Name: Optyczne mapowanie potencjałów czynnościowych i stanów przejściowych wapnia w sercu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę optycznego mapowania potencjałów czynnościowych i wapnia w izolowanych sercach myszy. Technika ta umożliwia badanie elektrofizjologii serca z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Granty NIH R01 HL085369.

1. Zaawansowane przygotowanie roztworów stokowych
<ol>
	<li>Przygotować wcześniej dwa roztwory zapasowe roztworu Tyrode'a (16x) w wodzie dejonizowanej i przechowywać je w temperaturze 4°C:
	<ol class="lalpha">
		<li>Roztwór zapasowy I (119,872 g/L NaCl, 3,056 g/L CaCl2 (2H2O), 5,6 g/L KCl, 2,6274 g/L NaH2PO4, 3,408 g/L MgCl2 (6H2O), (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ));</li>
		<li>Roztwór zapasowy II (26,88 g/L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwory zapasowe barwników fluorescencyjnych. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, oba barwniki przechowujemy w alikwotach po 30 μl w temperaturze -20°C, co jest ilością wystarczającą na jeden eksperyment:
	<ol class="lalpha">
		<li>Roztwór zapasowy barwnika wrażliwego na napięcie RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA), roztwór o stężeniu 1,25 mg/mL w dimetylosulfotlenku (DMSO, Sigma, St. Louis, MO);</li>
		<li>Roztwór zapasowy wskaźnika wapnia Rhod-2AM (Invitrogen, Carlsbad, CA), roztwór o stężeniu 1 mg/mL w DMSO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wcześniej roztwór zapasowy blebbistatyny, rozprzęgacza sprzężenia pobudzenie-skurcz (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, roztwór 2 mg/mL w DMSO) i przechowywać rozpuszczoną blebbistatynę w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów perfuzyjnych i zestawu eksperymentalnego7
<ol start="4">
	<li>Przygotować świeżą porcję 2L roztworu Tyrode'a (128,2mM NaCl, 1,3mM CaCl2 (2H2O), 4,7mM KCl, 1,05mM MgCl2 (6H2O), 1,19mM NaH2PO4, 20mM NaHCO3, 11,1mM D-glukozy w wodzie dejonizowanej, pH=7,35±0,05). W przypadku użycia roztworu zapasowego do przygotowania 2L roztworu Tyrode'a (ilość wystarczająca na jeden eksperyment), należy wziąć 1750 mL wody dejonizowanej i zmieszać z 125 mL Stock I, 125 mL Stock II oraz 4g glukozy.</li>
	<li>Włączyć dwie pompy systemów perfuzyjnych. Ustawić pompę perystaltyczną (Peri-Star, WPI, Sarasota, USA) wykorzystywaną do perfuzji wstecznej na 40 mL/min. Ustawić drugą pompę perystaltyczną (Cole-Parmer Masterflex Peristalic Pump L/S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) wykorzystywaną do superfuzji i powrotu perfuzatu do zbiornika magazynowego na 80 mL/min.</li>
	<li>Przepłukać system perfuzyjny 70% etanolem przez 30 min, a następnie 2L wody dejonizowanej.</li>
	<li>Po usunięciu całej wody dejonizowanej z komory, wprowadzić w obieg roztwór Tyrode'a, przepuszczając go przez filtr 5-μm (Millipore, Billerica, MA, USA). Podgrzać perfuzat do +37°C za pomocą płaszcza wodnego i cyrkulatora (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) oraz natlenić perfuzat poprzez przepuszczanie gazu O2/CO2 (95% / 5%) do roztworu. Monitorować pH roztworu za pomocą pH-metru (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) i regulować tempo bąbelkowania O2/CO2, aby utrzymać pH na poziomie 7,35 ± 0,05. Kontynuować monitorowanie pH i temperatury podczas eksperymentu.</li>
	<li>Podwójny aparat do mapowania optycznego składa się z dwóch kamer CMOS MiCAM Ultima-L (SciMedia, Costa Mesa, CA) o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (100x100 pikseli, 230±20 μm na piksel) i czasowej (1 000-3 000 klatek/s). Przed kamerą przeznaczoną do obrazowania wapnia należy zamocować filtr pasmowy (590±15 nm, Thorlabs, Newton, NJ), natomiast przed kamerą przeznaczoną do obrazowania napięcia należy umieścić filtr długoprzepustowy (&gt;700 nm, Thorlabs, Newton, NJ). Kamery są rozmieszczone prostopadle do siebie za pomocą uchwytu, który zawiera lustro dichroniczne (odcięcie 635 nm, Omega Optical, Brattleboro, VT). Bezpośrednio pod uchwytem kamer znajduje się soczewka (Nikon NIKKOR 55 mm 1:1.4 235052), która skupia światło emisyjne pochodzące z serca na lustrze dichronicznym. Odległość robocza wynosi około 3cm. 
	Światło wzbudzenia jest generowane przez lampę halogenową (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) i przechodzi przez filtr cieplny, migawkę oraz filtr pasmowy (520±45 nm). Elastyczny światłowód kieruje przefiltrowane światło na preparat, a migawka zapewnia, że preparat jest naświetlany tylko podczas akwizycji obrazu, aby uniknąć fotobleachingu barwników.</li>
	<li>Przygotować wcześniej elektrody Ag/AgCl2 do stymulacji i detekcji i zainstalować je w komorze przed umieszczeniem serca. Upewnić się, że wzmacniacze i filtry są ustawione na odpowiednie poziomy.</li>
</ol>
3. Pobranie serca myszy, kaniulacja i przygotowanie perfuzji w układzie Langendorffa
<ol start="10">
	<li>Zanurz mysz w narkozie za pomocą ketaminy/ksylazyny (ketamina, 80mg/kg masy ciała; ksylazyna, 10 mg/kg masy ciała) oraz heparyny (100 jednostek) podanej w zastrzyku doszpikowym. Odpowiedni poziom znieczulenia należy potwierdzić brakiem odruchu bólowego.</li>
	<li>Po wykonaniu nacięcia wzdłuż mostka szybko wyciąć serce i wypłukać je w natlenionym (95% O2, 5% CO2) roztworze Tyrode'a o stałej temperaturze (37±1°C).</li>
	<li>Używając mikroskopu sekcyjnego, szybko zlokalizować aortę i wykonać czyste cięcie w poprzek aorty wstępującej poniżej prawej tętnicy podobojczykowej. Krótki odcinek aorty zostaje następnie przymocowany do specjalnie wykonanej kaniuli 21-gauge z rozszerzoną końcówką. Do utrwalenia serca na kaniuli używa się czarnej plecionej nici jedwabnej 4-0 (Surgical Specialties Corporation, Reading, PA). Po kaniulacji serce jest poddawane perfuzji wstecznej oraz superfuzji roztworem Tyrode'a. Szybkość perfuzji wstecznej reguluje się w zakresie 2-5 mL/min, aby utrzymać ciśnienie w aorcie między 60 a 80 mmHg (przetwornik ciśnienia, World precision instruments Inc (WPI), Sarasota, USA; wzmacniacz mostkowy TBM4M, WPI, Sarasota, USA).</li>
	<li>Po kaniulacji serca należy wyciąć i usunąć płuca, grasicę oraz tkankę tłuszczową.</li>
	<li>Izolowane serce zostaje przyszpilone (Fine Science Tools) w okolicy wierzchołka do dna komory perfuzyjnej (powleczonej Sylgardem), aby zapobiec ruchom wywoływanym przez strumień płynu. Prawe i lewe uszka przedsionków są również rozciągane i przyszpilane (Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA) do dna komory, co zapewnia maksymalną powierzchnię do pomiarów optycznych przedsionków. 
	Bardzo ważne! Do lewej komory, przez żyły płucne, wprowadza się małą rurkę silikonową i mocuje ją nicią jedwabną do pobliskiej tkanki łącznej. Zapobiega to zastojowi roztworu i zakwaszeniu perfuzatu uwięzionego w lewej komorze, co jest szczególnie istotne po zahamowaniu skurczów komór za pomocą odsprzęgacza wzbudzenia i skurczu (patrz Część 4 krok 19).</li>
	<li>Na powierzchni serca umieszcza się specjalnie wykonaną elektrodę do prowadzenia stymulacji rozrusznikowej, generowanej przez Master-8 (A.M.P Instruments Ltd, Jerozolima, Izrael) lub PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australia).</li>
	<li>Na powierzchni roztworu nad sercem mocuje się małe szkiełko zakrywkowe, aby zredukować artefakty ruchowe wynikające z wibracji roztworu.</li>
	<li>Skupić światło wzbudzenia na sercu. Dodatkowo dostosować odległość między aparaturą z podwójną kamerą a sercem, aby uzyskać maksymalną rozdzielczość.</li>
	<li>Wyłączyć wszystkie światła w pomieszczeniu i rozpocząć rejestrację elektryczną przy użyciu PowerLab 26T.</li>
</ol>
4. Obciążenie barwnikami wrażliwymi na napięcie i wapń oraz odsprzęgaczem pobudzenia i skurczu
<ol start="19">
	<li>Podgrzać 0,6 mL blebbistatyny. Wymieszać 0,5 mL blebbistatyny z perfuzatem w zbiorniku magazynującym. Pozostałe 0,1 mL blebbistatyny rozcieńczyć w 1 mL roztworu Tyrode'a i powoli wstrzyknąć (w ciągu 20 minut) przez port do podawania leków znajdujący się w pobliżu kaniuli. Obserwować, jak blebbistatyna stopniowo redukuje artefakty ruchowe.</li>
	<li>Rozcieńczyć 30 μL roztworu zapasu barwnika napięciowo-czułego RH237 w 1 mL roztworu Tyrode'a i powoli wstrzyknąć w ciągu 5-7 minut przez ten sam port wstrzyknięcia, co w przypadku blebbistatyny.</li>
	<li>30 μL wskaźnika wapnia Rhod-2 AM wymieszać w stosunku 1:1 z Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, roztwór 20% w DMSO), a następnie rozcieńczyć w 1 mL roztworu Tyrode'a i powoli podać w ciągu 5-10 min przez ten sam port wstrzyknięcia.</li>
	<li>Odczekać 5-10 minut, aż blebbistatyna i barwniki dotrą do błony komórkowej i cytozolu. Kontynuować protokół, gdy ruch zostanie całkowicie zahamowany.</li>
	<li>Bieżąco monitorować zapisy EKG przez cały czas trwania procedury, aby zapewnić prawidłową funkcję elektryczną serca.</li>
	<li>Rozpocząć rejestrację sygnałów fluorescencyjnych przy użyciu specjalistycznego oprogramowania SciMedia (SciMedia, Costa Mesa, CA).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
<img alt="Układ mikroskopu optycznego do obrazowania fluorescencyjnego z filtrami; analiza poziomu Ca²⁺ w komórkach." src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Układ eksperymentalny do perfuzji, rejestracji elektrycznej i mapowania optycznego. 
EM=emisja; Lp=filtr długoprzepustowy
<img alt="Badanie EKG, układ stymulacji serca; obejmuje sygnały z przedsionków i komór, elektrodę, schemat EKG." src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przygotowanie eksperymentalne i przykłady sygnałów zarejestrowanych podczas stymulacji komór. Po lewej: sygnały EKG są zbierane za pomocą dyskowych elektrod Ag/AgCl2 (góra) oraz przedstawiono przykład protokołu stymulacji S1S1 (dół). Środek: preparat serca myszy w układzie Langendorffa. Po prawej: przedstawiono reprezentatywne optyczne potencjały czynnościowe oraz sygnały przejściowe wapnia z przedsionków (góra) i komór (dół). Żółta strzałka (góra) wskazuje rozproszenie sygnału fluorescencyjnego pochodzące z komór, widoczne w rejestracjach z przedsionków. 
LV=lewa komora; RV=prawa komora; LA=lewy przedsionek; RA=prawy przedsionek
<img alt="Rejestracja sygnałów serca za pomocą elektrod; analiza wykresów Vm i CaT; konfiguracja elektrod, wykres wyników." src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywne zapisy optyczne Vm oraz CaT z komór serca myszy typu dzikiego. A. Preparat eksperymentalny z układem równomiernie rozmieszczonych punktów zaznaczonych czarnymi kropkami, których zapisy optyczne przedstawiono w (C). B. Przykładowy przebieg Vm i CaT z centralnego punktu układu (patrz ramka w (C)). C. Vm (niebieski) i CaT (czerwony) z układu równomiernie rozmieszczonych punktów. Sygnały zostały pogrupowane w obszary 3x3.
<img alt="Schemat czasu aktywacji serca i dynamiki napięcia; obejmuje wykresy stymulacji, Vm, dV/dt." src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Mapa aktywacji i przewodnictwo. A. Przykład mapy aktywacji z serca myszy typu dzikiego z zaznaczonymi białymi strzałkami kierunkami poprzecznym (T) i podłużnym (L). B. Sygnały Vm (góra) i dV/dt (dół) odpowiadające trzem punktom widocznym na mapie A (T1, T2, T3; L1, L2, L3).
<img alt="Porównanie map serca APD80 i CaD80 w warunkach kontrolnych i po podaniu ISO; potencjał czynnościowy, przejściowy wzrost poziomu wapnia." src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Analiza czasu trwania potencjału czynnościowego i przejściowego wzrostu poziomu wapnia. A. Przedstawiono mapy czasu trwania potencjału czynnościowego przy 80% repolaryzacji (APD80) oraz czasu trwania przejściowego wzrostu poziomu wapnia przy 80% relaksacji (CaD80) dla serca w warunkach kontrolnych (lewo) oraz po zastosowaniu 30 nM izoproterenolu (prawo). Żółto-zielony kolor w komorach (prawo) wskazuje na skrócenie APD80 i CaD80 pod wpływem izoproterenolu. B. Przykładowe zapisy APD80 i CaD80 z komór (góra) i przedsionków (dół) myszy typu dzikiego.

<ol><li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+maps+of+intracellular+%5BCa2%2B%5Di+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts.</a> Circulation. 90, 1-1 (1994).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+repolarization+and+refractoriness+from+intact+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts.</a> Circulation. 90, 1469-1480 (1994).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Pruvot, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+cycling+versus+restitution+in+the+mechanism+of+repolarization+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans.</a> Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFast%2C+VG+%22Practical+methods+in+cardiovascular+research%22">Practical methods in cardiovascular research</a>. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).</li>
<li>Glukhov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. , (2009).</li>
<li>Baker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dispersion+of+repolarization+and+refractoriness+in+transgenic+mouse+hearts+promotes+reentrant+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia.</a> Circ Res. 86, 396-407 (2000).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+electrode+polarization+in+the+far+field%3A+implications+for+external+defibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).</li>
<li>Hammouda, M., Kinosita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coronary+circulation+in+the+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The coronary circulation in the isolated heart.</a> J Physiol. 61, 615-628 (1926).</li>
<li>Salama, G., Hwang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).</li>
<li>Lou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li>
<li>Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym eksperymencie zmodyfikowaliśmy metodę perfuzji Langendorffa poprzez dodanie małej rurki silikonowej, co jest szczególnie istotne po zahamowaniu skurczów komór za pomocą odsprzęgacza pobudzenia i skurczu. Rurka silikonowa służy do zapobiegania zastojowi roztworu, zakwaszeniu płynu perfuzyjnego oraz rozwojowi niedokrwienia w lewej komorze. Serce myszy jest bardzo wrażliwe na hipotermię; w związku z tym wahania temperatury w obrębie serca spowodowałyby sztuczne różnice w czasie trwania potencjału czynnościowego. W konsekwencji w komorze perfuzyjnej zastosowano system grzewczy, aby utrzymać stałą temperaturę 37°C przez cały czas trwania eksperymentu8. Ponieważ model Langendorffa nie zachowuje unerwienia serca, w celu zbadania fizjologicznego napięcia współczulnego i przywspółczulnego należy rozważyć dodanie neuroprzekaźników do perfuzatu9. Oprócz perfuzji wstecznej, zastosowanie superfuzji serca pomaga utrzymać odpowiednie parametry środowiskowe, takie jak pH i temperatura. W tej metodzie serce poddawane perfuzji Langendorffa umieszczono poziomo. Można również zastosować pionowy układ perfuzji Langendorffa10, co jednak może prowadzić do nieco innych wyników w zakresie mechaniki serca11. Oprócz kamer CMOS dostępne są również alternatywne detektory, które mogą być wykorzystane do jednoczesnego mapowania Vm oraz CaT12.
Zastosowanie kamer CMOS o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej zapewnia dokładność rejestracji; jednak sygnały mapowania optycznego nie pochodzą z pojedynczej komórki. Zamiast tego każdy sygnał fluorescencyjny pochodzi z setek lub tysięcy komórek, w zależności od powiększenia optycznego. Znacznie silniejsza fluorescencja komór czasowych może zniekształcać sygnały przedsionków wskutek rozpraszania optycznego; dlatego wymagana jest ostrożna interpretacja sygnałów rejestrowanych optycznie. Innym ograniczeniem preparatu mysiego jest zniekształcenie sygnału i szum wywołane krzywizną powierzchni wynikającą z niewielkich rozmiarów serca13. Pomiary prędkości przewodzenia mogą być zmienione nie tylko przez krzywiznę serca myszy, ale także przez polaryzację elektrod i elektrody wirtualne. Aby uzyskać dokładność map prędkości przewodzenia, anizotropii aktywacji i repolaryzacji, niezbędne jest prawidłowe ustawienie ostrości kamery na powierzchni serca.
W tej metodzie zapisy EKG w czasie rzeczywistym mogą uzupełniać optyczne badanie elektrofizjologii serca. W protokole zastosowano barwnik wrażliwy na napięcie (RH237) oraz wskaźnik wapnia (Rhod-2AM) ze względu na ich szybką odpowiedź, podobne wzbudzenie i odmienne widma emisji3,7. Poza RH237 i Rhod-2AM istnieją alternatywne kombinacje barwników, które można wykorzystać do pomiaru Vm i CaT3. Wykazano, że nowy barwnik wrażliwy na napięcie, PGHI, o dużym przesunięciu Stokesa (&gt;200nm), pozwala na uzyskanie lepszych sygnałów Vm i CaT dzięki większemu rozdzieleniu długości fal emisji między PGHI a Rhod-2AM14. Przyszłe ulepszenia mogą skupić się na badaniu nowych sond fluorescencyjnych, opracowywaniu nowych detektorów obrazowania oraz udoskonalaniu oprogramowania do przetwarzania obrazów. Ważnymi kierunkami rozwoju mapowania optycznego są również wyższa rozdzielczość oraz nowe modalności obrazowania optycznego dla mapowania optycznego 3D5.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatyna</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>Invitrogen</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>Invitrogen</td><td>R1244</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylosulfoksyd (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML856/" target="_blank"&gt;PowerLab 26T &lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Serce myszy jest popularnym modelem w badaniach sercowo-naczyniowych ze względu na dostępność niskokosztowych technologii inżynierii genetycznej u tego gatunku. Fenotypowanie fizjologiczne układu sercowo-naczyniowego serca myszy można łatwo przeprowadzić za pomocą obrazowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem różnych sond do pomiaru potencjału błonowego (Vm), przejściowych stężeń wapnia (CaT) oraz innych parametrów. Sprzężenie wzbudzenie-skurcz charakteryzuje się dynamiką potencjału czynnościowego i wapnia wewnątrzkomórkowego; dlatego niezwykle ważne jest jednoczesne mapowanie zarówno Vm, jak i CaT w tym samym miejscu serca1-4. Jednoczesne mapowanie optyczne z serc myszy perfundowanych w aparacie Langendorffa ma potencjał do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw niewydolności serca, arytmii, chorób metabolicznych i innych schorzeń serca. Wizualizacja aktywacji, prędkości przewodzenia, czasu trwania potencjału czynnościowego oraz innych parametrów w wielu miejscach nie jest możliwa do osiągnięcia w badaniach na poziomie komórkowym, natomiast zostaje skutecznie rozwiązana dzięki mapowaniu optycznemu1,5,6. W niniejszej pracy przedstawiamy konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne dla jednoczesnego mapowania optycznego Vm i CaT w sercach myszy z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną, z wykorzystaniem najnowocześniejszej technologii obrazowania CMOS. Spójne zapisy optyczne uzyskane tą metodą wykazują, że jednoczesne mapowanie optyczne serc myszy perfundowanych w aparacie Langendorffa jest zarówno wykonalne, jak i wiarygodne.

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Serce myszy jest popularnym modelem w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym ze względu na dostępność niskokosztowych technologii inżynierii genetycznej u tego gatunku. ...

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne mapowanie optyczne potencjału błonowego oraz przejściowego stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych w układzie LOR. Jest to osiągane poprzez najpierw wycięcie nienaruszonego serca myszy, a następnie kaniulację aorty i rozpoczęcie perfuzji LOR. Kolejnym krokiem jest unieruchomienie serca poprzez załadowanie sprzęgacza pobudzenia i skurczu, a następnie przypięcie serca do komory perfuzyjnej.Ostatnie kroki polegają na wprowadzeniu barwników optycznych i przygotowaniu środków ograniczających artefakty ruchowe podczas eksperymentu. Obrazy optyczne są uzyskiwane poprzez zbieranie światła emitowanego przez serce za pomocą kamer my cam Ultima LC Moss. Hej, nazywam się di.Jestem studentem studiów magisterskich na Washington University. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroelektrody, jest to, że mapowanie optyczne pozwala na uzyskanie większej rozdzielczości przestrzennej na całej powierzchni serca. Cześć, jestem Matt Sulkin.Jestem studentem studiów podyplomowych na Washington University. Ta metoda, jeśli zostanie prawidłowo wykonana, może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na wiele pytań z zakresu elektrofizjologii serca, takich jak podłoże arytmogenezy. Należy rozpocząć od skonfigurowania jednej pompy perystaltycznej w celu cyrkulacji roztworów z prędkością 40 milliliters per minute.Następnie ustaw drugą pompę perystaltyczną na 80 ml/min. Pompa ta zawraca płyn Perfuse eight z powrotem do zbiornika magazynującego i natleniającego. Włącz pompy i przemyj układ jednym litrem 70% etanolu przez 30 minut w obiegu zamkniętym.Po tym płukaniu należy użyć dwóch litrów wody dejonizowanej bez recyrkulacji. Po odprowadzeniu wody należy wprowadzić dwa litry roztworu Tyro i przepuścić je przez filtr o wielkości oczek 5 µm. Perfuzat należy ogrzać do 37 °C za pomocą płaszcza wodnego i cyrkulatora, a do roztworu należy wprowadzać natleniony gaz.Dostosuj tempo przepływu gazu, aby utrzymać pH na poziomie 7,35 ± 0,05. Przez cały czas trwania eksperymentu monitoruj zarówno pH, jak i temperaturę. Aparatura do podwójnego mapowania optycznego składa się z dwóch szybkich kamer CMOS, które potrafią rejestrować obrazy o rozdzielczości 100 × 100 pikseli z częstotliwością 3000 klatek na sekundę.Zamocuj filtr pasmowo-przepustowy do kamery do obrazowania wapnia, a filtr długoprzepustowy do kamery do obrazowania napięcia na uchwycie do dwóch kamer. Zamocuj lustro dichroiczne i soczewkę w taki sposób, aby światło emisji pochodzące z serca było ogniskowane przez soczewkę na lustro. Następnie zamocuj obie kamery do uchwytu i ustaw je tak, aby były względem siebie prostopadłe.Następnie należy przygotować światło wzbudzenia. Światło jest generowane przez lampę halogenową i kierowane przez elastyczny światłowód. Przeprowadź światło przez filtr cieplny, migawkę ograniczającą czas ekspozycji oraz filtr pasmowy wzbudzenia.Na koniec przygotuj elektrody srebrowe oraz srebrowo-chlorkowe, montując je w komorze. Po ponownym sprawdzeniu i dostrojeniu poziomów na wzmacniaczach i filtrach układ jest gotowy do badania serca. Przed przystąpieniem do procedury znieczul mysz, stosując mieszankę ketaminy i ksylazyny z 100 jednostkami heparyny.Upewnij się, że zwierzę nie wykazuje odruchu bólowego, wykonując uciśnięcie palca u stopy. Po wykonaniu nacięcia w połowie mostka szybko usuń serce wraz z otaczającymi go tkankami. Następnie, korzystając z mikroskopu sekcyjnego, szybko zlokalizuj aortę i wykonaj precyzyjne cięcie w poprzek aorty wstępującej poniżej prawej tętnicy podobojczykowej.Następnie przymocuj krótki odcinek aorty do specjalnie wykonanej kaniuli 21G, używając czterech splotów jedwabnych czarnych rozmiaru 4-0. Po kaniulacji wykonaj wsteczną perfuzję i nadciśnieniową perfuzję serca roztworem Tyrode'a, dostosowując szybkość przepływu tak, aby utrzymać ciśnienie w aorcie w zakresie od 60 do 80 mmHg, mierzone za pomocą przetwornika ciśnienia.Następnie przeprowadź sekcję i usuń otaczający płat płuca, grasicę oraz tkankę tłuszczową. Teraz wprowadź rurkę silikonową do lewej komory poprzez żyły płucne. Przyszyj rurkę do sąsiedniej tkanki łącznej.Ten bardzo ważny krok zapobiega zastojowi i zakwaszeniu Perfuse eight uwięzionego w lewej komorze, szczególnie po zniesieniu skurczów komór. Aby zapobiec ruchom serca wywołanym przez Perfuse eight, przymocuj serce szpilką do dna komory perfuzyjnej z powłoką sill guard w obrębie jego wierzchołka. Ponadto rozciągnij i przymocuj szpilkami wyrostki prawego i lewego przedsionka, aby zwiększyć powierzchnię przedsionków w konfiguracji pionowej.Pozwoli to zmaksymalizować powierzchnię rejestracji. Aby przeprowadzić stymulację rozrusznikową, przymocuj wykonaną na zamówienie elektrodę do powierzchni serca. W celu zredukowania artefaktów ruchowych, przymocuj małe szkiełko zakrywkowe nad sercem na powierzchni roztworu.Należy to zrobić, klinując szkło pomiędzy kilkoma pinami. W ramach końcowych przygotowań należy skupić światło wzbudzenia na sercu i ustawić kamery tak, aby uzyskać obraz optyczny, a następnie przystąpić do wprowadzania barwnika. Należy stale monitorować zapis EKG, aby upewnić się, że funkcja elektryczna serca jest prawidłowa.Zacznij od ogrzania statyny BLE do temperatury pokojowej. Następnie wymieszaj 0,5 ml statyny BLE z roztworem profuse eight w zbiorniku magazynującym i rozcieńcz pozostałe 0,1 ml statyny BLE w 1 ml roztworu Tyros. Przez następne 20 minut powoli wstrzykuj statynę BLE w roztworze tyros przez port do podawania leków znajdujący się w pobliżu kaniuli.Statyna BLE stopniowo zredukuje artefakty ruchowe. Następnie należy rozcieńczyć 30 µL barwnika wrażliwego na napięcie w 1 mL roztworu tyro i powoli wstrzyknąć tę mieszaninę w ciągu od pięciu do siedmiu minut do tego samego portu do podawania leków. Następnie należy ponownie przygotować taką samą mieszaninę.Tym razem należy dodać dodatkowe 30 µL wskaźnika wapnia. Mieszaninę tę należy powoli aplikować przez ten sam port w czasie od 5 do 10 minut. Po wstrzyknięciu wskaźnika wapnia należy odczekać kolejne 5 do 10 minut, aż statyna BLEs całkowicie zahamuje ruch, a barwniki przenikną do komórek, przed przystąpieniem do eksperymentu.Przygotowano preparat serca. Zgodnie z protokołem, sygnały EKG rejestrowano podczas stymulacji komór w trybie S1-S1. Potencjały czynnościowe oraz sygnały przejściowe wapnia rejestrowano z przedsionków po lewej stronie i komór po prawej stronie.Strzałka wskazuje miejsce wystąpienia rozproszenia sygnału z komór; poprzez grupowanie nagrań z kamery w jednostkach trzech na trzy piksele, na podstawie danych z macierzy można wyświetlić układ stanów przejściowych wapnia oraz potencjałów czynnościowych. Można w ten sposób stworzyć rysunek obrazujący przewodzenie potencjału czynnościowego. Dane z trzech kolejnych punktów na osi poprzecznej i podłużnej pokazują zmianę amplitudy wraz z rozprzestrzenianiem się potencjału czynnościowego po powierzchni komory.Podobnie można przygotować rysunek przedstawiający czas trwania potencjału czynnościowego oraz przejściowych zmian stężenia wapnia. Po lewej stronie przedstawiono warunki kontrolne, a po prawej wynik po interwencji. Do serca podano izoproterenol, co wyraźnie skraca czas trwania zarówno przejściowych zmian stężenia wapnia, jak i potencjałów czynnościowych.Po opanowaniu, technikę tę można przeprowadzić w ciągu dwóch do trzech godzin, postępując zgodnie z opisaną procedurą. W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące okresu refrakcji węzła AV, można zastosować inne metody, takie jak protokół stymulacji.

optical-mapping-action-potentials-calcium-transients-mouse

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i wapniowych przejść w sercu myszy

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Ten artykuł opisuje technikę używaną do wykonywania dwukanałowego mapowania optycznego w monowarstwach hodowlanych komórek przedsionkowych HL-1. Ten unikalny protokół umożliwia jednoczesną wizualizację zarówno aktywności wapnia (Ca), jak i napięcia (Vm) w tym samym obszarze w celu szczegółowego wykrywania i analizy właściwości elektrofizjologicznych monowarstw kultur.

Dwukanałowe mapowanie optyczne napięcia i wapnia w monowarstwie miocytów przedsionkowych HL-1 z hodowlą

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Tutaj prezentujemy protokół optycznego mapowania aktywności elektrycznej z prawego przedsionka myszy, a zwłaszcza węzła zatokowo-przedsionkowego, w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Ten protokół wprowadza dwubarwne optyczne mapowanie serc myszy uzyskanych od zwierząt typu dzikiego i knock-in dotkniętych katacholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym, w tym elektrofizjologiczne pomiary napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+ o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

Poznaj metodę optycznego mapowania potencjałów czynnościowych i wapnia w izolowanych sercach myszy. Technika ta umożliwia badanie elektrofizjologii serca z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Przeglądaj więcej filmów