierzęta zależne od tej roślinności. Trawa ta zajmuje obecnie 490 milionów hektarów na całym świecie i około 500 000 hektarów w Stanach Zjednoczonych. Odmiana ozdobna Imperata cylindrica jest szeroko sprzedawana pod nazwami Imperata cylindrica, Arbra, Red Baron oraz Japanese Blood Grass, którą będziemy nazywać JBG. Odmiana ta jest prawdopodobnie sterylna i nieinwazyjna i jest ceniona ze względu na czerwone liście.W określonych warunkach japońska trawa krwawa może wytwarzać zdolne do kiełkowania nasiona i powrócić do formy całkowicie zielonej, nieodróżnialnej od dzikiego typu trawy cogan. Jak widać, obie posiadają zielone liście i są większe niż tradycyjna odmiana ozdobna, charakteryzując się większymi liśćmi. Dodatkowo, rośliny powrócone do formy pierwotnej oraz dziki typ mają większe kłącza, co zwiększa ich potencjał rozmnażania bezpłciowego w porównaniu z odmianą ozdobną.Powrót do pierwotnych cech sprawia, że identyfikacja oparta wyłącznie na morfologii staje się trudnym zadaniem. Metody molekularne umożliwiają dokładne rozróżnienie inwazyjnych roślin oraz materiałów roślinnych, których nie można zidentyfikować za pomocą standardowych metod wizualnych.Metody molekularne są kluczowe w zapobieganiu rozprzestrzenianiu się i wprowadzaniu roślin inwazyjnych. Zastosowanie niniejszego protokołu molekularnego umożliwia dokładne odróżnienie osobników powrotnych japońskiej trawy krwawiącej od trawy Kogana. Protokół ten może pomóc zapobiec współwystępowaniu z trawą Kogana oraz możliwemu powstawaniu żywotnych hybryd.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów (AFLP) czy sekwencjonowanie DNA, jest fakt, że stanowi ona bardzo kosztowo efektywną i szybką metodę genotypowania molekularnego, która pozwala z łatwością odróżnić trawę kogan typu dzikiego od odmian japońskiej trawy krwawiącej. Technikę zaprezentuje Joseph Hery, student z naszego laboratorium. Najpierw należy zidentyfikować okaz z miejsca, w którym rosną trawa kogan lub japońska trawa krwawiąca i konieczne jest ich rozróżnienie.Japońska trawa krwawa jest łatwo odróżnialna od dzikiego typu trawy Kogan dzięki jaskrawoczerwonym liściom. Jednak powrót do typu dzikiego u japońskiej trawy krwawej jest niemal niedośróżnialny od trawy Kogan, ponieważ obie mają dłuższe zielone liście, większą powierzchnię liści oraz większe kłącza niż ozdobna japońska trawa krwawa. Niniejsza metoda może być stosowana do świeżych, zamrożonych i niedawno wysuszonych tkanek liści.W przypadku przechowywania tkanek do późniejszej ekstrakcji DNA najlepszą metodą jest ich natychmiastowe zamrożenie i przechowywanie w temperaturze minus 80 °C. Jeśli wymagane jest przechowywanie na sucho, należy umieścić tkankę w papierowej kopercie, a następnie przechowywać kopertę w odwodnionym żelu krzemionkowym lub innych aktywnych środkach osuszających w temperaturze pokojowej. W przypadku użycia świeżej tkanki należy upewnić się, że ekstrakcja DNA zostanie przeprowadzona w ciągu trzech godzin od pobrania, aby zapobiec degradacji.W niniejszej procedurze zastosowano zestaw mini DNEZ plants firmy Kyogen zgodnie z instrukcją producenta z jedną niewielką modyfikacją. Procedura została dostosowana tak, aby wykorzystać ponad 100 mg świeżej lub zamrożonej tkanki lub ponad 20 mg tkanki wysuszonej. Najpierw należy rozetrzeć ponad 100 mg świeżego lub zamrożonego liścia lub ponad 20 mg wysuszonego liścia na drobny proszek, stosując trzykrotne schładzanie ciekłym azotem podczas rozcierania w schłodzonej moździerzu z tłuczkiem.Odważ zamrożony proszek z tkanki świeżej lub mrożonej w ilościach 100 mg na każdą aلیکwot. W przypadku użycia suchej tkanki liściowej odważ proszek w ilościach 20 mg na każdą alikwot. Po tym kroku przeprowadź ekstrakcję DNA zgodnie z instrukcjami producenta, wykorzystując spektrofotometr, np. poprzez test spektrofotometryczny NanoDrop; dobra wydajność DNA pod względem jakości i ilości powinna wynosić od 50 do 150 ng/µl, a stosunki 260/280 oraz 230/280 powinny być bliskie wartości 2,0, jak pokazano tutaj.Przeprowadź elektroforezę z użyciem standardowego żelu AROS 1%. Zweryfikuj obecność stosunkowo dużych prążków powyżej 10 KB z niewielkim lub żadnym smużeniem wynikającym z kontaminacji RNA; jeśli stężenie DNA jest wysokie, rozcieńcz próbki do 70 nanogramów na mikrolitr przed kolejnymi etapami. Startery PCR użyte w tym protokole, wskazane czerwonymi i zielonymi strzałkami, opierają się na różnicach sekwencji między regionem spacera LF w obrębie plastidów u genotypów Cogan grass oraz Japanese blood grass.Różnice te występują w postaci polimorfizmów pojedynczego nukleotydu oraz insercji i delecji, wskazanych czarnymi strzałkami pionowymi, co umożliwia opracowanie starterów specyficznych dla danej odmiany. Dzięki rozmieszczeniu starterów w miejscach unikalnych sekwencji, ich sekwencje zostały zawarte w pisemnej części protokołu dla każdej wyizolowanej próbki DNA; należy przygotować dwie reakcje PCR o objętości 50 µL w 0,2 ml cienkościennych probówkach do PCR w warunkach chłodzenia (na lodzie), używając każdego zestawu starterów zgodnie z pisemnym protokołem. Jeśli stężenie DNA jest niskie, do każdej reakcji można dodać więcej DNA, korygując ilość nukleazowej, dwukrotnie destylowanej wody w taki sposób, aby całkowita objętość reakcji pozostała na poziomie 50 µL.Należy użyć nie więcej niż pięciu mikrolitrów DNA lub 10% całkowitej objętości na jedną reakcję, ponieważ zanieczyszczenia zawarte w próbkach DNA mogą hamować reakcje PCR; aby upewnić się, że wszystkie odczynniki do PCR działają prawidłowo, należy przygotować kontrolę pozytywną. Używając starterów do kontroli pozytywnej, należy przygotować kontrolę negatywną z tym samym zestawem starterów co w kontroli pozytywnej, ale z zastosowaniem wody dwukrotnie destylowanej zamiast wyekstrahowanego DNA; w tym punkcie dla każdej badanej próbki przygotowano łącznie cztery reakcje PCR. Następnie należy przeprowadzić amplifikację PCR w termocyklerze wyposażonym w podgrzewaną pokrywę, stosując parametry cykli PCR opisane w protokole pisemnym; w zależności od jakości DNA, starterów, polimerazy Taq lub rodzaju użytego termocyklera, konieczna może być optymalizacja temperatury przyłączania starterów, czasu elongacji oraz liczby cykli.Po zakończeniu reakcji PCR produkty PCR należy rozdzielić na żelu 1% przy użyciu standardowej elektroforezy. Próbki należy prowadzić przy napięciu około 120 V, aż front barwnika dotrze do trzech czwartych całkowitej długości żelu. Żel należy wizualizować w świetle UV i sprawdzić powstałe prążki, aby potwierdzić amplifikację odpowiedniego fragmentu DNA.Ten reprezentatywny żel przedstawia wyniki elektroforezy produktów PCR uzyskanych z próbek DNA trawy Kogan, trawy japońskiej (Japanese blood grass) oraz trawy japońskiej revert, połączonych ze specyficznymi starterami dla trawy Kogan i JBG, a także dodatnią kontrolą turn LF i ujemną kontrolą bez matrycy. Zestaw starterów dla dodatniej kontroli turn LF działa równie skutecznie w przypadku trawy Kogan, trawy japońskiej, trawy japońskiej revert oraz innych traw, dając prążek o długości 890 par zasad. Jeśli wszystkie odczynniki do PCR są wolne od zanieczyszczeń DNA, reakcja kontrolna ujemna nie przyniesie produktu PCR.Jeśli próbka DNA pochodzi z trawy kogan typu dzikiego, reakcja PCR z zastosowaniem zestawu starterów specyficznych dla trawy kogan spowoduje powstanie pojedynczego prążka o długości około 595 par zasad, natomiast startery specyficzne dla JBG nie wykażą żadnego prążka. Analogicznie, jeśli próbka DNA pochodzi z JBG lub z odwróconej reakcji J-B-G-A-P-C-R, zastosowanie zestawu starterów specyficznych dla JBG spowoduje powstanie pojedynczego prążka o długości około 594 par zasad, podczas gdy startery specyficzne dla trawy kogan nie wykażą żadnego prążka.Ponieważ JBG i powrócone JBG mają identyczną sekwencję kwasów nukleinowych, będą one wykazywać identyczne wzory prążkowania. Jednak różnice morfologiczne między JBG a powrotami JBG są dość wyraźne, więc mimo że wyniki PCR będą takie same, odmiany JBG są łatwe do rozróżnienia na poziomie rośliny. Sekwencjonowanie DNA produktów PCR może pozwolić na zidentyfikowanie ewentualnych zmian w sekwencjach DNA dla różnych ekotypów trawy cogon.Opracowanie tej techniki dostarcza pierwszej uproszczonej metody molekularnej, która pozwala na dokładne rozróżnienie między dzikim typem K and grass a formą powrotną jego odmiany ozdobnej, jaką jest Japanese blood grass. Zachęcamy użytkowników tego protokołu do kontaktu z nami w celu zgłoszenia wyników uzyskanych dzięki zastosowaniu tej procedury. Tak udostępnione dane pomogą w gromadzeniu informacji na temat rozpowszechnienia Japanese blood grass.Pomoże to również organom regulacyjnym w USDA w podejmowaniu świadomych decyzji dotyczących działań, które mogą być niezbędne, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się i potencjalnej hybrydyzacji wysoce inwazyjnych odmian trawy Cogana.

a-pcr-based-genotyping-method-to-distinguish-between-wild-type

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda genotypowania oparta na PCR do rozróżnienia odmian dzikich i ozdobnych Imperata cylindrica

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Opisujemy metodę multipleksowej reakcji PCR do szybkiego wykrywania serowarów Salmonella enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium. Konkretne serowary Salmonella można zidentyfikować, kierując multipleksową reakcję PCR na geny i sekwencje unikalne dla klastra biosyntezy antygenu O oraz flagelliny danego serowaru. Następnie izolatowi Salmonella przypisuje się serowar na podstawie pojawienia się specyficznych amplikonów (produktów PCR) o określonej wielkości, odpowiadających...

PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Przedstawiona tutaj metoda Direct PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych tkanek roślinnych i zwierzęcych.

Genotypowanie próbek roślinnych i zwierzęcych bez uprzedniego oczyszczania DNA

Tutaj prezentujemy protokół śledzenia zanieczyszczenia genomowym DNA (gDNA) w próbkach RNA. W prezentowanej metodzie wykorzystuje się startery specyficzne dla wewnętrznego transkrybowanego regionu dystansowego (ITS) genów rybosomalnego DNA (rDNA). Metoda ta nadaje się do niezawodnego i czułego wykrywania zanieczyszczenia DNA u większości eukariontów i prokariontów.

Ocena zanieczyszczenia DNA w próbkach RNA na podstawie rybosomalnego DNA

W tym artykule prezentujemy protokół, który jest opisany jako analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) oparta na docelowych lokalnych zmianach w genomach (TILLING). Metoda ta wykorzystuje zmiany fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA i nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych zarówno insercji/delecji (Indel), jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS).

Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING

Przedstawiamy metodologię ustalania wymagań dotyczących zapylania odmian moreli (Prunus armeniaca L.), łącząc określenie samo(nie)zgodności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z identyfikacją genotypu S za pomocą analizy PCR.

Określenie relacji między sobą i między (nie)zgodnością w moreli za pomocą zapylania ręcznego, mikroskopii i analiz genetycznych

Prezentowany tutaj jest protokół do terenowej identyfikacji Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Ten łatwy do wykonania protokół jest idealny jako metoda potwierdzania tożsamości gatunku botanicznego w miejscach, w których dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony, takich jak gospodarstwa rolne i magazyny.

Identyfikacja terenowa Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR

Opisano metodologię określania wymagań dotyczących zapylania w mieszańcach japońskich śliwek, która łączy polowe i laboratoryjne zapylenia oraz obserwacje łagiewek pyłkowych pod mikroskopią fluorescencyjną z identyfikacją genotypów S metodą PCR i monitorowaniem kwitnienia w celu wyboru zapylaczy.

Ustalenie wymagań dotyczących zapylania śliwki japońskiej poprzez monitorowanie fenologiczne, zapylanie ręczne, mikroskopię fluorescencyjną i genotypowanie molekularne

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Ten protokół zapewnia szybką metodę określania zgodności i niezgodności pyłków w odmianach cytrusowych.

Określanie relacji samo(nie)zgodności i między (nie)zgodnością w cytrusach za pomocą ręcznego zapylania, mikroskopii i analiz genotypu S

Poznaj metodę genotypowania PCR do rozróżniania dzikich i ozdobnych odmian Imperata cylindrica. Technika ta umożliwia szybką i ekonomiczną identyfikację gatunków inwazyjnych na podstawie różnic w regionie trnL-F.

Metoda genotypowania oparta na PCR do rozróżniania odmian dzikich i ozdobnych Imperata cylindrica

Przeglądaj więcej filmów