Wyciszanie genów za pomocą RNAi oraz transgeneza poprzez mikroiniekcję u nekromenicznego nicienienia Pristionchus pacificus
16 października 2011
W organizmach modelowych transgeneza pozwala na manipulowanie funkcjami genów, podczas gdy RNAi umożliwia wyciszenie specyficznych transkryptów mRNA 1-2. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie technik niezbędnych do wprowadzenia stabilnie dziedziczonego DNA oraz przejściowego dwuniciowego RNA do nekromenicznego nicienia Pristionchus pacificus na potrzeby badań w dziedzinie biologii ewolucyjnej, rozwojowej i behawioralnej.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest skuteczna transformacja obcym DNA oraz wyciszenie funkcji genu u nicieni Priyanka Pacificus. W przypadku transgenezy należy rozpocząć od przygotowania odpowiedniego DNA genomicznego z kompatybilnymi lepkimi końcami.
W celu przeprowadzenia interferencji RNA należy zsyntetyzować gen zainteresowania przy użyciu zestawu do transkrypcji dwuniciowego RNA. Następnie należy mikroiniekować DNA lub dwuniciowe RNA do gonad PRIs DIANCA pacificus. Populację F1 należy przesiewać w celu wyłonienia wybranego fenotypu markera w przypadku transgenezy oraz wybranego fenotypu knockdown w przypadku interferencji RNA dla transgenezy.
Należy kontynuować monitorowanie wyników w drugiej generacji (F2) nicieni transgenicznych, aby uzyskać rezultaty wykazujące specyficzną ekspresję genów z wykorzystaniem reportera GFP w mikroskopii fluorescencyjnej. Witajcie, nazywam się Ray Hong z California State University of Northridge, a niniejsza demonstracja przedstawi etapy manipulacji genetycznej u specyficznych nicieni. W nowo powstających organizmach modelowych przeprowadzanie RNAi i transgenezy pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju i behawiorystyki poprzez charakteryzację funkcji i ekspresji genów.
Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą odniosą korzyść z obejrzenia sposobu rozmieszczania nicieni na podkładce do iniekcji oraz techniki wstrzykiwania w odpowiedniej płaszczyźnie ogniskowej, w której widoczne są gonady. W przeciwieństwie do innych gatunków, gonady C. elegans są specyficzne, ponieważ krzyżują się grzbietowo i migrują w miarę rozwoju nicienia z późnego stadium J4 w osobniki dorosłe. Ponadto do transgenów i markera ko-iniekcyjnego należy dodać genomowe DNA strawione kompatybilnymi enzymami restrykcyjnymi, aby przygotować mieszaninę do iniekcji.
W laboratorium Jessiki Single zostanie zaprezentowana mikroiniekcja w przypadku PRIs, konkretnie w celu transgenezy. Do iniekcji wymagane są konstrukty 3D NA, dominujący marker współiniekcji, docelowy transgen reporterowy oraz konstrukty genomicznego D-N-A-D-N-A, które są trawione za pomocą kompatybilnych enzymów restrykcyjnych. Konstrukty DNA są odzyskiwane przy użyciu protokołu wytrącania etanolem.
Mieszaninę do wtrysku przygotowuje się w stężeniach wymienionych w tabeli. Należy sprawdzić ustawienia manometru zbiornika z azotem. Następnie do igły nabiera się od jednego do dwóch µL mieszaniny do wtrysku.
Umieść igłę w manipulatorze do mikroiniekcji. Odłam końcówkę igły, lekko dotykając jej krawędzi cienko wyciągniętej rurki kapilarnej umieszczonej na szkiełku, a następnie ustaw ją w pozycji spoczynkowej. Teraz wlej olej parafinowy, aby przykryć płytkę z czterema młodymi dorosłymi nicieniami.
Wybierz jednego nicienia i przenieś go na podkładkę do iniekcji. Pod mikroskopem ustaw gonadę nicienia w kierunku igły, tak aby wulwa była skierowana w stronę przeciwną do igły. Następnie opuść igłę do pozycji widocznej w polu widzenia mikroskopu.
Ustaw górną część gonady i igłę w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Delikatnie nakłuj nicienia i wprowadź mieszaninę do iniekcji. Zauważ oddzielanie się jaj w kierunku dystalnego końca, co świadczy o prawidłowym wykonaniu iniekcji.
Zmień położenie igły, aby wstrzyknąć preparat do dolnej gonady, i powtórz iniekcję. Ponieważ gonada ta znajduje się pod jelitem, rozprzestrzenianie się jaj nie będzie widoczne, co utrudnia ocenę powodzenia iniekcji. Niemniej jednak, po wykonaniu zabiegu, nicień powinien pozostać w całości, bez wystających gonad.
Przywróć igłę do pozycji spoczynkowej. Dodaj kroplę buforu M9, aby odratować nicienia, używając bakterii OP 50 na pęsetce. Dotknij nicienia bakteriami OP 50 w taki sposób, aby przywarł do pęsetki.
Następnie przenieś nicienia na płytkę z kropelkami 50 µL bakterii OP 50. Przechowuj wstrzyknięte nicienie w temperaturze 20 °C przez około cztery dni, aby mogły złożyć jaja i wydać pokolenie F1. Następnie przeprowadź przesiew nicieni w celu wyselekcjonowania pożądanego fenotypu.
Wybrać pojedyncze osobniki F1 z obserwowanym fenotypem, przenieść je na nową płytkę z podłożem i przechowywać w temperaturze 25°C. W przypadku linii transgenicznych przenieść pojedyncze osobniki F2 na osobne płytki. Kolejne pokolenia przechowywać w temperaturze 20°C.
Manipulacja funkcją genów na poziomie organizmu za pomocą RNAi i transgenezy stanowi kluczowy aspekt modelu Ppac pacificus w biologii rozwoju ewolucyjnego. W porównaniu z nicieniem typu dzikiego po lewej stronie, stabilna linia transgeniczna F4 PPR L3 skutkuje dominującym fenotypem „roller”, wykazującym ekspresję GFP w neuronach głowy. Z kolei niniejszy eksperyment RNAi generuje mutanty PRL1, u których występuje całkowite wyciszenie lokomocji typu „rolling”, zwykle obserwowanej u mutanta z funkcją wzmocnioną PRL1 roller TU 92. Po opanowaniu techniki każda iniekcja może zostać wykonana w ciągu pięciu minut. Należy pamiętać, że wszystkie osobniki F2 z niezależnych transgenicznych linii roller F1 muszą zostać wyselekcjonowane pojedynczo w celu ustanowienia niezależnych linii F2.
Dzieje się tak, ponieważ stwierdziliśmy, że ekspresja GFP jest bardzo zmienna pomiędzy dwiema liniami F, a dziedziczenie fenotypu roller nie koreluje z poziomem ekspresji G.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje techniki wprowadzania stabilnie transmitowanego DNA oraz przejściowego dwuniciowego RNA do nekromenicznego nicienia Pristionchus pacificus. Metody te są niezbędne do manipulowania funkcjami genów oraz badania różnych procesów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Genetyka
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Transgeneza umożliwia manipulację funkcjami genów w organizmach modelowych.
- Interferencja RNA (RNAi) jest wykorzystywana do wyciszania specyficznych transkrypcji mRNA.
- Pristionchus pacificus służy jako model w badaniach ewolucyjnych i behawioralnych.
- Zrozumienie funkcji genów jest kluczowe dla poznania procesów rozwojowych.
Cel badania
- W celu skutecznej transformacji obcego DNA do organizmu Pristionchus pacificus.
- W celu wyciszenia funkcji genu z wykorzystaniem technik interferencji RNA.
- W celu ułatwienia badań z zakresu biologii ewolucyjnej, rozwojowej oraz behawioralnej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie genomowego DNA z kompatybilnymi lepkimi końcami do transgenezy.
- Synteza dwuniciowego RNA do interferencji RNA.
- Mikroiniekcja DNA lub dwuniciowego RNA do gonad Pristionchus pacificus.
- Przesiew populacji F1 pod kątem wybranych fenotypów markerowych.
Główne wyniki
- Skuteczna transformacja obcego DNA w nicieniach.
- Efektywne wyciszenie funkcji genu za pomocą RNAi.
- Identyfikacja zmian fenotypowych w pokoleniu F1.
- Wykazanie użyteczności Pristionchus pacificus w badaniach genetycznych.
Wnioski
- Opisane techniki są skuteczne w manipulacjach genetycznych u nicieni.
- Metody te mogą przyczynić się do rozwoju badań w różnych dziedzinach biologii.
- Pristionchus pacificus jest wartościowym organizmem modelowym do badania funkcji genów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie niezawodnej manipulacji genetycznej w nowo powstających organizmach modelowych, takich jak Pristionchus pacificus, rozszerza możliwości walidacji celów poza systemy tradycyjne. Metoda ta umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w odniesieniu do konserwatywnie ewolucyjnie szlaków poprzez bezpośredni knockdown genów oraz stabilną transgenezę. Wspiera ona rozwój modeli przedklinicznych, dostarczając systemu podatnego na manipulacje genetyczne do screeningu fenotypowego i odkrywania biomarkerów w testach opartych na nicieniach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wyciszanie za pomocą RNAi mutantów dominujących, takich jak prl-1(tu92), w celu oceny funkcji genu w fenotypach lokomocyjnych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalny protokół mikroiniekcji do generowania stabilnych linii transgenicznych wykazujących ekspresję reporterów GFP pod kontrolą promotorów specyficznych dla danych tkanek.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych, umożliwiając bezpośrednią obserwację efektów wyciszania genów na fenotypy neuronalne i mięśniowe w potomstwie F1.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie zsynchronizowanych populacji F1 odpowiednich do wysokoprzepustowego przesiewu fenotypów knockdown z wykorzystaniem markerów widocznych, takich jak lokomocja tocząca.
- Wynik ilościowy: Umożliwia ilościowe określenie ekspresji transgenu (np. GFP) w generacjach F2 na podstawie fluorescencji w celu przeprowadzenia analizy zależności dawka-odpowiedź oraz penetracji.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Ustanawia zestandaryzowany schemat mikroiniekcji, który można zastosować dla wielu transgenów i konstruktów RNAi u P. pacificus.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Wspiera badania nad konserwacją ewolucyjną szlaków neurogennych i metabolicznych istotnych dla modeli ludzkich chorób.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia przejście od wyciszenia genu w pokoleniu F1 do ustanowienia stabilnej linii w F2 w celu podłużnej oceny fenotypowej.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich w walidacji celu poprzez potwierdzenie powiązania fenotypu z genotypem za pomocą analizy ratunkowej (rescue) i segregacyjnej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi procesami badawczymi poprzez umożliwienie oceny funkcji genów przed identyfikacją wiodących związków, a uzyskane wyniki pozwalają na wybór celu i dalsze badania mechanistyczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez odwracalny knockdown genów oraz stabilną nadekspresję w celu wyjaśnienia zależności między genem a fenotypem.
- Przesiewy: Pozwala na generowanie gotowych do analizy szczepów transgenicznych z wykrywalnymi reporterami do badań nad czułością na związki chemiczne oraz interakcjami genetycznymi.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki fluorescencji oraz oceny fenotypowe w celu porównania warunków genetycznych i oceny penetracji.
- Badania translacyjne: Łączy manipulacje genowe z efektami fenotypowymi w systemie o zachowanych szlakach rozwojowych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia przenaszalną platformę mikroiniekcyjną do iteracyjnej walidacji celów w wielu genach i szczepach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez umożliwienie bezpośredniej perturbacji genetycznej w genetycznie podatnym modelu nicieni.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne protokoły transgenezy i RNAi z określonymi parametrami wtryskiwania oraz harmonogramami przesiewowymi.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach sygnałowych celu dzięki ratowaniu fenotypu i segregacji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o konserwatywną funkcję i możliwość modyfikacji farmakologicznej w modelach odległych ewolucyjnie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach sekcji nicieni oraz mikrowstrzykiwania w celu dostarczenia materiału specyficznie do gonad.
- Zależne od aparatury do mikrowstrzykiwania, regulacji ciśnienia azotu oraz przygotowania igieł kapilarnych.
- Wymaga standaryzowanych protokołów przygotowania DNA/RNA, w tym trawienia restrykcyjnego i wytrącania etanolem.
- Wymaga koordynacji międzyzespołowej w zakresie utrzymania szczepów, screeningu fenotypowego i śledzenia pokoleń.
- Ograniczone przez ventralną migrację gonad didelphicznych, co wymaga obustronnego wstrzykiwania dla zapewnienia spójnej transmisji w linii zarodkowej.
