Prosty protokół Chelex do ekstrakcji DNA z Anopheles spp.
9 stycznia 2013
Opisany jest szybki i niedrogi sposób na ekstrakcję wysokiej jakości DNA pasożyta malarii i wektora z próbek komarów. Wykorzystując właściwości chelatujące żywicy Chelev, ta prosta metoda umożliwia genotypowanie pasożytów malarii w fazie środkowego jelita komara, a także identyfikację molekularną gatunków rodzeństwa Anopheles za pomocą PCR.
Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja DNA malarii, pasożytów i komarów z odcinków jelita środkowego i gruczołów ślinowych anomalii, próbek. Osiąga się to poprzez najpierw przecięcie komara dokładnie w stawie między brzuchem a klatką piersiową, oddzielając w ten sposób odcinek jelita środkowego od odcinka gruczołu ślinowego. Następnie każda sekcja jest mielona osobno w wodzie dejonizowanej.
Następnie zawiesina tkankowa jest układana i płukana, a osad komórkowy jest odzyskiwany. Na koniec osad komórkowy jest odtwarzany i gotowany, a DNA jest ekstrahowane. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wysokiej jakości DNA, pasożyta komarów i malarii, nadające się do wykorzystania jako matryca do identyfikacji anomalii, gatunków wektorów i genotypów zakażeń malarią poprzez PCR i trawienie enzymów restrykcyjnych specyficznych dla alleli
.Tak więc główną zaletą tej bardzo prostej techniki w porównaniu z istniejącymi, takimi jak ekstrakcja organiczna i metody sortowania, jest to, że wykorzystuje ona bardzo mało bezpiecznych i łatwo dostępnych odczynników, a także znacznie krótszy czas przetwarzania. Aby rozpocząć sekcję komara, umieść go na małym kawałku paraformy i zamontuj na mikroskopie preparacyjnym. Przykryj go kroplą wody dejonizowanej.
Aby zmiękczyć wielkość tkanki, tusza komara dokładnie w stawie między klatką piersiową a brzuchem. W ten sposób odcięcie głowy i klatki piersiowej od części brzusznej. Przenieś każdą wypreparowaną sekcję komara do czystego autoklawu, 1,5-mililitrowej mikrorurki wirówkowej wstępnie oznaczonej numerem identyfikacyjnym komara i sekcją ciała, wyrzuć film para i za pomocą 70% zwilżonej alkoholem chusteczki Kim ostrożnie wytrzyj stolik mikroskopu przed przetworzeniem do następnego komara, aby wyodrębnić DNA komara najpierw pipetę 20 mikrolitrów wody dejonizowanej do probówki z próbką.
I użyj końcówki pipety, aby zmielić zanurzoną sekcję komara na jednolitą zawiesinę. Dodać 100 mikrolitrów autoklawu, jeden roztwór 1% saponiny XPBS do homogenatu próbki i delikatnie zwirować, aby wymieszać. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
Następnie odwirować przy 20 000 G przez dwie minuty i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić granulat w 100 mikrolitrach jednego XPBS. Następnie powtórz wirowanie.
Dodaj 75 mikrolitrów sterylnej wody dejonizowanej i 25 mikrolitrów o masie 20% na objętość. Zawiesina żywicy Cellex 100 w wodzie dejonizowanej i delikatnie wirować w celu ponownego zawieszenia granulatu za pomocą sterylnej igły podskórnej o rozmiarze 23 płomieniowanej w palniku Bunsena. Przebić otwór w pokrywie probówki z próbką.
Gotować zawiesinę próbki w bloku grzewczym przez 10 minut. Wirować przy 20 000 G przez jedną minutę i przenieść roztwór DNA do wstępnie znakowanej fiolki do przechowywania w celu wykorzystania jako matryca w reakcjach PCR w celu sprawdzenia jakości wyekstrahowanego DNA, amplifikować region stawonogów w mitochondrialnej genie podjednostki czwartej dehydrogenazy dinukleotydowej nikotynamidu, który ma wytworzyć fragment 400 par zasad. Następnie, aby rozróżnić gatunki Ananais Gambia, należy wzmocnić region flankujący SNP w międzygenowym regionie dystansowym, który ma wytworzyć rozmiary 390 par zasad dla Ananais Gambia Sens Stricto i 315 par zasad dla Ananais API.
Ansis następnie do polimorfizmów genotypu p falciparum anty folianów lekooporności. Wykonaj zagnieżdżony PCR, aby amplifikować region flankujący kodony aminokwasowe 16, 51, 59, 108 i 164. U pasożytów gen reduktazy dihydrofolianowej przeprowadza trawienie amplikonu specyficzne dla alleli w celu wykrycia oporności na leki przeciw folianom.
Powiązane polimorfizmy. Sprawdź reakcje na egzaminie 2%AROS gel. Przykłady wyników testów PCR dla jakości ekstraktu DNA komara analis identyfikacji molekularnej RABIS i genotypowania p falciparum pokazują, że uproszczona metoda Kelex daje podobne wyniki do standardowego protokołu wysalania pomimo mniejszej liczby etapów i mniej niż jednej czwartej czasu przy porównywalnej jakości DNA w odpowiednich ekstraktach, nie jest zaskakujące, że wskaźniki dodatniości próbki w odniesieniu do anomalii, Gatunki rodzeństwa Gambia, jak również wskaźniki infekcji pasożytami nie różniły się statystycznie na podstawie testu chi kwadrat McNeara.
Dodanie BSA do mieszanin reakcyjnych powoduje ogólny wzrost dodatnich wyników PCR ze względu na usunięcie inhibitorów PCR zarówno dla uproszczonego keleksu, jak i zwykłego protokołu wysalania. Jednak wzrost ten nie był statystycznie istotny, z wyjątkiem jakości DNA na ekstraktach z keleksu. Trawienie enzymu restrykcyjnego specyficznego dla alleli amplikonu p falciparum umożliwia genotypowanie infekcji malarii w jelicie środkowym i gruczołach ślinowych pod kątem alleli oporności na leki Po opanowaniu.
Ta technika powinna być możliwa do wykonania w około 37 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Przegląd
Ten artykuł opisuje szybki i przystępny cenowo sposób ekstrakcji wysokiej jakości DNA z pasożytów malarii i komarów wektorów. Wykorzystując żywicę Chelex, technika ta pozwala na efektywne genotypowanie pasożytów malarii i identyfikację molekularną gatunków Anopheles.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Genomika
Tło
- Malaria jest istotnym globalnym problemem zdrowia publicznego, przenoszona przez komary Anopheles.
- Tradycyjne metody ekstrakcji DNA mogą być czasochłonne i wymagają niebezpiecznych odczynników.
- Istnieje potrzeba prostszych, bezpieczniejszych i bardziej efektywnych technik ekstrakcji DNA.
- To badanie wprowadza metodę, która spełnia te potrzeby z wykorzystaniem żywicy Chelex.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej i przystępnej cenowo metody ekstrakcji DNA z pasożytów malarii i komarów wektorów.
- Możliwość genotypowania pasożytów malarii i identyfikacji gatunków Anopheles.
- Porównanie wydajności i skuteczności nowej metody z tradycyjnymi protokołami.
Zastosowane metody
- Sekcjonowanie okazów komarów w celu oddzielenia sekcji jelita środkowego i gruczołów ślinowych.
- Mielenie tkanki w wodzie dejonizowanej w celu uzyskania zawiesiny.
- Zastosowanie żywicy Chelex do ekstrakcji DNA.
- Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) do genotypowania i identyfikacji gatunków.
Główne wyniki
- Metoda Chelex daje wysokiej jakości DNA nadające się do PCR.
- Wyniki są porównywalne z metodami tradycyjnymi, przy znacznie skróconym czasie przetwarzania.
- Wskaźniki dodatnich próbek dla identyfikacji gatunków i infekcji pasożytami były statystycznie podobne między metodami.
- Dodanie BSA poprawiło wyniki PCR poprzez zmniejszenie inhibitorów.
Wnioski
- Sprzedzona metoda Chelex jest skuteczna w ekstrakcji DNA z wektorów malarii.
- Technika ta może być wykonana w mniej niż 40 minut, co czyni ją praktyczną do rutynowego użytku.
- Oferuje ona bezpieczniejszą i bardziej efektywną alternatywę dla tradycyjnych metod ekstrakcji DNA.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
In resource-limited settings, sustainable molecular surveillance of malaria vectors and parasites requires DNA extraction methods that balance performance with operational simplicity. The Chelex-based protocol delivers comparable DNA quality to established salting-out methods while reducing reagent complexity and processing time from nearly three hours to under 40 minutes. This positions the method as a practical tool for enabling scalable, cost-effective genotyping and species identification workflows in endemic region research and control programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vector-parasite interactions by providing DNA templates for species confirmation and infection status assessment.
- Operational Value: Reduces hands-on time and reagent burden, supporting higher throughput in field-collected sample processing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces DNA suitable for PCR-based assays targeting vector species discrimination and parasite genotyping.
- Operational Value: Uses only three reagents (deionized water, saponin, Chelex resin), enhancing assay standardization and reducing variability in resource-constrained labs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from vector collection to downstream applications like drug resistance genotyping via nested PCR and restriction digestion.
- Operational Value: Eliminates need for hazardous organic solvents, improving safety and accessibility in field laboratories.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from specimen processing to genetic analysis, enabling reliable input for PCR-based identification and genotyping assays.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on vector species distribution and Plasmodium falciparum infection rates in field settings.
- Screening: Delivers DNA extracts with sufficient quality and yield for multiplex PCR applications, supporting assay readiness.
- Analytics: Enables quantitative assessment via PCR amplification of ND4, species-specific SNPs, and drug resistance loci, allowing comparison across sample groups.
- Translational Research: Connects entomological surveillance to parasite genotyping, supporting risk-adjusted decisions in malaria control strategies.
- Enterprise Reuse: Protocol simplicity and minimal equipment needs (microcentrifuge, heating block) allow adoption across multiple field sites and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in vector species identification and parasite detection through comparable sensitivity and specificity to benchmark methods.
- Operational Value: Achieves high reproducibility with minimal reagent dependency, reducing supply chain vulnerability in remote settings.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in surveillance programs by shortening time-to-result for molecular confirmation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of interventions by delivering timely, accurate data on vector competence and parasite prevalence.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology training for tissue dissection, homogenization, and PCR setup.
- Needs access to a microcentrifuge capable of 20,000 × g and a heating block for boiling step.
- Standardization across teams benefits from consistent vortexing and pipetting techniques during homogenization and resin resuspension.
- Adaptation to other mosquito species or sample types may require validation of lysis efficiency and inhibitor removal.
- Practical limitation: The method includes a manual grinding step that may limit ultra-high-throughput automation without modification.
