Name: Prosty protokół Chelex do ekstrakcji DNA z Anopheles spp. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę ekstrakcji DNA z komarów Anopheles i pasożytów malarii przy użyciu żywicy Chelex. Technika ta umożliwia szybką identyfikację gatunkową wektorów oraz genotypowanie zakażeń w zaledwie 37 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni wodzom, starszyźnie oraz społecznościom Macha za niezłomną współpracę podczas terenowego pobierania próbek komarów. Dr Doug Norris i Rebekah Kent zapewnili nieocenioną wiedzę ekspercką w zakresie protokołu wysalania. Praca ta była finansowana z systemu grantów pilotażowych Johns Hopkins Malaria Research Institute. Laboratoryjne standardy DNA komarów i pasożytów zostały uprzejmie przekazane przez MR4, American Type &amp; Culture Collection.

1. Preparatoryjna sekcja okazów komarów
<ol>
	<li>Umieść komara na małym kawałku parafilmu i zamocuj pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Przykryj kroplą wody dejonizowanej, aby zmiękczyć tkanki.</li>
	<li>Nacinaj tułowia komara dokładnie w miejscu połączenia klatki piersiowej z odwłokiem, oddzielając w ten sposób głowę i klatkę piersiową od części odwłoka.</li>
	<li>Przenieś każdą z wypreparowanych części komara do czystej, autoklawowanej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, uprzednio opisanej numerem identyfikacyjnym komara i odpowiednio oznakowanej w celu wskazania części ciała (np. „m” dla części jelita środkowego; „ht” dla części głowy i klatki piersiowej).</li>
	<li>Wyrzuć parafilm i ostrożnie przetrzyj stolik mikroskopu chusteczką Kimwipe zwilżoną 70% alkoholem przed przystąpieniem do obróbki kolejnego komara.</li>
</ol>
2. Izolacja DNA z osobników komarów
<ol>
	<li>Do probówki z próbką pipetować 20 μl wody dejonizowanej i za pomocą końcówki pipety rozetrzeć zanurzony fragment komara do uzyskania jednolitej zawiesiny.</li>
	<li>Do homogenatu z próbki dodać 100 μl autoklawowanego roztworu 1X PBS/1% saponiny i wymieszać przez krótkotrwałe, delikatne wstrząsanie w wirówce typu vortex.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min.</li>
	<li>Wirować z prędkością 20 000 x g przez 2 min, a następnie odlać nadsącz.</li>
	<li>Resuspendować osad w 100 μl 1X PBS.</li>
	<li>Ponownie wirować z prędkością 20 000 x g przez 2 min i odlać nadsącz.</li>
	<li>Poprzez delikatne wstrząsanie (5 sek) resuspendować osad w 75 μl sterylnej wody dejonizowanej oraz 25 μl 20% w/v zawiesiny żywicy Chelex-100 w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>W pokrywce probówki z próbką wykonać otwór za pomocą sterylnej igły hipodermicznej 23G wypalonej w palniku Bunsena.</li>
	<li>Gotować zawiesinę z próbki w łaźni wodnej na pływającym statywie (lub w bloku grzejnym) przez 10 min.</li>
	<li>Wirować z prędkością 20 000 x g przez 1 min i przenieść otrzymany roztwór DNA do wcześniej oznakowanej probówki do przechowywania, aby wykorzystać go jako matrycę w reakcjach PCR.</li>
</ol>
3. Plasmodium falciparum Genotypowanie i identyfikacja molekularna Anopheles spp.
<ol>
	<li>Do reakcji PCR o objętości 25 μl dodaj 2,5 μl ekstraktu DNA uzyskanego metodą Chelex, aby sprawdzić jakość DNA11, zidentyfikować gatunki Anopheles10 oraz przeprowadzić genotypowanie infekcji P. falciparum12 w jelicie środkowym i gruczołach ślinowych.</li>
	<li>Aby zmaksymalizować wydajność amplikonu, zwłaszcza w przypadku detekcji P. falciparum , do analizy PCR dodaj albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 1,5X. Zaleca się następujący skład reakcji: (2,5 μl matrycy, 0,25 μM starterów, 1,5 μM chlorku magnezu, 200 μM dNTP, 1X bufor PCR, 1,5X BSA oraz 1,0U polimerazy Taq DNA, w objętościach 25 μl).</li>
	<li>W celu sprawdzenia jakości DNA w ekstrakcie, przeprowadź amplifikację regionu genu podjednostki 4 (ND4) mitochondrialnej dehydrogenazy nikotynamidoadeninodynukleotydowej (NADH) stawonogów (startery ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT AA-3'] i ND4RV [5'-CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3']; spodziewany produkt: 400bp)11,13.</li>
	<li>Aby rozróżnić gatunki pokrewne Anopheles gambiae sl. (An. gambiae ss i An. arabiensis ), przeprowadź amplifikację regionu flankującego polimorfizmy SNP w regionie spacerów międzigenowych (IGS), (startery UN [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3'], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT-3'], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; spodziewany produkt: 390bp dla An gambiae ss, 315bp dla An arabiensis)10,11.</li>
	<li>Aby typować polimorfizmy oporności na leki antyfolianowe u P. falciparum , przeprowadź zagnieżdżoną reakcję PCR (nested PCR) w celu amplifikacji regionu flankującego kodony aminokwasowe 108, 51, 59, 16 i 164 w genie reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) pasożyta: 
	Startery pierwszej rundy: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3'] i M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3'] 
	Startery drugiej rundy: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3'] z F/ [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3'] 
	Lub 
	F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] z M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3']). 
	Przeprowadź również amplifikację regionu zawierającego kodony aminokwasowe 436, 437, 540, 581 i 613 w genie syntetazy dihydropteroianowej (DHPS) P. falciparum : 
	Startery pierwszej rundy R2 [5'- AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3'] z R/ [5'- AATTGTGTGATTTGTCCACAA3']; 
	Startery drugiej rundy 
	J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] z K/ [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3'] 
	Lub 
	K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3'] z K/, 
	Lub 
	L [5'- ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3'] z L/ [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3']12.</li>
	<li>W celu wykrycia polimorfizmów związanych z opornością na leki antyfolianowe, poddaj 4 μl amplikonu trawieniu enzymami restrykcyjnymi specyficznymi dla alleli w reakcjach o objętości 30 μl, zgodnie z instrukcjami producenta12.</li>
	<li>Nanieś 5 μl amplikonu PCR (lub 15 μl produktu trawienia restrykcyjnego) na każdą studzienkę 2% żelu agarozy barwionego bromkiem etydyny i przeprowadź elektroforezę (100 - 120V), a następnie zwizualizuj prążki w świetle UV.</li>
</ol>

<ol><li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea%3A+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N%27Zerekore%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. J. 6, 54(2007).</li>
<li>Nsimba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulphadoxine%2Fpyrimethamine+versus+amodiaquine+for+treating+uncomplicated+childhood+malaria+in+Gabon%3A+a+randomized+trial+to+guide+national+policy%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy.</a> Malar. J. 7, 31(2008).</li>
<li>Oyewole, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+and+population+dynamics+of+the+major+anopheline+vectors+in+a+malaria+endemic+area+in+southern+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria.</a> J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).</li>
<li>Harris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+proportion+of+asymptomatic+Plasmodium+infections+with+low+and+sub-microscopic+parasite+densities+in+the+low+transmission+setting+of+Temotu+Province%2C+Solomon+Islands%3A+challenges+for+malaria+diagnostics+in+an+elimination+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J.+%22%5BJournal%5D)">A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting.</a> Malar. J. . 9, 254(2010).</li>
<li>Ouedraogo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substantial+contribution+of+submicroscopical+Plasmodium+falciparum+gametocyte+carriage+to+the+infectious+reservoir+in+an+area+of+seasonal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission.</a> PLoS ONE. 4, e8410(2009).</li>
<li>Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+challenges+in+the+scaling+up+of+HIV%2C+TB%2C+and+malaria+programs%3A+The+interaction+of+health+and+laboratory+systems%2C+clinical+research%2C+and+service+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery.</a> Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).</li>
<li>Ishengoma, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+laboratories+in+the+Tanga+region+of+Tanzania%3A+the+quality+of+diagnostic+services+for+malaria+and+other+communicable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).</li>
<li>Alonso, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+agenda+for+malaria+eradication%3A+vector+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">A research agenda for malaria eradication: vector control.</a> PLoS Med. 8, e1000401(2011).</li>
<li>Grimberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+non-organic+procedure+for+the+isolation+of+genomic+DNA+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood.</a> Nucleic Acids Res. 17, 8390(1989).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome+B%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+detection+of+polymorphisms+in+the+dihydrofolate+reductase+and+dihydropteroate+synthetase+genes+by+PCR+and+restriction+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion.</a> Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).</li>
<li>Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+by+distance+among+Aedes+aegypti+populations+along+the+northeastern+coast+of+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellite+DNA+polymorphism+and+heterozygosity+among+field+and+laboratory+populations+of+Anopheles+gambiae+ss+%28Diptera+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).</li>
<li>Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+polymerase+chain+reaction-amplified+malarial+DNA+in+infected+blood+and+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes.</a> Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).</li>
<li>Al-Soud, W. A., Radstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+PCR-inhibitory+components+in+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li>
<li>Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+effect+of+pentobarbitone+on+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj uproszczona metoda Chelex umożliwia ekstrakcję wysokiej jakości DNA Anopheles spp oraz P. falciparum z okazów komarów, nadającego się do różnorodnych zastosowań PCR. Technikę tę można wykorzystać do molekularnej identyfikacji komarów będących wektorami malarii oraz do nadzoru nad allelami P. falciparum opornymi na leki u komarów w ramach krajowych programów zwalczania malarii. Zalety uproszczonej techniki Chelex obejmują prostotę, mniejszą liczbę odczynników, a tym samym niższy koszt, bezpieczeństwo oraz krótszy czas przetwarzania (37 min) w porównaniu do standardowych protokołów, takich jak metoda wysalania10 (2 godz. 47 min oraz etap inkubacji przez noc, Table 1). Wyżej wymienione zalety oraz minimalne wymagania dotyczące odczynników (3 odczynniki) w porównaniu z aktualnym protokołem standardowym (10 odczynników, Table 1)11,15, sprawiają, że uproszczony protokół Chelex jest szczególnie korzystny dla laboratoriów w krajach endemicznych, gdzie utrzymanie stałego łańcucha dostaw odczynników jest często utrudnione. Ograniczeniem tej metody jest to, że podobnie jak w przypadku protokołu standardowego, jest ona podatna na działanie inhibitorów PCR występujących w powłoce komarów16. Problem ten można jednak łatwo rozwiązać poprzez dodanie BSA do analiz. BSA z powodzeniem stosowano również jako wzmacniacz amplifikacji przeciwdziałający inhibitorom w innych zastosowaniach PCR17,18.

<table><tbody><tr><td>Chelex-100, 50-100 dry mesh</td><td>BioRad</td><td>#143-2832</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>SIGMA</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr></tbody></table>

prosty protokół chelex dla ekstrakcji dna z anopheles spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Kraje endemiczne coraz częściej wdrażają narzędzia molekularne do wydajnego typowania, identyfikacji i nadzoru nad pasożytami malarii oraz komarami-wektorami, jako integralną część swoich programów zwalczania tych patogenów1,2,3,4,5. Aby zapewnić trwałe wdrożenie tych precyzyjnych podejść w badaniach operacyjnych mających na celu wzmocnienie wysiłków na rzecz kontroli i eliminacji malarii, niezbędne są proste i przystępne cenowo metody, charakteryzujące się niskim zapotrzebowaniem na odczynniki i sprzęt6,7,8. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą technikę opartą na żywicy Chelex do ekstrakcji DNA pasożytów malarii oraz wektora z okazów komarów zebranych w terenie.
Morfologicznie zidentyfikowano 72 osobniki Anopheles gambiae sl. spośród 156 komarów odłowionych metodą oprysku pyretryną w sypialniach gospodarstw domowych w promieniu 2 000 km2 od Instytutu Malarii w Macha. Po przeprowadzeniu sekcji wszystkich 72 komarów Anopheles gambiae sl. w celu oddzielenia głowy i tułowia od odwłoka, obie części umieszczono oddzielnie w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i zanurzono w 20 μl wody dejonizowanej. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety każdą część komara homogenizowano oddzielnie do uzyskania jednorodnej zawiesiny w wodzie dejonizowanej. Z otrzymanego homogenatu z każdej części komara pobrano 10 μl, natomiast pozostałe 10 μl przeniesiono do osobnej autoklawowanej probówki 1,5 ml. Oddzielne aliquoty poddano ekstrakcji DNA przy użyciu uproszczonego protokołu Chelex lub standardowego protokołu zasalania (salting out)9,10. Protokół zasalania jest tak nazywany i powszechnie stosowany, ponieważ wykorzystuje wysokie stężenia soli zamiast niebezpiecznych rozpuszczalników organicznych (takich jak fenol i chloroform) w etapie wytrącania białek podczas ekstrakcji DNA9.
Ekstrakty wykorzystano jako matryce do amplifikacji PCR z użyciem starterów nakierowanych na gen podjednostki 4 mitochondrialnej dehydrogenazy nikotynamidoadeninowej dinukleotydowej (NADH) stawonogów (ND4) w celu sprawdzenia jakości DNA11, PCR do identyfikacji gatunków bliźniaczych Anopheles gambiae10 oraz PCR zagnieżdżonego do typowania zakażeń Plasmodium falciparum12. Porównanie z wykorzystaniem PCR oceniającego jakość DNA (ND4) wykazało 93% czułości i 82% swoistości dla metody z użyciem Chelex w stosunku do uznanego protokołu wysalania. Odpowiednie wartości czułości i swoistości wyniosły odpowiednio 100% i 78% przy zastosowaniu PCR do identyfikacji gatunków bliźniaczych oraz 92% i 80% dla PCR do detekcji P. falciparum. Nie stwierdzono istotnych różnic w proporcji próbek dających sygnał amplikonu przy zastosowaniu Chelex lub standardowego protokołu wysalania we wszystkich trzech zastosowaniach PCR. Metoda z użyciem Chelex wymagała trzech prostych odczynników i 37 min na ukończenie, podczas gdy protokół wysalania wiązał się z użyciem 10 różnych odczynników i 2 h i 47 min czasu przetwarzania, wliczając w to etap inkubacji przez noc. Nasze wyniki pokazują, że metoda z użyciem Chelex jest porównywalna z istniejącą ekstrakcją metodą wysalania i może zostać zastosowana jako proste i zrównoważone podejście w warunkach ograniczonych zasobów, gdzie utrzymanie stałego łańcucha dostaw odczynników jest często utrudnione.

Przykłady wyników testów PCR oceniających jakość ekstraktu DNA komarów (Rycina 1), Anopheles arabiensis identyfikacja molekularna (Rysunek 2) i P. falciparum wykrywanie (Rysunek 3) wykazano, że uproszczona metoda z użyciem Chelex daje wyniki podobne do standardowego protokołu wysalania10, mimo znacznie mniejszej liczby etapów (Tabela 1). Przy porównywalnej jakości DNA w poszczególnych ekstraktach nie jest zaskakujące, że odsetek próbek dodatnich w odniesieniu do An. gambiae gatunki siostrzane, jak również wskaźniki zakażeń pasożytniczych, nie wykazały różnic statystycznie istotnych w teście chi-kwadrat McNemara (Rycina 3).
Czułość (%) obliczono jako TP/(TP+FN)*100, gdzie TP oznacza prawdziwie dodatnie, a FN oznacza fałszywie ujemne wyniki. Swoistość (%) określono jako TN/(TN+FP)*100, gdzie TN oznacza prawdziwie ujemne, a FP oznacza fałszywie dodatnie wyniki. PCR oceniający jakość DNA (ND4) wykazał 93% czułości i 82% swoistości dla metody Chelex w porównaniu z uznanym protokołem wysalania jako złotym standardem. Odpowiednie wartości czułości i swoistości wyniosły odpowiednio 100% i 78% przy użyciu PCR do identyfikacji gatunków pokrewnych oraz odpowiednio 92% i 80% dla PCR do wykrywania P. falciparum.
Dodanie BSA do mieszanin reakcyjnych spowodowało ogólny wzrost liczby wyników dodatnich PCR (Rycina 3) dzięki niwelowaniu działania inhibitorów PCR14, zarówno w przypadku uproszczonego protokołu Chelex, jak i standardowego protokołu wysalania. Wzrost ten nie był jednak istotny statystycznie, z wyjątkiem jakości DNA (PCR ND4) w ekstraktach Chelex (p = 0,039). Trawienie enzymem restrykcyjnym specyficznym dla alleli amplikonu P. falciparum DHFR (lub innego genu docelowego) umożliwia genotypowanie infekcji malarią w jelicie środkowym i gruczołach ślinowych pod kątem alleli oporności na leki (Rycina 4; dane dla gruczołów ślinowych nie zostały przedstawione).
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Prosta procedura z użyciem żywicy Chelex</td>
 <td colspan="2">Standardowa procedura wysalania</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kroki</td>
 <td>Odczynniki</td>
 <td>Kroki</td>
 <td>Odczynniki</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 <ol>
 <li>Przenieść próbkę do probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml i homogenizować w 100 μl roztworu 1X PBS/1% saponiny (2 min).</li>
 <li>Pozostawić w temperaturze pokojowej na 20 min.</li>
 <li>Wirować z prędkością 20 000 x g przez 2 min i odrzucić nadsącz.</li>
 <li>Dodaj 100 μl do 1X PBS i wymieszać delikatnie, krótko wiertłując w wstrząsarku typu vortex (3 s).</li>
 <li>Wiruj z prędkością 20 000 x g przez 2 min, a następnie odlej nadsącz.</li>
 <li>Dodaj 25 μl 20% (m/v) Chelex w wodzie dejonizowanej i 75 μl sterylna woda dejonizowana.</li>
 <li>Przebij otwór w zakrętce probówki z próbką, używając rozgrzanej, sterylnej igły hipodermicznej 23G, a następnie gotuj zawartość probówki przez 10 min.</li>
 <li>Wirować probówkę do mikrocentryfugi przy 20 000 x g przez 1 min.</li>
 <li>Przenieść nadsącz do sterylnej, wcześniej oznakowanej fiolki i przechowywać roztwór DNA w temperaturze -20 °C do momentu użycia (2.5 μl w 25 μl reakcja PCR).</li>
 </ol>
 </td>
 <td>
 PBS 
 Saponina 
 kulki Chelex-100 </td>
 <td>
 <ol>
 <li>Umieścić próbkę w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i homogenizować w 100 μl bufor Bendera* z 1% DEPC (2 min).</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 65 °C przez 1 h.</li>
 <li>Dodaj 15 μl zimny 8 M octan potasu. Delikatnie wymieszać i inkubować na lodzie przez 45 min.</li>
 <li>Wiruj próbkę w probówkach do mikrocentryfugi z prędkością 20 000 x g przez 10 min, a następnie przenieś nadsącz do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
 <li>Dodaj 250 μl 100% etanolu i wymieszać dokładnie, odwracając probówkę.</li>
 <li>Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
 <li>Wiruj próbki z prędkością 20 000 x g przez 15 min.</li>
 <li>Odssać i odrzucić nadsącz, pozostawiając osad do całkowitego wyschnięcia w probówce (30 min).</li>
 <li>Resuspender osad w 20 μl z 0,1X SSC + RNazą (10 μg/ml) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Dodaj 80 μl wodę z DEPC i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
 </ol>
 </td>
 <td>
 Węglan dwuetylowy (DEPC) 
 Bufor Bendera: 
 0,1 M NaCl 
 0,2 M sacharozy 
 0,1 M Tris-HCl
 
 0,05 M EDTA, pH 9,1 
 0,5% SDS w wodzie oczyszczonej za pomocą DEPC
 8 M octan potasu
 Etanol
 bufor SSC (saline sodium citrate) 0,1X
 RNaza (10 μg/ml)</td>
</tr>
 <tr>
 <td colspan="2">CAŁKOWITY CZAS: 37 min</td>
 <td colspan="2">CAŁKOWITY CZAS: 2 godz 47 min, plus inkubacja przez noc</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Porównanie krok po kroku odczynników i wymagań czasowych dla prostego protokołu Chelex oraz standardowej metody wysalania w celu ekstrakcji DNA z okazów komarów.
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej przedstawiające porównanie ekstrakcji DNA; ścieżki wskazują metodę wysalania oraz metodę Chelex." src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Porównanie jakości DNA w reakcji PCR dla genu mitochondrialnego ND4 z uproszczonych ekstraktów Chelex „C” oraz standardowych ekstraktów metodą wysalania „M” z próbek terenowych Anopheles arabiensis . NC, kontrola negatywna; pary M1 i C1, M2 i C2, M3 i C3 oraz M4 i C4 to ekstrakty metodą wysalania i Chelex z tych samych osobników komarów An. arabiensis . L, drabinka DNA 100 bp.
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; ekstrakcja DNA, metoda wysalania, metoda Chelex, prążek markera 315bp." src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. PCR do identyfikacji molekularnej Anopheles arabiensis. C1 i M1, C2 i M2, C3 i M3, C4 i M4 oznaczają odpowiednie amplikony z ekstraktów DNA uzyskanych metodą wysalania „M” oraz uproszczoną metodą Chelex „C” z tych samych osobników komarów; AR, kontrola pozytywna Anopheles arabiensis ; L, drabinka DNA 100 bp.
<img alt="Wykres słupkowy wyników testu PCR; wpływ traktowania solą i Chelexem na odsetek wyników dodatnich z dodatkiem i bez dodatku BSA." src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Wykrywanie próbek dodatnich w ekstraktach DNA uzyskanych metodą Chelex oraz metodą wysalania dla próbek komarów z terenu, z wykorzystaniem testów PCR do identyfikacji molekularnej Anopheles arabiensis (AR)10, testu jakości DNA genu dehydrogenazy NADH stawonogów 4 (ND4)11 oraz genotypowania DHFR P. falciparum w kierunku oporności na leki antyfolianowe12 (F-M4). Przedstawiono wyniki testów przeprowadzonych z dodatkiem i bez dodatku BSA w mieszaninie reakcyjnej. Do określenia, czy różnice w procencie dodatnich wyników PCR z DNA wyekstrahowanego uproszczonym protokołem Chelex oraz standardowym protokołem wysalania były istotne statystycznie, zastosowano test chi-kwadrat McNemara.
<img alt="Wynik elektroforezy żelu DNA, środek jelita komara, rozdzielenie 522bp, 326bp, 196bp, metoda analizy." src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Zastosowanie uproszczonego protokołu Chelex w genotypowaniu infekcji P. falciparum u komarów (pokazano dane ze środkowego jelita) pod kątem alleli oporności na leki. Trawienie enzymem BstN I amplikonu flankującego kodon 108 genu DHFR P. falciparum 12 wykazuje mutanty S108T oporne na cykloguanil w próbkach komarów (M1-M5; pokazano dane ze środkowego jelita). U, nietrawiony amplikon 522 bp; FCR3, laboratoryjny standard dodatniej kontroli klonu P. falciparum niosącego S108T; K1, laboratoryjny standard ujemnej kontroli klonu P. falciparum niosącego wrażliwe na cykloguanil S108N; L, drabinka DNA 100 bp.

Opisano szybką i niedrogą metodę ekstrakcji wysokiej jakości DNA pasożytów malarii oraz wektorów z okazów komarów. Wykorzystując właściwości chelatujące żywicy Chelex, ta prosta metoda umożliwia genotypowanie pasożytów malarii w fazach jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów, a także identyfikację molekularną gatunków bliźniaczych Anopheles za pomocą PCR.

Prosty protokół Chelex dla ekstrakcji DNA z Anopheles spp.

Kraje endemiczne coraz częściej wdrażają narzędzia molekularne w celu wydajnego typowania, identyfikacji i nadzoru nad pasożytami malarii oraz wektorami...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyekstrahowanie DNA malarii, pasożyta oraz komara z sekcji jelita środkowego i gruczołów ślinowych preparatów. Osiąga się to poprzez najpierw precyzyjne przecięcie komara w stawie między odwłokiem a klatką piersiową, co pozwala na oddzielenie jelita środkowego od sekcji z gruczołami ślinowymi. Następnie każda z sekcji jest osobno rozcierana w wodzie dejonizowanej.Następnie zawiesinę tkankową poddaje się działaniu ługu i przemywa, a następnie odzyskuje osad komórkowy. Na koniec osad komórkowy jest rekonstytuowany i gotowany, a następnie ekstrahuje się DNA. W efekcie można uzyskać wysokiej jakości DNA komarów i pasożytów malarii, które nadaje się do użycia jako matryca do identyfikacji anomalii, gatunków wektorów oraz genotypowania zakażeń malarią za pomocą PCR i trawienia enzymami restrykcyjnymi specyficznymi dla alleli.Główną zaletą tej bardzo prostej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekstrakcja organiczna czy metody sortowania, jest wykorzystanie niewielkiej ilości bezpiecznych i łatwo dostępnych odczynników oraz znacznie krótszy czas przetwarzania. Aby rozpocząć sekcję komara, należy umieścić go na małym kawałku parafomy i ustawić pod mikroskopem sekcyjnym. Następnie należy przykryć go kroplą wody dejonizowanej.Aby zmiękczyć tkankę w preparacie, należy naciąć odwłok komara dokładnie w stawie między klatką piersiową a odwłokiem, oddzielając w ten sposób głowę i klatkę piersiową od części brzusznej. Przenieś każdą z rozczłonkowanych części komara do czystej, autoklawowanej probówki do mikrocentrifugowania o pojemności 1,5 mililitra, wcześniej oznakowanej numerem identyfikacyjnym komara i nazwą części ciała. Usuń folię Parafilm i za pomocą chusteczki Kim wipe zwilżonej 70% alkoholem ostrożnie przetrzyj stolik mikroskopu przed przystąpieniem do pracy z kolejnym komarem. Aby wyekstrahować DNA komara, najpierw pipetuj 20 mikrolitrów wody dejonizowanej do probówki z próbką.Następnie za pomocą końcówki pipety rozetrzeć zanurzony fragment komara, tworząc jednorodną zawiesinę. Do homogenatu próbki dodać 100 µL autoklawowanego roztworu XPBS z 1% saponiną i delikatnie wymieszać na wortexie. Próbkę inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Następnie wiruj przy 20 000 G przez dwie minuty i odlej nadsącz. Resuspenduj osad w 100 µL 1x PBS. Następnie powtórz wirowanie.Dodaj 75 µL sterylnej wody dejonizowanej i 25 µL 20% w/v zawiesiny żywicy Cellex 100 w wodzie dejonizowanej, a następnie delikatnie wymieszaj na wortexie w celu resuspensji osadu, używając sterylnej igły hipodermicznej o rozmiarze 23 G, wysterylizowanej w płomieniu palnika Bunsena. Przebij otwór w zakrętce probówki z próbką.Gotuj zawiesinę próbki w bloku grzejnym przez 10 minut. Odwiruj przy 20 000 G przez jedną minutę, a następnie przenieś roztwór DNA do wcześniej oznakowanej probówki do przechowywania, aby wykorzystać go jako matrycę w reakcjach PCR w celu sprawdzenia jakości wyekstrahowanego DNA oraz amplifikacji regionu mitochondrialnego genu dehydrogenazy nikotynamidoadeninowej dinukleotydowej podjednostki czwartej stawonogów, który powinien wytworzyć fragment o długości 400 par zasad. Następnie, aby odróżnić gatunki Ananais Gambia, przeprowadź amplifikację regionu flankującego SNP w regionie odstępnika międzygenicznego, co powinno przynieść fragmenty o długości 390 par zasad dla Ananais Gambia Sens Stricto oraz 315 par zasad dla ananais api.Następnie przeprowadzono genotypowanie polimorfizmów oporności *P. falciparum* na leki antyfolianowe. Wykonano zagnieżdżoną reakcję PCR w celu amplifikacji regionu flankującego kodony aminokwasowe 16, 51, 59, 108 i 164 w genie reduktazy dihydrofolianowej pasożyta. Następnie przeprowadzono trawienie allelospecyficzne amplikonu w celu wykrycia oporności na leki antyfolianowe.Powiązane polimorfizmy. Reakcje sprawdzono w elektroforezie na żelu 2%AROS. Przykłady wyników testów PCR dla oceny jakości ekstraktu DNA komarów, molekularnej identyfikacji RABIS oraz genotypowania p falciparum wykazują, że uproszczona metoda Kelex daje wyniki podobne do standardowego protokołu wysalania, mimo mniejszej liczby etapów i wykorzystania mniej niż jednej czwartej czasu, przy porównywalnej jakości DNA w odpowiednich ekstraktach. Nie jest więc zaskakujące, że wskaźniki pozytywności próbek w odniesieniu do anomalii, gatunków pokrewnych z Gambii, a także wskaźniki zakażeń pasożytami nie różniły się statystycznie zgodnie z testem chi-kwadrat McNeara.Dodanie BSA do mieszanin reakcyjnych skutkuje ogólnym wzrostem liczby wyników PCR dodatnich dzięki usunięciu inhibitorów PCR zarówno w uproszczonym protokole kelex, jak i w standardowym protokole wysalania. Wzrost ten nie był jednak istotny statystycznie, z wyjątkiem jakości DNA w ekstraktach z kelex. Po opanowaniu metody, trawienie amplikonu p falciparum specyficznymi dla alleli enzymami restrykcyjnymi umożliwia genotypowanie zakażeń malarią w jelicie środkowym i gruczołach ślinowych pod kątem alleli oporności na leki.Przy prawidłowym wykonaniu technika ta powinna zająć około 37 minut.

a-simple-chelex-protocol-for-dna-extraction-from-anopheles-spp

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prosty protokół Chelex do ekstrakcji DNA z Anopheles spp.

W ostatnim czasie technologia sekwencjonowania wysokoprzepustowego znacznie zwiększyła czułość eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), co przyczyniło się do ich zastosowania z użyciem oczyszczonych komórek lub wyselekcjonowanych tkanek. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę wykorzystania techniki ChIP w tkankach Drosophila, która pozwala na badanie endogennego stanu chromatyny w dobrze scharakteryzowanym systemie biologicznym.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) z wykorzystaniem tkanek Drosophila

Wśród trzech rodzajów komarów, mianowicie Anopheles, Aedes oraz Culex, techniki fizycznego mapowania genomu opracowano jedynie dla Anopheles, którego przedstawiciele posiadają czytelne chromosomy politeniczne. W przypadku rodzajów Aedes i Culex mapowanie cytogenetyczne pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na niską jakość chromosomów politenicznych. Przedstawiamy tutaj uniwersalny protokół otrzymywania wysokiej jakości preparatów chromosomów mitotycznych oraz zoptymalizowany protokół FISH dla...

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ na chromosomach mitotycznych komarów

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Opisany tutaj jest protokół ekstrakcji DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych do produkcji wysokiej jakości ekstrakcji DNA od komarów. Ekstrakcje te są odpowiednie dla dalszego podejścia do sekwencjonowania nowej generacji.

Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Ten protokół opisuje test immunoenzymatyczny do wykrywania sporozoitów gruczołów ślinowych u komarów. Wykorzystując łatwo dostępne przeciwciała monoklonalne, metoda umożliwia ekonomiczne, wysokoprzepustowe wykrywanie komarów przenoszących Plasmodium falciparum lub Plasmodium vivax. Metoda ta nadaje się do badań nad przenoszeniem malarii, w tym do badań wektorowych.

Wykrywanie sporozoitów Plasmodium u komarów Anopheles za pomocą testu immunoenzymatycznego

Poznaj uproszczoną metodę ekstrakcji DNA z komarów Anopheles i pasożytów malarii przy użyciu żywicy Chelex. Technika ta umożliwia szybką identyfikację gatunkową wektorów oraz genotypowanie zakażeń w zaledwie 37 minut.

Prosty protokół Chelex dla ekstrakcji DNA z Anopheles spp.

Przeglądaj więcej filmów