Optyczne mapowanie potencjałów czynnościowych i stanów przejściowych wapnia w sercu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne optyczne mapowanie potencjału transbłonowego i wewnątrzkomórkowego przejściowego wapnia w nienaruszonych, izolowanych perfundowanych sercach myszy LOR. Osiąga się to poprzez najpierw wycięcie nienaruszonego serca myszy, a następnie kaniulację aorty i rozpoczęcie perfuzji LOR. Następnym krokiem jest unieruchomienie serca poprzez załadowanie skurczu wzbudzenia na sprzęgacz, a następnie przypięcie serca do komory perfuzyjnej.

Ostatnim krokiem jest załadowanie barwników optycznych i przygotowanie się do redukcji artefaktów ruchu podczas eksperymentu. Obrazy optyczne uzyskuje się poprzez zbieranie światła emitowanego przez serce za pomocą moich kamer cam Ultima LC Moss. Hej, mam na imię di.

Jestem absolwentem Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroelektroda, jest to, że mapowanie optyczne pozwala na uzyskanie większej rozdzielczości przestrzennej na całej powierzchni serca. Cześć, nazywam się Matt Sulkin.

Jestem doktorantem na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Ta metoda, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, może pomóc odpowiedzieć na wiele pytań z zakresu elektrofizjologii serca, takich jak podstawy arytmogenezy. Zacznij od skonfigurowania jednej pompy perystaltycznej do cyrkulacji roztworów z prędkością 40 mililitrów na minutę.

Następnie ustaw drugą pompę perystaltyczną na 80 mililitrów na minutę. Pompa ta zawraca Perfuse ósemkę z powrotem do zbiornika podtrzymującego i natleniającego. Włącz pompy i umyj układ jednym litrem 70% etanolu przez 30 minut z recyrkulacją.

Po tym umyciu przelej dwa litry wody dejonizowanej bez recyrkulacji. Po odprowadzeniu wody należy wprowadzić do cyrkulacji dwa litry roztworu Tyro i przepuścić go przez filtr o grubości pięciu mikronów. Ogrzej perfuzję od ośmiu do 37 stopni Celsjusza za pomocą płaszcza wodnego, a cyrkulator wprowadzi natleniony gaz do roztworu.

Dostosuj szybkość bulgotania gazu, aby utrzymać pH na poziomie 7,35 plus minus 0,05. Monitoruj zarówno pH, jak i temperaturę podczas eksperymentu. Podwójny aparat do mapowania optycznego składa się z dwóch szybkich kamer z mchu C, które mogą rejestrować obraz o wymiarach 100 na 100 pikseli przy 3000 klatkach na sekundę.

Podłącz filtr pasmowoprzepustowy do kamery do obrazowania wapnia i podłącz filtr długoprzepustowy do kamery obrazowania voltage na podwójnym uchwycie kamery. Przymocuj zwierciadło kierunkowe i soczewkę tak, aby światło emisyjne pochodzące z serca było skupiane na lustrze przez soczewkę. Przymocuj również dwie kamery do uchwytu i ustaw je tak, aby były prostopadłe do siebie.

Następnie ustaw światło wzbudzenia. Światło jest generowane przez lampę halogenową i kierowane przez elastyczny światłowód. Przepuść światło przez filtr cieplny, przesłonę ograniczającą ekspozycję i filtr pasma wzbudzenia.

Na koniec przygotuj elektrody srebra i chlorku srebra, instalując je w komorze. Po dwukrotnym sprawdzeniu i wyregulowaniu poziomów na wzmacniaczach i filtrach, konfiguracja jest gotowa na serce. Użyj koktajlu ketaminy i ksylazyny ze 100 jednostkami heparyny, aby znieczulić mysz przed kontynuowaniem.

Upewnij się, że zwierzę nie ma odruchu bólowego, używając uszczypnięcia palca u nogi. Po wykonaniu środkowego nacięcia mostka szybko usuń serce i otaczające tkanki. Następnie, za pomocą mikroskopu preparacyjnego, szybko zidentyfikuj aortę i wykonaj czyste cięcie w poprzek aorty wstępującej poniżej prawej tętnicy podobojczykowej.

Teraz przymocuj krótki odcinek aorty do wykonanej na zamówienie kaniuli o rozmiarze 21 za pomocą czterech czarnych plecionych jedwabnych szwów Po kaniulacji retro znacznie perfu i super zrost serca. Za pomocą roztworu Tyro dostosuj natężenie przepływu, aby utrzymać ciśnienie w aorcie w zakresie od 60 do 80 milimetrów. Rtęć mierzona przez przetwornik ciśnienia.

Teraz wypreparuj i usuń otaczające płuca, grasicę i tkankę tłuszczową. Teraz włóż silikonową rurkę do lewej komory przez żyły płucne. Zszyj rurkę do pobliskiej tkanki łącznej.

Ten bardzo ważny krok zapobiega przekrwieniu i zakwaszeniu Perfuse eight uwięzionego w lewej komorze, zwłaszcza po zahamowaniu skurczów komorowych. Aby zapobiec wywołanym przez Perfuse ośmiu ruchom serca, przypnij serce do dna komory perfuzyjnej pokrytej osłoną progu na jej wierzchołku. Ponadto rozciągnij i przypnij prawy i lewy przyrostek przedsionka, aby zwiększyć powierzchnię przedsionków w konfiguracji pionowej.

Zmaksymalizuje to powierzchnię nagrywania. Aby przeprowadzić stymulację stymulacji, przymocuj specjalnie wykonaną elektrodę do powierzchni serca. Aby zredukować artefakty ruchu, przymocuj małą szklankę nakrywkową nad sercem na powierzchni roztworu.

Zrób to, klinując szkło między kilkoma kołkami. Jako końcowe przygotowania, skoncentruj światło wzbudzenia na sercu i ustaw kamery, aby uzyskać obraz optyczny, a następnie rozpocznij ładowanie barwnika podczas ładowania matryc. Stale monitoruj zapisy EKG, aby zapewnić normalną funkcję elektryczną serca.

Zacznij od podgrzania statyn BLE do temperatury pokojowej. Następnie zmieszaj pół mililitra statyn BLEs z obfitymi ósemkami w zbiorniku retencyjnym i rozcieńcz pozostały 10 mililitr statyn BLEs w jednym mililitrze roztworu Tyros. Przez następne 20 minut powoli wstrzykuj statynę BLEs do tyros przez port leku w pobliżu kaniuli.

Statyna BLEs będzie stopniowo zmniejszać artefakt ruchu. Następnie rozcieńczyć 30 mikrolitrów barwnika wrażliwego na napięcie w jednym mililitrowym roztworze tyro i powoli wstrzykiwać tę mieszaninę przez pięć do siedmiu minut do tego samego portu leku. Następnie ponownie przygotuj tę samą mieszankę.

Tym razem dodając dodatkowe 30 mikrolitrów wskaźnika wapnia. Powoli nakładaj tę mieszaninę przez pięć do 10 minut przez ten sam port. Po wstrzyknięciu wskaźnika wapnia odczekaj dodatkowe pięć do 10 minut, aż statyna BLE całkowicie stłumi ruch i aż barwniki dostaną się do komórek przed przystąpieniem do eksperymentu.

To przygotowanie serca zostało wykonane. Zgodnie z protokołem, sygnały EKG były rejestrowane podczas stymulacji komorowej od stymulacji S jeden S jeden. Potencjały czynnościowe i przejściowe sygnały wapnia rejestrowano z przedsionków po lewej stronie i komór po prawej.

Strzałka pokazuje, gdzie nastąpiło rozpraszanie sygnału z komór poprzez binowanie nagrań z kamery w jednostkach trzy piksele na trzy piksele, na podstawie danych z danych z tablicy można wyświetlić tablicę stanów przejściowych wapnia i potencjałów czynnościowych. Można skonstruować rysunek przedstawiający przewodzenie potencjału czynnościowego. Dane z trzech kolejnych punktów na osi poprzecznej i podłużnej pokazują zmianę amplitudy wraz z propagacją potencjału czynnościowego po powierzchni komory.

Podobnie można skonstruować rysunek przedstawiający potencjał czynnościowy i czasy trwania przejściowych wapnia. Spowoduje to wyświetlenie warunku kontrolnego po lewej stronie po prawej stronie. Do serca podano zastrzyk z izoproterenolu, który wyraźnie skraca czas trwania zarówno stanów przejściowych wapnia, jak i potencjałów czynnościowych.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak protokół stymulacji, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak te dotyczące okresu refrakcji węzła przedsionkowo-komorowego.