Name: Nokautyzacja i transgeneza genów za pośrednictwem RNAi przez mikroiniekcję u nekromenic Pristionchus pacificus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Naucz się technik nokautyzacji i transgenezy genów za pomocą mikroiniekcji RNAi u nicienia Pristionchus pacificus. Metody te umożliwiają badanie funkcji genów w biologii rozwoju i ewolucji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są bardzo wdzięczni RJ Sommer oraz X Wang za pomoc przy mikroiniekcji, a także anonimowym recenzentom za wnikliwe uwagi. Praca ta jest finansowana z grantu NIH SC2GM089602.

1. Transgeneza: przygotowanie DNA
<ol>
 <li>Dominantny marker współwstrzykiwania: pRL3 [Ppa-prl-1(tu92)] 
 Plazmid pRL3 jest dominantnym markerem współwstrzykiwania służącym do wizualnej identyfikacji pomyślnych zdarzeń transformacji. Plazmid ten koduje dominantny allel mutantowy (tu92) genu Ppa-prl-1, ściśle spokrewnionego z genem kolagenu sqt-1 u C. elegans, i zmienia dziki typ sinusoidowego poruszania się w ruchy skręcania zgodnie z ruchem wskazówek zegara wzdłuż osi ciała nicienia1,5. Transformowane zwierzę jest bardzo podobne do popularnego dominantnego markera selekcyjnego rol-6 (su1006) stosowanego u C. elegans przez ostatnie 20 lat.</li>
 <li>Docelowy transgen reporterowy: Ppa-egl-4p::gfp 
 Geny zainteresowania mogą być powiązane transkrypcyjnie lub translacyjnie z sekwencją kodującą GFP9. W niniejszym badaniu zastosowano Ppa-egl-4promoter::gfp (egl-4, kinaza białkowa zależna od cGMP), aby ustalić, czy fragment o długości 2 kb znajdujący się powyżej miejsca rozpoczęcia translacji może warunkować ekspresję GFP u P. pacificus PS312. Ten wektor GFP zawiera region kodujący GFP z zmodyfikowanymi 
 intronami oraz wielofunkcyjny terminator Ppa-rpl-23 3' UTR5, udostępniony przez Xiaoyue Wang i Ralf J. Sommer (Instytut Maxa Plancka, Tuebingen, Niemcy, UE).</li>
 <li>DNA genomowe: PS312 
 Dodatek DNA genomowego dzikiego typu P. pacificus PS312 jest niezbędny do uzyskania stabilnego dziedziczenia transgenu, w szczególności z transgenicznych zwierząt F1 na ich potomstwo F25. Nie jest jeszcze pewne, czy DNA genomowe tworzy złożone macierze pozachromosomalne z dwoma transgenami (markerem współwstrzykiwania pRL-3 i reporterem Ppa-egl-4p::gfp) podobnie jak obserwowane w stabilnych transgenicznych liniach F2 u C. elegans3. Jednak wymóg, aby DNA genomowe i transgeny posiadały identyczne lepkie końce, silnie sugeruje tworzenie złożonych macierzy pozachromosomalnych, które komórki gospodarza mogą rozpoznać w celu prawidłowej transmisji DNA (gDNA przygotowane przy użyciu zestawu Sigma G1N10).</li>
 <li>Trawienie DNA 
 Enzymy restrykcyjne są używane do linearyzacji DNA wektora Ppa-egl-4p::gfp oraz do wytworzenia lepkich końców kompatybilnych z markerem współwstrzykiwania pRL3 i gDNA PS312. Mieszać poprzez delikatne opukiwanie, nie używać wirówki typu vortex. Inkubować przez jedną godzinę w 37°C.</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>pRL3</td>
 <td>4 μg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bufor 10x</td>
 <td>10 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PstI (10 U/μl)</td>
 <td>4 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>~</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suma:</td>
 <td>100 μL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ppa-egl-4p::gfp</td>
 <td>4 μg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bufor 10x</td>
 <td>10 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SalI (10 U/μl)</td>
 <td>4 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>~</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suma:</td>
 <td>100 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>gDNA PS312</td>
 <td>10 μg</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bufor 10x</td>
 <td>10 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pst I i Sal I (10 U/μl)</td>
 <td>8 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>~</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suma:</td>
 <td>100 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Mieszanina do trawienia enzymami restrykcyjnymi.
<ol start="5">
 <li>Wytrącanie i przygotowanie DNA
 <ol>
 <li>Do produktu po trawieniu dodać octan sodu w stosunku 1:10 (3 M NaCOOCH3 pH 5.2) oraz 2,5-krotność objętości 100% etanolu; dodać 20 ng/μl glikogenu, aby ułatwić widoczność osadu.</li>
 <li>Wirować przy 14 000 rpm przez 15 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Odlać nadsącz, powoli odwracając probówkę wirówkową do góry dnem, a następnie delikatnie stukając nią o ręcznik papierowy, upewniając się, że osad jest stabilny w dolnym rogu probówki i wolny od etanolu.</li>
 <li>Dodać 1 ml 75% etanolu.</li>
 <li>Natychmiast wirować przy 14 000 rpm przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Odlać nadsącz, powoli odwracając probówkę wirówkową do góry dnem, a następnie delikatnie stukając nią o ręcznik papierowy, upewniając się, że osad jest stabilny w dolnym rogu probówki i wolny od etanolu.</li>
 <li>Osad suszyć w wirówce próżniowej przy 14 000 rpm przez 5 minut w temperaturze 25-30°C, aż do całkowitego wyschnięcia i usunięcia etanolu.</li>
 <li>Dodać 30 μl buforu TE lub sterylnej dH2O i pozostawić na noc w temperaturze 4°C, a następnie krótko wymieszać za pomocą wortexa.</li>
 <li>Tabela 2 opisuje sposób przygotowania mieszaniny do wstrzykiwania z każdego oczyszczonego DNA.</li>
 <li>Przechowywać w temperaturze -20°C. Po rozmrożeniu mieszaniny do wstrzykiwania, wirować probówkę przy 14 000 rpm przez 5 minut, aby usunąć cząstki zanieczyszczeń, które mogłyby zatkać igłę do wstrzykiwania.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Materiał genetyczny</td>
 <td>Stężenie</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ppa-egl-4p::gfp (SalI)</td>
 <td>&gt;5 ng/μl (0.1-10ng/μl)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pRL3 (PstI)</td>
 <td>&gt;1 ng/μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>gDNA PS312 (PstI + SalI)</td>
 <td>&gt;60 ng/μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>~</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suma:</td>
 <td>30 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Mieszanina do iniekcji Ppa-prl-1
2. Interferencja RNA: Synteza dwuniciowego RNA in vitro
<ol>
 <li>Przeprowadź reakcję PCR w celu amplifikacji genu docelowego. Do amplifikacji fragmentu genomowego o długości 464 bp (pozycje 3-466) z wektora pRL3 zawierającego allel Ppa-prl-1(tu92) zastosowano startery RHL091 5'- agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3' (miejsce BamHI) oraz RHL092 5'- tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3' (miejsce PstI).</li>
 <li>Przetraw produkt PCR enzymami BamHI i PstI.</li>
 <li>Liguj fragment z wektorem do karmienia RNAi pL44402 przetrawionym enzymami BamHI/PstI.</li>
 <li>Transformuj wektor z insertem do kompetentnych komórek i inkubuj je na płytkach z podłożem LB z ampicyliną (50 μg/ml).</li>
 <li>Wyselekcjonuj klony z prawidłowo wstawionym wektorem za pomocą PCR z użyciem starterów T7.</li>
 <li>Wykorzystaj produkt PCR flankowany sekwencjami T7 zawierający gen prl-1 do syntezy dwuniciowego RNA (dsRNA) przy użyciu zestawu do syntezy RNAi BLOCK-IT (Invitrogen).</li>
 <li>Optymalne stężenie dsRNA do iniekcji wynosi &gt;200 ng/μl, maksymalnie do 1 μg/μl.</li>
 <li>Przechowuj w temperaturze -20°C. Po rozmrożeniu mieszaniny do iniekcji odwiruj probówkę przy 14,000 rpm przez 5 minut, aby usunąć cząsteczki zanieczyszczeń, które mogłyby zatkać igłę do iniekcji.</li>
</ol>
3. Mikroiniekcja: Protokół wstrzykiwania transgenów i/lub dsRNA
<ol>
 <li>Igły do iniekcji
 <ol>
 <li>Ustaw temperaturę wyciągacza igieł Narishige (model #: PC-10):
 <ol>
 <li>Przekręć dolne pokrętło na pozycję „No.2 Heater”.</li>
 <li>Obracaj pokrętłem „No.2 Heater Adj.”, aż panel wskaże 55.0-60.0°C dla stożkowych końcówek igieł o różnych długościach.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przekręć dolne pokrętło z powrotem na pozycję „Step 1” (wyciąganie igły w jednym kroku).</li>
 <li>Włóż igłę do komory i upewnij się, że jest stabilnie zamocowana.</li>
 <li>Naciśnij przycisk „Start” (czerwony przycisk) i pozwól na wyciągnięcie igły za pomocą wszystkich obciążników (powinno to stworzyć dwie identyczne igły skierowane w przeciwne strony).</li>
 <li>Wyjmij igłę z komory i przechowuj w plastikowej płytce hodowlanej, zabezpieczając ją plasteliną, aby zapobiec osadzaniu się kurzu na igłach.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Podkładki do montażu
 <ol>
 <li>W probówce wirówkowej o pojemności 1.5 ml przygotuj 2% roztwór agaru Noble, dodając 0.02 g agaru Noble do 1 ml H2O. Agar można przechowywać w temperaturze 4°C do roku.</li>
 <li>Dokładnie wymieszaj i rozpuść agar w bloku grzejnym ustawionym na &gt;88°C.</li>
 <li>Za pomocą mikropipety 1 ml nanieś kroplę płynnego 2% agaru Noble na środek szkiełka przedmiotowego (Fisher, 12-544-F).</li>
 <li>Wypłaszcz kroplę, kładąc na niej drugie szkiełko przedmiotowe.</li>
 <li>Powtarzaj „krok nakładania kropli”, aż powstanie warstwa z pięciu szkiełek.</li>
 <li>Zdejmij każde szkiełko, zsuwając je po sobie.</li>
 <li>Wysusz wypłaszczone podkładki agarowe na szkiełkach w piecu próżniowym w temperaturze 70°C przez 4 godziny lub przez noc (ewentualnie w temperaturze pokojowej przez noc).</li>
 <li>Przygotuj wiele podkładek do iniekcji i przechowuj je do późniejszego użycia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Mikroiniekcja do gonad hermafrodytycznych</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomii Caenorhabditis elegans; budowa nicieni, układy rozrodczy i pokarmowy." src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat anatomiczny P. pacificus. Przezroczyste komórki z jądrami to żeńskie komórki rozrodcze (oocyty), a szara część to jelito. Przedstawiono tylko jeden dystalny przedni gonad, jednak należy zauważyć, że dwa gonady dystalne krzyżują się grzbietowo w okolicy połowy ciała.
<img alt="Obrazy mikroskopowe nicieni podczas analizy mikrofluidycznej; skupienie na strukturze i deformacji." src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obrazy mikroiniekcji. (A) Końcówka igły do iniekcji znajduje się w polu widzenia wraz z prawą krawędzią wyciągniętego fragmentu kapilary. Poprzez delikatne dotknięcie końcówki igły tej krawędzi, końcówka powinna zostać przełamana, zachowując jednocześnie ostry punkt. (B) Igła jest wprowadzana do górnego gonady tuż nad zakrzywieniem jelita podczas pierwszej iniekcji. (C) Igła jest wprowadzana do dolnej gonady tuż pod zakrzywieniem jelita podczas drugiej iniekcji.
<ol start="3">
 <li>
 <ol>
 <li>Upewnij się, że kontrast oraz ustawienia przesunięcia DIC są optymalne do obserwacji gonad hermafrodytów.</li>
 <li>Napełnij dociąganą igłę kapilarną 1,0-2,0 μl mieszaniny do iniekcji.</li>
 <li>Umieść igłę w manipulatorze do mikroiniekcji; manometry zbiornika z azotem powinny być ustawione na optymalne warunki (10-20 psi przez 0,5-1 s).</li>
 <li>Załam końcówkę igły, delikatnie dotykając jej krawędzi cienko dociąganej rurki kapilarnej umieszczonej na szkiełku (rycina 2A).
 <ol>
 <li>Szkiełko do załamywania igieł: najcieńsza część dociąganej kapilary umieszczona na szkiełku przedmiotowym w kropli oleju.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Po załamaniu igły można ją umieścić w pozycji spoczynkowej podczas przenoszenia nicienia na podkładkę (w przypadku P. pacificus okno czasowe na iniekcję wynosi 5 minut, zanim zwierzęta wyschną i zginą).</li>
 <li>Korzystając z płytki wypełnionej nicieniami w stadium J4-młodych dorosłych, wlej wystarczającą ilość oleju parafinowego (ciężkiego), aby zakryć wszystkie nicienie na trawniku bakterii OP50.</li>
 <li>Pobierz nicienia i umieść go na podkładce do iniekcji.</li>
 <li>Umieść szkiełko z nicieniem pod mikroskopem; ustaw gonadę nicienia w kierunku igły, a wulwę w stronę przeciwną do igły (rycina 2B, 2C).</li>
 <li>Opuść igłę do pozycji widocznej w polu widzenia mikroskopu.</li>
 <li>Ustaw górną gonadę i igłę w tej samej płaszczyźnie ogniskowania (rycina 2B).</li>
 <li>Delikatnie nakłuj nicienia i wpompuj mieszaninę do iniekcji; przemieszczanie się oocytów w stronę dystalnego końca świadczy o udanej iniekcji (aby zoptymalizować dostarczenie transgenu lub dsRNA, po iniekcji powinna być widoczna fala rozszerzenia w gonadzie, która trwa do momentu zbliżenia się do dystalnego końca).</li>
 <li>Przestaw igłę, aby dokonać iniekcji do dolnej gonady i powtórz zabieg; jednak ponieważ ta gonada znajduje się pod jelitem, rozprzestrzenianie się oocytów nie będzie widoczne, co utrudnia osiągnięcie celu (rycina 2C).</li>
 <li>Normalny wygląd nicienia po zabiegu wskazuje na udaną iniekcję; nie powinno być żadnych uszkodzeń gonad (wypchniętych z wulwy lub pękniętych wewnątrz jamy ciała).</li>
 <li>Przywróć igłę do pozycji spoczynkowej.</li>
 <li>Przygotuj się do odzyskania nicienia.</li>
 <li>Dodaj kroplę (0,5 μl) buforu M9 na podkładkę, na której znajduje się wstrzyknięty nicień.</li>
 <li>Używając pęsety z niewielką ilością bakterii OP50, dotknij nicienia; powinien on przykleić się do pęsety. Nie używamy pipety ustnej.</li>
 <li>Przenieś nicienia na płytkę z naniesionymi plamkami 50 μl OP50; na takich płytkach można odzyskać 2-4 nicienie.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przechowywanie po iniekcji i przesiewanie pod kątem transgenezy
 <ol>
 <li>Przechowuj wstrzyknięte nicienie (P0) w temperaturze 20°C przez ok. 4 dni w celu zniesienia jaj i wyrośnięcia pokolenia F1.</li>
 <li>Czwartego dnia przesiewaj nicienie pod kątem wybranego fenotypu (aby wykryć transgenezę, szukaj osobników typu „roller” wykazujących dominantni marker Ppa-prl-1).</li>
 <li>Pobierz pojedyncze, niezależne osobniki F1 o zaobserwowanym fenotypie na nową zasiałą płytkę i przechowuj w 25°C; temperatura ta sprzyja tworzeniu stabilnych linii z osobników F1.</li>
 <li>Pobierz pojedyncze osobniki F2 z niezależnych linii F1. Poszczególne linie F2 mają podobne wskaźniki transmisji transgenu. Często otrzymujemy &gt;15 linii F2 z jednego transformowanego osobnika F1.</li>
 <li>Kolejne pokolenia przechowuj w 25°C.</li>
 <li>Wskaźnik transmisji fenotypu „roller” zazwyczaj pozostaje stały po pokoleniu F4, dlatego w tym momencie konieczne jest określenie poziomu ekspresji docelowego transgenu (Ppa-egl-4p::gfp) dla każdej indywidualnej linii. Ekspresja GFP może nie korelować z zakresem penetracji dominantniego fenotypu „roller”.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przechowywanie po iniekcji i przesiewanie pod kątem fenotypów RNAi
 <ol>
 <li>Przechowuj wstrzyknięte nicienie (P0) w temperaturze 20°C przez ok. 4 dni w celu zniesienia jaj i wyrośnięcia pokolenia F1.</li>
 <li>Czwartego dnia przesiewaj nicienie F1 pod kątem wybranego fenotypu (aby wykryć fenotyp wyciszenia RNAi, szukaj penetrujących fenotypów, które mogą być związane z utratą aktywności genu docelowego, w naszym przypadku utratą fenotypu Ppa-prl-1).</li>
 <li>W naszym doświadczeniu fenotyp wyciszenia (non-roller) jest tracony w &gt;97% osobników F2.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
1. Wynik transgenezy
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Sesja</td>
 <td>Wstrzyknięty P0</td>
 <td>F1 Mieszadła rolkowe</td>
 <td>% transgenicznych F2</td>
 <td>Średnia % transmitancja po F2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>60</td>
 <td>2</td>
 <td>0% 
 (linia 2) 13%</td>
 <td>ND 
 13%±10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>40</td>
 <td>1*</td>
 <td>(linia 3) 0%</td>
 <td>Brak danych</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>40</td>
 <td>0</td>
 <td>0%</td>
 <td>Brak danych</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>40</td>
 <td>1</td>
 <td>(linia 4) 0%</td>
 <td>Brak danych</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>20</td>
 <td>0</td>
 <td>0%</td>
 <td>Brak danych</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>40</td>
 <td>1</td>
 <td>(linia 5) 26%</td>
 <td>22%±10</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
* samiec roller, który nie krzyżował; NA: nie dotyczy
Tabela 3. Wyniki iniekcji PS312 z Ppa-egl-4p::gfp (trawiony Sal I), pRL3(roller) (trawiony Pst I) oraz gDNA PS312 (trawiony PstI i SalI).
<img alt="Mikroskopia nicieni w glebie; obrazowanie w świetle przechodzącym (A, B) i fluorescencyjne (C) w celu badania organizmów." src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. (A) typ dziki (B, C) stabilna linia transgeniczna F4 pRL3; Ppa-egl-4p::gfp wykazująca ekspresję GFP w neuronach głowy.
2. Wynik interferencji RNA
<img alt="Obrazy mikroskopowe nicieni przedstawiające różne stadia rozwojowe i morfologie do badań biologicznych." src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Mutanty prl-1 po iniekcji RNA wykazują całkowity knockdown lokomocji typu „rolling”. (A) Mutant tu92 z funkcją wzmocnioną (gain-of-function) typu roller genu prl-1. (B) Mutant prl-1 po „knockdownie” wykazuje prawidłową postawę i lokomocję typu dzikiego. (C) Iniektowany prl-1 (dół) posiada również dłuższe ciało niż mutant prl-1 (góra). (D) Dłuższe ciało iniektowanego prl-1 (dół) jest również dłuższe niż u typu dzikiego PS312 (góra). Fenotyp dłuższego ciała zaobserwowano również podczas knockdownu RNAi rol-5 (sqt-1) u C. elegans N2 (dane nie pokazano).
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>rolka</td>
 <td>stabilny (przeciwstaczny)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dsRNA prl-1 (200 ng/μl)</td>
 <td>13</td>
 <td>21</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B prl-1 dsRNA (1000 ng/μl)</td>
 <td>9</td>
 <td>16</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>kontrola</td>
 <td>20</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 4. Podsumowanie iniekcji dsRNA Ppa-prl-1. (A) [dsRNA] = 200 ng/μl; (B) [dsRNA] = 1000 ng/μl. P = 0,0019 oraz 0,041 zgodnie z dokładnym testem Fishera, obustronnym, odpowiednio dla iniekcji 200 oraz 1000 ng/μl.

<ol><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Ahringer, J. Reverse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhringer%2C+J+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , (2006).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.+elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis%3A+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3%27+UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).</li>
<li>Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+dominant+roller+mutant+and+establishment+of+DNA-mediated+transformation+in+the+nematode+Pristionchus+pacificus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus.</a> Genesis. 47, 300-304 (2009).</li>
<li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pristionchus+pacificus%3A+a+well-rounded+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode.</a> Bioessays. 28, 651-659 (2006).</li>
<li>Hong, R. L., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattraction+in+Pristionchus+nematodes+and+implications+for+insect+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition.</a> Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).</li>
<li>Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadogenesis+in+Pristionchus+pacificus+and+organ+evolution%3A+development%2C+adult+morphology+and+cell-cell+interactions+in+the+hermaphrodite+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad.</a> Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 11, 802-805 (1994).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and Microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , (2006).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

P. pacificus populacje występują w ścisłej asocjacji z różnymi gatunkami chrząszczy z rodziny scarabaeidae na całym świecie i stanowią modelowy organizm z grupy nicieni, będący formą pośrednią między nicieniami wolnożyjącymi a pasożytniczymi. Siła *P. pacificus* jako wyłaniający się organizm modelowy, opiera się na integracji map genetycznych i fizycznych, co umożliwia mapowanie pozycyjne mutantów wyizolowanych w ramach bezstronnych forwardowych przesiewów genetycznych (t. j. nie tylko dla genó...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop do mikroiniekcji DMI3000</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI3000</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator mikroinjektora (napęd bezpośredni)</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>Przegub kulowy Narashige BC-3</td><td></td></tr><tr><td>Wyciągacz do igieł</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>Narashige PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor&amp;#8482; W pełni cyfrowy system wielociśnieniowy</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>Narashige MINJ-D</td><td></td></tr><tr><td>GeneElute&amp;#8482;Zestaw do minipreparatyki genomowego DNA ssaków </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1N70</td><td></td></tr><tr><td>zestaw pJet Cloning Jet</td><td>Fermentas</td><td>K1231</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw GeneJET plasmid Miniprep kit</td><td>Fermentas</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczanie DNA &amp;Koncentrator&amp;#8482;</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4005</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-IT&amp;#8482; RNAi TOPO&amp;#174; zestaw do transkrypcji</td><td>Invitrogen</td><td>K3500-01 &amp;amp; K3650-01</td><td></td></tr><tr><td>Difco&amp;#8482;Agar Noble</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0142-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu (grubość 1,5 - 0,16 do 0,19 mm; rozmiar: 50 x 45 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-554-F</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane (filamenty)</td><td>A-M Systems</td><td>615000</td><td></td></tr><tr><td>Olej parafinowy (ciężki)</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>P386-500</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC20651-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M80-500</td><td></td></tr></tbody></table>

wyciszanie genów za pomocą rnai oraz transgeneza poprzez mikroiniekcję u nekromenicznego nicienienia pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Mimo że coraz bardziej przystępne staje się całkowite sekwencjonowanie genomów nowych organizmów modelowych, dalsze pogłębione analizy funkcji i ekspresji genów za pomocą interferencji RNA oraz stabilnej transgenezy pozostają ograniczone u wielu gatunków ze względu na specyficzną anatomię i biologię komórkową organizmów. Na przykład, poza grupą koronową Caenorhabditis, do której należy Caenorhabditis elegans3, w tym licznie reprezentowanym typie (Nematoda) nie zgłaszano stabilnie transmitowanych linii transgenicznych u gatunków spoza rodzaju Caenorhabditis, z wyjątkiem Strongyloides stercoralis4 i Pristionchus pacificus5. Aby ułatwić rozszerzenie roli P. pacificus w badaniach nad rozwojem, ewolucją i zachowaniem6-7, opisujemy tutaj aktualne metody wykorzystania mikroiniekcji do tworzenia zwierząt transgenicznych oraz wyciszania genów za pomocą RNAi. Podobnie jak gonady C. elegans i większości innych nicieni, gonady P. pacificus są syncytialne i zdolne do włączania DNA oraz RNA do oocytów podczas bezpośredniej mikroiniekcji. W przeciwieństwie do C. elegans, stabilna dziedziczność transgenu i jego ekspresja somatyczna u P. pacificus wymagają jednak dodania własnego DNA genomicznego trawionego endonukleazami komplementarnymi do końców docelowych transgenów i markerów koiniekcji5. Konieczność dodania nośnikowego DNA genomicznego jest podobna do wymogu ekspresji transgenu u Strongyloides stercoralis4 oraz w komórkach linii zarodkowej C. elegans. Nie jest jednak jasne, czy ten specyficzny wymóg stosowania własnego DNA genomicznego zwierzęcia wynika z wysokiej wydajności wyciszania niekompleksowych genów wielokopiowych w somie P. pacificus, czy też z faktu, że macierze pozachromosomalne u P. pacificus wymagają sekwencji genomicznych do prawidłowego montażu kinetochorów podczas mitozy. Wentralna migracja dwuramiennych (didelphicznych) gonad u hermafrodyt dodatkowo utrudnia możliwość iniekcji obu gonad u poszczególnych osobników8. Demonstrujemy również zastosowanie mikroiniekcji do wyciszenia dominującego mutanta (roller, tu92) poprzez wstrzyknięcie dwuniciowego RNA (dsRNA) do gonad w celu uzyskania potomstwa F1 o fenotypie nie-roller. W przeciwieństwie do C. elegans, ale podobnie jak większość innych nicieni, szczep P. pacificus PS312 nie jest podatny na systemową RNAi drogą pokarmową lub przez moczenie, dlatego dsRNA musi być podawane poprzez mikroiniekcję do syncytialnych gonad. W niniejszym badaniu dążymy do opisania procesu mikroiniekcji niezbędnego do transformacji reportera fuzyjnego promotor Ppa-egl-4::GFP oraz wyciszenia dominującego mutanta roller prl-1 (tu92) w formie przejrzystego wizualnie protokołu.

W organizmach modelowych transgeneza pozwala na manipulowanie funkcjami genów, podczas gdy RNAi umożliwia wyciszenie specyficznych transkryptów mRNA 1-2. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie technik niezbędnych do wprowadzenia stabilnie dziedziczonego DNA oraz przejściowego dwuniciowego RNA do nekromenicznego nicienia Pristionchus pacificus na potrzeby badań w dziedzinie biologii ewolucyjnej, rozwojowej i behawioralnej.

Wyciszanie genów za pomocą RNAi oraz transgeneza poprzez mikroiniekcję u nekromenicznego nicienienia Pristionchus pacificus

Choć coraz bardziej przystępne cenowo staje się całkowite sekwencjonowanie genomów nowych organizmów modelowych, dalsza pogłębiona analiza funkcji i ekspresji genów...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest skuteczna transformacja obcym DNA oraz wyciszenie funkcji genu u nicieni Priyanka Pacificus. W przypadku transgenezy należy rozpocząć od przygotowania odpowiedniego DNA genomicznego z kompatybilnymi lepkimi końcami.W celu przeprowadzenia interferencji RNA należy zsyntetyzować gen zainteresowania przy użyciu zestawu do transkrypcji dwuniciowego RNA. Następnie należy mikroiniekować DNA lub dwuniciowe RNA do gonad PRIs DIANCA pacificus. Populację F1 należy przesiewać w celu wyłonienia wybranego fenotypu markera w przypadku transgenezy oraz wybranego fenotypu knockdown w przypadku interferencji RNA dla transgenezy.Należy kontynuować monitorowanie wyników w drugiej generacji (F2) nicieni transgenicznych, aby uzyskać rezultaty wykazujące specyficzną ekspresję genów z wykorzystaniem reportera GFP w mikroskopii fluorescencyjnej. Witajcie, nazywam się Ray Hong z California State University of Northridge, a niniejsza demonstracja przedstawi etapy manipulacji genetycznej u specyficznych nicieni. W nowo powstających organizmach modelowych przeprowadzanie RNAi i transgenezy pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju i behawiorystyki poprzez charakteryzację funkcji i ekspresji genów.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą odniosą korzyść z obejrzenia sposobu rozmieszczania nicieni na podkładce do iniekcji oraz techniki wstrzykiwania w odpowiedniej płaszczyźnie ogniskowej, w której widoczne są gonady. W przeciwieństwie do innych gatunków, gonady C. elegans są specyficzne, ponieważ krzyżują się grzbietowo i migrują w miarę rozwoju nicienia z późnego stadium J4 w osobniki dorosłe. Ponadto do transgenów i markera ko-iniekcyjnego należy dodać genomowe DNA strawione kompatybilnymi enzymami restrykcyjnymi, aby przygotować mieszaninę do iniekcji.W laboratorium Jessiki Single zostanie zaprezentowana mikroiniekcja w przypadku PRIs, konkretnie w celu transgenezy. Do iniekcji wymagane są konstrukty 3D NA, dominujący marker współiniekcji, docelowy transgen reporterowy oraz konstrukty genomicznego D-N-A-D-N-A, które są trawione za pomocą kompatybilnych enzymów restrykcyjnych. Konstrukty DNA są odzyskiwane przy użyciu protokołu wytrącania etanolem.Mieszaninę do wtrysku przygotowuje się w stężeniach wymienionych w tabeli. Należy sprawdzić ustawienia manometru zbiornika z azotem. Następnie do igły nabiera się od jednego do dwóch µL mieszaniny do wtrysku.Umieść igłę w manipulatorze do mikroiniekcji. Odłam końcówkę igły, lekko dotykając jej krawędzi cienko wyciągniętej rurki kapilarnej umieszczonej na szkiełku, a następnie ustaw ją w pozycji spoczynkowej. Teraz wlej olej parafinowy, aby przykryć płytkę z czterema młodymi dorosłymi nicieniami.Wybierz jednego nicienia i przenieś go na podkładkę do iniekcji. Pod mikroskopem ustaw gonadę nicienia w kierunku igły, tak aby wulwa była skierowana w stronę przeciwną do igły. Następnie opuść igłę do pozycji widocznej w polu widzenia mikroskopu.Ustaw górną część gonady i igłę w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Delikatnie nakłuj nicienia i wprowadź mieszaninę do iniekcji. Zauważ oddzielanie się jaj w kierunku dystalnego końca, co świadczy o prawidłowym wykonaniu iniekcji.Zmień położenie igły, aby wstrzyknąć preparat do dolnej gonady, i powtórz iniekcję. Ponieważ gonada ta znajduje się pod jelitem, rozprzestrzenianie się jaj nie będzie widoczne, co utrudnia ocenę powodzenia iniekcji. Niemniej jednak, po wykonaniu zabiegu, nicień powinien pozostać w całości, bez wystających gonad.Przywróć igłę do pozycji spoczynkowej. Dodaj kroplę buforu M9, aby odratować nicienia, używając bakterii OP 50 na pęsetce. Dotknij nicienia bakteriami OP 50 w taki sposób, aby przywarł do pęsetki.Następnie przenieś nicienia na płytkę z kropelkami 50 µL bakterii OP 50. Przechowuj wstrzyknięte nicienie w temperaturze 20 °C przez około cztery dni, aby mogły złożyć jaja i wydać pokolenie F1. Następnie przeprowadź przesiew nicieni w celu wyselekcjonowania pożądanego fenotypu.Wybrać pojedyncze osobniki F1 z obserwowanym fenotypem, przenieść je na nową płytkę z podłożem i przechowywać w temperaturze 25°C. W przypadku linii transgenicznych przenieść pojedyncze osobniki F2 na osobne płytki. Kolejne pokolenia przechowywać w temperaturze 20°C.Manipulacja funkcją genów na poziomie organizmu za pomocą RNAi i transgenezy stanowi kluczowy aspekt modelu Ppac pacificus w biologii rozwoju ewolucyjnego. W porównaniu z nicieniem typu dzikiego po lewej stronie, stabilna linia transgeniczna F4 PPR L3 skutkuje dominującym fenotypem „roller”, wykazującym ekspresję GFP w neuronach głowy. Z kolei niniejszy eksperyment RNAi generuje mutanty PRL1, u których występuje całkowite wyciszenie lokomocji typu „rolling”, zwykle obserwowanej u mutanta z funkcją wzmocnioną PRL1 roller TU 92. Po opanowaniu techniki każda iniekcja może zostać wykonana w ciągu pięciu minut. Należy pamiętać, że wszystkie osobniki F2 z niezależnych transgenicznych linii roller F1 muszą zostać wyselekcjonowane pojedynczo w celu ustanowienia niezależnych linii F2.Dzieje się tak, ponieważ stwierdziliśmy, że ekspresja GFP jest bardzo zmienna pomiędzy dwiema liniami F, a dziedziczenie fenotypu roller nie koreluje z poziomem ekspresji G.

rnai-mediated-gene-knockdown-transgenesis-microinjection-necromenic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyciszenie genów za pośrednictwem RNAi i transgeneza poprzez mikroiniekcję u owada nekrofagowego Pristionchus pacificus

Ten film opisuje mikroiniekcję, powszechną metodę tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans. W przykładzie zobaczymy mikroiniekcję użytą do wprowadzenia kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) do edycji genów zasad CRISPR.

Mikroiniekcja gonad: metoda dostarczania związków bezpośrednio do linii rozrodczej C. elegans

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Tutaj opisujemy metody efektywnych iniekcji poczwarek i dorosłych osobników w Nasonia vitripennis jako dostępne alternatywy dla mikroiniekcji zarodków, umożliwiając funkcjonalną analizę interesujących genów za pomocą wyciszania RNA poprzez interferencję RNA (RNAi) lub nokautowania genów za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę moczenia interferencji RNA u Bursaphelenchus xylophilus , aby ułatwić badanie funkcji genów.

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

Nicienie entomopatogeniczne żyją w symbiozie z bakteriami i razem skutecznie infekują owady, osłabiając ich wrodzony układ odpornościowy. W celu wspierania badań nad genetycznymi podstawami zakażenia nicieniami opisano metody utrzymywania i genetycznej manipulacji nicieniami entomopatogenicznymi.

Hodowla i genetyczna manipulacja nicieniami entomopatogennymi

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Naucz się technik nokautyzacji i transgenezy genów za pomocą mikroiniekcji RNAi u nicienia Pristionchus pacificus. Metody te umożliwiają badanie funkcji genów w biologii rozwoju i ewolucji.

Wyciszanie genów za pomocą RNAi oraz transgeneza poprzez mikroiniekcję u nekromenicznego nicienienia Pristionchus pacificus

Przeglądaj więcej filmów