Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne mapowanie optyczne potencjału błonowego oraz przejściowego stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych w układzie LOR. Jest to osiągane poprzez najpierw wycięcie nienaruszonego serca myszy, a następnie kaniulację aorty i rozpoczęcie perfuzji LOR. Kolejnym krokiem jest unieruchomienie serca poprzez załadowanie sprzęgacza pobudzenia i skurczu, a następnie przypięcie serca do komory perfuzyjnej.

Ostatnie kroki polegają na wprowadzeniu barwników optycznych i przygotowaniu środków ograniczających artefakty ruchowe podczas eksperymentu. Obrazy optyczne są uzyskiwane poprzez zbieranie światła emitowanego przez serce za pomocą kamer my cam Ultima LC Moss. Hej, nazywam się di.

Jestem studentem studiów magisterskich na Washington University. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroelektrody, jest to, że mapowanie optyczne pozwala na uzyskanie większej rozdzielczości przestrzennej na całej powierzchni serca. Cześć, jestem Matt Sulkin.

Jestem studentem studiów podyplomowych na Washington University. Ta metoda, jeśli zostanie prawidłowo wykonana, może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na wiele pytań z zakresu elektrofizjologii serca, takich jak podłoże arytmogenezy. Należy rozpocząć od skonfigurowania jednej pompy perystaltycznej w celu cyrkulacji roztworów z prędkością 40 milliliters per minute.

Następnie ustaw drugą pompę perystaltyczną na 80 ml/min. Pompa ta zawraca płyn Perfuse eight z powrotem do zbiornika magazynującego i natleniającego. Włącz pompy i przemyj układ jednym litrem 70% etanolu przez 30 minut w obiegu zamkniętym.

Po tym płukaniu należy użyć dwóch litrów wody dejonizowanej bez recyrkulacji. Po odprowadzeniu wody należy wprowadzić dwa litry roztworu Tyro i przepuścić je przez filtr o wielkości oczek 5 µm. Perfuzat należy ogrzać do 37 °C za pomocą płaszcza wodnego i cyrkulatora, a do roztworu należy wprowadzać natleniony gaz.

Dostosuj tempo przepływu gazu, aby utrzymać pH na poziomie 7,35 ± 0,05. Przez cały czas trwania eksperymentu monitoruj zarówno pH, jak i temperaturę. Aparatura do podwójnego mapowania optycznego składa się z dwóch szybkich kamer CMOS, które potrafią rejestrować obrazy o rozdzielczości 100 × 100 pikseli z częstotliwością 3000 klatek na sekundę.

Zamocuj filtr pasmowo-przepustowy do kamery do obrazowania wapnia, a filtr długoprzepustowy do kamery do obrazowania napięcia na uchwycie do dwóch kamer. Zamocuj lustro dichroiczne i soczewkę w taki sposób, aby światło emisji pochodzące z serca było ogniskowane przez soczewkę na lustro. Następnie zamocuj obie kamery do uchwytu i ustaw je tak, aby były względem siebie prostopadłe.

Następnie należy przygotować światło wzbudzenia. Światło jest generowane przez lampę halogenową i kierowane przez elastyczny światłowód. Przeprowadź światło przez filtr cieplny, migawkę ograniczającą czas ekspozycji oraz filtr pasmowy wzbudzenia.

Na koniec przygotuj elektrody srebrowe oraz srebrowo-chlorkowe, montując je w komorze. Po ponownym sprawdzeniu i dostrojeniu poziomów na wzmacniaczach i filtrach układ jest gotowy do badania serca. Przed przystąpieniem do procedury znieczul mysz, stosując mieszankę ketaminy i ksylazyny z 100 jednostkami heparyny.

Upewnij się, że zwierzę nie wykazuje odruchu bólowego, wykonując uciśnięcie palca u stopy. Po wykonaniu nacięcia w połowie mostka szybko usuń serce wraz z otaczającymi go tkankami. Następnie, korzystając z mikroskopu sekcyjnego, szybko zlokalizuj aortę i wykonaj precyzyjne cięcie w poprzek aorty wstępującej poniżej prawej tętnicy podobojczykowej.

Następnie przymocuj krótki odcinek aorty do specjalnie wykonanej kaniuli 21G, używając czterech splotów jedwabnych czarnych rozmiaru 4-0. Po kaniulacji wykonaj wsteczną perfuzję i nadciśnieniową perfuzję serca roztworem Tyrode'a, dostosowując szybkość przepływu tak, aby utrzymać ciśnienie w aorcie w zakresie od 60 do 80 mmHg, mierzone za pomocą przetwornika ciśnienia.

Następnie przeprowadź sekcję i usuń otaczający płat płuca, grasicę oraz tkankę tłuszczową. Teraz wprowadź rurkę silikonową do lewej komory poprzez żyły płucne. Przyszyj rurkę do sąsiedniej tkanki łącznej.

Ten bardzo ważny krok zapobiega zastojowi i zakwaszeniu Perfuse eight uwięzionego w lewej komorze, szczególnie po zniesieniu skurczów komór. Aby zapobiec ruchom serca wywołanym przez Perfuse eight, przymocuj serce szpilką do dna komory perfuzyjnej z powłoką sill guard w obrębie jego wierzchołka. Ponadto rozciągnij i przymocuj szpilkami wyrostki prawego i lewego przedsionka, aby zwiększyć powierzchnię przedsionków w konfiguracji pionowej.

Pozwoli to zmaksymalizować powierzchnię rejestracji. Aby przeprowadzić stymulację rozrusznikową, przymocuj wykonaną na zamówienie elektrodę do powierzchni serca. W celu zredukowania artefaktów ruchowych, przymocuj małe szkiełko zakrywkowe nad sercem na powierzchni roztworu.

Należy to zrobić, klinując szkło pomiędzy kilkoma pinami. W ramach końcowych przygotowań należy skupić światło wzbudzenia na sercu i ustawić kamery tak, aby uzyskać obraz optyczny, a następnie przystąpić do wprowadzania barwnika. Należy stale monitorować zapis EKG, aby upewnić się, że funkcja elektryczna serca jest prawidłowa.

Zacznij od ogrzania statyny BLE do temperatury pokojowej. Następnie wymieszaj 0,5 ml statyny BLE z roztworem profuse eight w zbiorniku magazynującym i rozcieńcz pozostałe 0,1 ml statyny BLE w 1 ml roztworu Tyros. Przez następne 20 minut powoli wstrzykuj statynę BLE w roztworze tyros przez port do podawania leków znajdujący się w pobliżu kaniuli.

Statyna BLE stopniowo zredukuje artefakty ruchowe. Następnie należy rozcieńczyć 30 µL barwnika wrażliwego na napięcie w 1 mL roztworu tyro i powoli wstrzyknąć tę mieszaninę w ciągu od pięciu do siedmiu minut do tego samego portu do podawania leków. Następnie należy ponownie przygotować taką samą mieszaninę.

Tym razem należy dodać dodatkowe 30 µL wskaźnika wapnia. Mieszaninę tę należy powoli aplikować przez ten sam port w czasie od 5 do 10 minut. Po wstrzyknięciu wskaźnika wapnia należy odczekać kolejne 5 do 10 minut, aż statyna BLEs całkowicie zahamuje ruch, a barwniki przenikną do komórek, przed przystąpieniem do eksperymentu.

Przygotowano preparat serca. Zgodnie z protokołem, sygnały EKG rejestrowano podczas stymulacji komór w trybie S1-S1. Potencjały czynnościowe oraz sygnały przejściowe wapnia rejestrowano z przedsionków po lewej stronie i komór po prawej stronie.

Strzałka wskazuje miejsce wystąpienia rozproszenia sygnału z komór; poprzez grupowanie nagrań z kamery w jednostkach trzech na trzy piksele, na podstawie danych z macierzy można wyświetlić układ stanów przejściowych wapnia oraz potencjałów czynnościowych. Można w ten sposób stworzyć rysunek obrazujący przewodzenie potencjału czynnościowego. Dane z trzech kolejnych punktów na osi poprzecznej i podłużnej pokazują zmianę amplitudy wraz z rozprzestrzenianiem się potencjału czynnościowego po powierzchni komory.

Podobnie można przygotować rysunek przedstawiający czas trwania potencjału czynnościowego oraz przejściowych zmian stężenia wapnia. Po lewej stronie przedstawiono warunki kontrolne, a po prawej wynik po interwencji. Do serca podano izoproterenol, co wyraźnie skraca czas trwania zarówno przejściowych zmian stężenia wapnia, jak i potencjałów czynnościowych.

Po opanowaniu, technikę tę można przeprowadzić w ciągu dwóch do trzech godzin, postępując zgodnie z opisaną procedurą. W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące okresu refrakcji węzła AV, można zastosować inne metody, takie jak protokół stymulacji.