Name: Hodowla i elektrofizjologia komórek na chipach krosowych NRCC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę hodowli i elektrofizjologii neuronów na chipach krosowych NRCC. Technika planar patch-clamp umożliwia rejestrację aktywności jonowych kanałów w sieciach neuronalnych z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Alexei Bogdanovowi za wykonanie chipów do techniki patch-clamp w CPFC oraz Hue Tran, Ping Zhao i Matthew Shiu za pomoc przy montażu. Naweed Syed otrzymał wsparcie z grantu Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR). Collin Luk jest stypendystą NSERC oraz Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR).

1. Wytwarzanie chipa
Proces opisany w 6 pozwala na otrzymanie samodzielnej błony o grubości 3 μm, niskiej rezystancji dostępowej wynoszącej 1 Mohm oraz gładkiej otwory o kształcie lejka, co ułatwia szczelne połączenie z komórką 9, patrz Rysunek 2. Chipy są rozdzielane i przyklejane w obudowach z pleksiglasu, tak aby otwór był skierowany w stronę otworu łączącego chip z kanałem podziemnym. Klejenie jest wykonywane w sposób minimalizujący pojemność boczniczą do wartości nominalnej 17 pF. Obudowy są wyposażone w dwie szklane rurki o średnicy 1,5 mm i długości 6 mm, służące jako porty płynowe (Rysunek 3).
<img alt="Przekrój wykonany za pomocą skupionej wiązki jonów, obraz mikroskopowy, analiza strukturalna materiału w mikroskali." src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Mikrografia z rastrowego mikroskopu elektronowego przekroju chipa do techniki patch-clamp NRCC, wykonanego za pomocą skupionej wiązki jonów, pokazuje gładką powierzchnię dwutlenku krzemu oraz kształt lejka sprzyjający ścisłemu kontaktowi z komórką, a także płytki otwór, który warunkuje niską rezystancję dostępu.
<img alt="Przekrój wykonany za pomocą skupionej wiązki jonów, obraz mikroskopowy, analiza strukturalna materiału w mikroskali." src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 3. Chip zostaje przyklejony do dna fiolki hodowlanej w obudowie z pleksiglasu, wyposażonej w podziemny system mikroprzepływowy i szklane rurki.
2. Sterylizacja, przygotowanie i testowanie
Kolejne kroki należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby uniknąć kontaminacji lub zapchania otworu.
<ul type="disc">
	<li>Sterylizować chipy w podstawowym czyszczarce plazmowej Harrick (www.harrickplasma.com) przy resztkowym ciśnieniu powietrza 0,1-0,3 mbar przez 15 min przy maksymalnej mocy 18 W. Można stosować inne systemy plazmy powietrznej o porównywalnej gęstości mocy (24 mW/cm3), zachowując stały iloczyn gęstości mocy i czasu. Obróbka plazmą czyni również chipy hydrofilowymi, co ułatwia przygotowanie powierzchni (priming).</li>
	<li>Wyposażyć rurki szklane w sterylne silikonowe rurki laboratoryjne Silastic, 1mm I.D. x 2mm O.D. (Cole Parmer Kat. nr 9615-08), 3 cali po jednej stronie i 1 cal po drugiej stronie.</li>
	<li>Wypełnić układ mikroprzepływowy poprzez rurki sterylnym filtrowanym standardowym roztworem buforu fosforanowego (PBS), upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Zaciisnąć długą rurkę silikonową, zwiększając ciśnienie PBS od strony krótkiej do 1 atm. W fiolce może być widoczna kałuża PBS przesączająca się przez otwór. Zaciisnąć dopływ PBS pod ciśnieniem i odłączyć krótką rurkę silikonową od tego źródła.</li>
	<li>Wypełnić fiolkę filtrowanym PBS za pomocą strzykawki.</li>
	<li>Zanurzyć elektrodę Ag/Ag:Cl w krótkiej rurce oraz przeciwelektrodę w fiolce. Użyć miernika impedancji, aby potwierdzić, że oporność dostępu wynosi od 300kohm do 3Mohm, a pojemność bocznicza od 10pF do 25pF. Chip o niższej oporności prawdopodobnie posiada nieszczelność, natomiast wyższa pojemność jest uznawana za niewłaściwą do użytku, ponieważ może nie zarejestrować najszybszej dynamiki elektrofizjologii komórki 6. Chip o niższej pojemności lub wyższej oporności uznaje się za zatkany, choć może to być po prostu efekt uwięzionego w otworze pęcherzyka powietrza. Niektóre chipy są ponownie testowane po 1H i wykazują prawidłową impedancję elektrochemiczną.</li>
	<li>Przepłukać kanał mikroprzepływowy sterylną wodą dejonizowaną; opróżnić górną fiolkę i dwukrotnie przepłukać ją tą samą wodą.</li>
	<li>Zanurzyć zapakowany chip z rurkami w świeżej sterylnej wodzie dejonizowanej na 30min, a następnie umieścić go wraz z innymi chipami w sterylnym pojemniku wypełnionym sterylną wodą dejonizowaną. Zapewnia to zachowanie właściwości hydrofilowych chipów oraz ochronę przed zanieczyszczeniem.</li>
</ul>
3. Przygotowanie chipów w laboratorium biologii komórki
Następujące kroki są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza z filtrem HEPA z zachowaniem technik aseptycznych; wszystkie roztwory wykorzystywane w tej procedurze muszą zostać poddane sterylizacji przez filtrowanie przy użyciu filtra 0,2μm przed użyciem.
<ul type="disc">
	<li>Otwórz pojemnik z chipami pod laminarnym przepływem powietrza z filtrem HEPA i wyjmij chipy z pojemnika stroną skierowaną w dół, aby uniknąć wpadnięcia ewentualnych pływających zanieczyszczeń do górnej fiolki.</li>
	<li>Przepłucz górną część fiolki chipu 2x świeżo przefiltrowaną sterylną wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości zanieczyszczeń z powierzchni chipu.</li>
	<li>Odsuń sterylną wodę dejonizowaną z górnej fiolki za pomocą aspiratora.</li>
	<li>Podłącz jeden koniec rurki silastykowej przymocowanej do kanału płynowego do strzykawki ciśnieniowej zawierającej sterylną przefiltrowaną wodę dejonizowaną. W naszym systemie strzykawki wypełnione roztworem są poddawane ciśnieniu poprzez podłączenie do zbiornika ze sprężonym powietrzem ustawionego na 20psi. Aby zapewnić sterylność, powietrze jest filtrowane (filtr 0.2 μm) przed wprowadzeniem do strzykawki; nasz system posiada również zawór włącz/wyłącz, który pozwala na zatrzymanie lub przyłożenie ciśnienia w razie potrzeby.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków hemostatycznych zaciśnij wylotowy koniec rurki.</li>
	<li>Otwórz zawory włącz/wyłącz, aby podać ciśnienie do roztworu.</li>
	<li>Aby przepłukać podziemny układ płynowy chipu świeżą sterylną wodą dejonizowaną, zwolnij wylotowy koniec rurki.</li>
	<li>Aby wymusić przepływ wody w górę przez aperturę, zaciśnij wylotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi.</li>
	<li>Aby zapobiec odpływowi wody, zaciśnij wlotowy i wylotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi i zamknij zawory włącz/wyłącz.</li>
	<li>Odłącz wlotowy koniec rurki od strzykawki.</li>
	<li>Włóż szklane zatyczki do obu końców rurki i usuń kleszczyki hemostatyczne.</li>
	<li>Napełnij górną fiolkę filtrowaną sterylną wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Umieść pokrywkę sterylnej szalki 35 mm w podstawie sterylnej szalki 10 mm.</li>
	<li>Umieść chip na pokrywce szalki 35 mm i przykryj go pokrywką szalki 10 mm.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie chipów, aby upewnić się, że membrana i apertura chipów są wolne od zanieczyszczeń i/lub pęcherzyków powietrza. W naszym laboratorium używamy mikroskopu pionowego i obiektywu 20x o długiej odległości roboczej.</li>
	<li>Jeśli obecne są zanieczyszczenia i/lub pęcherzyki powietrza, wielokrotnie przepłucz kanał płynowy i górną fiolkę. Jeśli zanieczyszczeń i/lub pęcherzyków powietrza nie można usunąć, chip zostaje odrzucony.</li>
	<li>Po wykonaniu obrazowania chipów wróć do komory z laminarnym przepływem powietrza i wyjmij zatyczki z obu końców rurki.</li>
	<li>Podłącz jeden koniec rurki do strzykawki ciśnieniowej zawierającej medium fizjologiczne.</li>
	<li>Zaciśnij wylotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi.</li>
	<li>Otwórz zawór ciśnienia, usuń kleszczyki hemostatyczne z końca układu płynowego i przepłucz kanał płynowy medium fizjologicznym.</li>
	<li>Aby przepłukać podziemny układ płynowy medium fizjologicznym, otwórz zawory włącz/wyłącz i usuń kleszczyki hemostatyczne z wylotowego końca rurki.</li>
	<li>Aby wymusić przepływ medium fizjologicznego w górę przez aperturę, zaciśnij wylotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi.</li>
	<li>Zaciśnij wlotowy koniec rurki kleszczykami hemostatycznymi i zamknij zawory włącz/wyłącz.</li>
	<li>Usuń wlotowy koniec rurki ze strzykawki i zatkaj oba końce rurki szklanymi zatyczkami.</li>
	<li>Usuń kleszczyki hemostatyczne.</li>
	<li>Usuń wodę z górnej fiolki.</li>
	<li>Napełnij górną fiolkę filtrowanym sterylnym medium fizjologicznym.</li>
	<li>Umieść chip z powrotem w szalce Petriego 10 mm.</li>
	<li>Wstaw podstawę szalki 35 mm do szalki 10 mm i napełnij ją filtrowaną sterylną wodą dejonizowaną, aby zwiększyć wilgotność.</li>
	<li>Przykryj szalkę aż do momentu wysiewania.</li>
</ul>
4. Wysiew neuronów ślimaka
Chipach do techniki patch-clamp mogą być odpowiednie dla różnych rodzajów preparatów. Obecnie testujemy nasze chipy z użyciem pierwotnych neuronów kory ssaków i uzyskaliśmy wstępne wyniki dla komórek hodowanych przez 14 dni 7, co wskazuje, że nasz protokół sterylizacji jest odpowiedni, a chipy nie wykazują cytotoksyczności w hodowlach długoterminowych. Na potrzeby niniejszego protokołu wybrano neurony ślimaka, ponieważ stanowią one prosty, ale dobrze udokumentowany model do badania elektrofizjologii neuronów 1, i to właśnie na tych komórkach uzyskaliśmy do tej pory najbardziej znaczące wyniki 10. Szczegółowe procedury izolacji i hodowli komórek zostały opisane wcześniej 12, 13.
<ul type="disc">
	<li>
	 Usuń zewnętrzną powłokę z osobników w wieku 2-3 miesięcy Lymnaea stagnalis za pomocą pęsety tępej i znieczulić zwierzęta w Lymnaea roztwór soli fizjologicznej zawierający 10% Listerine. Wszystkie kolejne etapy przeprowadzono aseptycznie w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu wysterylizowanego sprzętu do sekcji oraz roztworów w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wymień media fizjologiczne w układzie płynnym na odpowiedni roztwór rejestracyjnyużywając pipetkę Eppendorf. W przypadku Lymnaea neurony; roztwór zawiera (w mM): 50 KCl, 5 MgCl22, 5 kwasu etylenobis(oksyetylenenitrylo)tetraoctowego (EGTA) oraz 5 kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES; pH 7,4; 130 mOsm)14</li>
	<li>Przymocuj ślimaki szpilkami do naczynia Sylgard wypełnionego Lymnaea płucząc solą fizjologiczną i usuwając cały mózg zgodnie z wcześniejszym opisem 13</li>
	<li>Wyizolowane mózgi w określonym medium (DM) inkubowano z enzymem trypsyną (roztwór 0,2%, Sigma, nr katalogowy T-9201) przez 18 minut, a następnie poddano działaniu DM i inhibitora trypsyny (Sigma, sojowy, nr katalogowy T-903) przez 15 minut.</li>
	<li>Przymocuj mózgi w małym naczyniu z Sylgardu wypełnionym zdefiniowaną pożywką o wysokiej osmoliarności (HODM – pożywka DM z dodatkiem glukozy; 750 μL roztworu glukozy 1M do 20 ml medium DM).</li>
	<li>Używając precyzyjnej pęsety i nożyczek do sekcji, należy usunąć osłonkę zewnętrzną i wewnętrzną badanych zwojów, aby odsłonić neurony.</li>
	<li>Używając wypalanej szklanej pipety wypełnionej medium HODM i podłączonej do mikroszystrzyki, należy zastosować delikatne ssanie w pobliżu wybranej komórki (lewa grzbietowa 1 kończyny krocznej), aż neuron oddzieli się od mózgu i zostanie zawieszony w pipecie.</li>
	<li>Następnie szklaną pipetę przenosi się i zanurza w poszczególnych neurochipach, gdzie delikatne wypchnięcie zawartości z mikrosyringi pozwala na łagodne przesunięcie neuronów z pipety i umieszczenie ich nad poszczególnymi otworami typu patch w chipach.</li>
	<li>Pozostawić komórki w spokoju przez co najmniej 2 h w temperaturze pokojowej, aby wspomóc ich przywieranie do powierzchni chipa wokół otworu.</li>
</ul>
5. Rejestracje elektrofizjologiczne
Aby podłączyć chipy do wzmacniacza (w naszym przypadku był to wzmacniacz Multiclamp 70B, Molecular Devices, Foster City, CA, USA)
<ul type="disc">
	<li>Wymień roztwór w podziemnym kanale płynowym oraz w fiolce chipa na odpowiednie roztwory pomiarowe. W przypadku neuronów Lymnaea górne komory hodowlane wypełnia się solą fizjologiczną dla Lymnaea (w mM: 51.3 NaCl, 1.7 KCl, 4 CaCl2 i 1.5 MgCl2) z buforem HEPES do pH 7.9.14</li>
	<li>W celu zapewnienia stabilności przyklej chip do szkiełka przedmiotowego i umieść go pod mikroskopem.</li>
	<li>Aby podłączyć chip do wzmacniacza (w naszym przypadku wzmacniacz Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), przetnij jeden koniec rurki i włóż srebrny drut połączony z przedwzmacniaczem (head-stage).</li>
	<li>Umieść elektrodę odniesienia w górnej fiolce chipa.</li>
	<li>Chip jest teraz gotowy do rejestracji.</li>
	<li>Przy użyciu wzmacniacza zastosuj skok napięcia 5 mV, aby zmierzyć całkowitą rezystancję (Rt) i określić konfigurację neuronów: cell-attached (Rt &gt; 1 GΩ); whole-cell (Rt = 50-100 MΩ wraz z przejściami pojemnościowymi, co wskazuje na przerwanie błony w obrębie apertury); lub brak uszczelnienia (Rt &lt; 5 MΩ). W naszej ostatniej serii doświadczeń 10 58% komórek posiadało uszczelnienia o wysokiej rezystancji, a z nich 80% wykazało odpowiedzi pobudliwe.</li>
</ul>
6. Reprezentatywne wyniki
<ul type="disc">
	<li>Przyłożone do neuronu (w tym przypadku LPeD1) depolaryzujące impulsy prądowe (w przyrostach 20 pA).</li>
	<li>Utrzymanie neuronu przy Vm bliskim jego potencjałowi spoczynkowemu (~ - 60 mV).</li>
	<li>Obserwacja odpowiedzi na te impulsy depolaryzacyjne. W przypadku żywotnego neuronu powinny być obserwowane potencjały czynnościowe z overshootem.</li>
	<li>Rycina 4 przedstawia reprezentatywny wynik, który został szczegółowo omówiony w 14, 15.</li>
</ul>
<img alt="Wyniki eksperymentu metodą clampingu napięcia, wykres potencjału błonowego w funkcji czasu, dane elektrofizjologiczne." src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Odpowiedzi napięciowe (góra) neuronu LPeD1 na stopniowaną serię impulsów prądu wewnątrzkomórkowego (dół). Impulsy prądu aplikowano przy Vm = -60 mV.
Rozwiązywanie problemów
<ul type="disc">
	<li>Przed wysiewaniem należy wykonać obrazowanie chipów, aby sprawdzić, czy membrana i otwór są wolne od zanieczyszczeń i nadają się do wysiewania. Używamy mikroskopu pionowego i obiektywu 20x z dużą odległością roboczą. W naszej ostatniej serii eksperymentów 1 w ten sposób pomyślnie przygotowano 67% chipów.</li>
	<li>W przypadku obecności zanieczyszczeń i/lub pęcherzyków powietrza należy odrzucić chip i spróbować innego.</li>
	<li>Można wypróbować różne obróbki powierzchniowe (plazma) lub powłoki (PDL, PEI itp.), jednak sukces może być w dużej mierze zależny od użytego typu komórek.</li>
	<li>Skład roztworu płynnego („pipetowego”) ma kluczowe znaczenie dla utworzenia giga-uszczelnienia i konfiguracji whole-cell. Należy dostosować roztwór, zwracając uwagę na osmolarność, pH i skład jonowy.</li>
	<li>W przypadku hodowli długoterminowej należy rozpocząć od pożywki w kanale mikroprzepływowym, a następnie przed rejestracją zmienić ją na roztwór pipetowy poprzez łagodną perfuzję grawitacyjną (~0,5 ml/min).</li>
</ul>

<ol><li>Walz, W. Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalz%2C+W+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, Springer Protocols. 38(2007).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Behrends, J. C., Fertig, N. Ch. 14: Planar Patch-clamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehrends%2C+JC+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, (2007).</li>
<li>Fertig, N., Tilke, A., Blick, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+of+isolated+cell+membrane+patches+in+a+nanomachined+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Stable integration of isolated cell membrane patches in a nanomachined aperture.</a> Applied Physics Letters. 77, 1218-1220 (2000).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+hysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and hysiology.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (4), 358-368 (2008).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+silicon+patch-clamp+chip+permits+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+functionally+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), 593-600 (2010).</li>
<li>Martinez, D., Martina, M., Kremer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+patch-clamp+chips+for+mammalian+cell+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Development of patch-clamp chips for mammalian cell applications.</a> Micro and Nanosystems. 2 (4), (2010).</li>
<li>National Research Centre of Canada . , Candian Photonics Fabrication Centre. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html">http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html</a> (c1995-2001).</li>
<li>Py, C., Salim, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+aperture+interaction+in+patch-clamp+chips+visualized+by+fluorescence+microscopy+and+focused-ion+beam+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.</a> Biotechnology & Bioengineering. 108, 1395-1403 (2011).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Bell, H. J., Syed, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+modulation+of+the+respiratory+CPG%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced modulation of the respiratory CPG.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 14, 3825-3835 (2009).</li>
<li>Syed, N. I., Bulloch, A. G. M., Lukowiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstruction+of+the+respiratory+central+pattern+generator+of+the+mollusk+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea.</a> Science. 250, 282-285 (1990).</li>
<li>Syed, N. I., Zaidi, H., Lovell, P. In vitro reconstruction of neuronal circuits: A simple model system approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSyed%2C+NI+%22Modern+techniques+in+neuroscience+research%22">Modern techniques in neuroscience research</a>. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. (1999).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+patch-clamp+chip+suitable+for+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Silicon patch-clamp chip suitable for high-fidelity recording of ion channel activity from cultured neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), (2010).</li>
<li>Ong, W. -L., Yobas, L., Ong, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missing+factor+in+chip-based+patch+clamp+assay%3A+gigaseal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">A missing factor in chip-based patch clamp assay: gigaseal.</a> Journal of Physics: Conference Series. 34, 187(2006).</li>
<li>Charrier, A., Martinez, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+placement+and+guidance+on+substrates+for+neurochip+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 368-373 (2010).</li>
<li>Diaz-Quijada, D., Maynard, C. C. omas, Monette, T., Py, R., A, C. K. rantis, Mealing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Patterning+with+Chemisorbed+Chemical+Cues+for+Advancing+Neurochip+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Surface Patterning with Chemisorbed Chemical Cues for Advancing Neurochip Applications.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 50 (17), 10029-10035 (2011).</li>
<li>Martinez, D., Py, C., Denhoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+patch-clamp+recordings+from+neurons+cultured+on+a+polymer+microchip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.</a> Biomedical Microdevices. 12, 977-97 (2010).</li>
<li>Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaketani%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology%3A+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology: Using Multi-Electrode Arrays</a>. , Springer. (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Platforma badawcza chipów do techniki patch-clamp opracowana przez NRCC stanowi potencjalnie potężne narzędzie do wysokoinformacyjnych analiz farmakologicznych oraz badania modeli chorób in vitro. Jej zaletą w porównaniu do szklanych pipet jest niski opór dostępu, co ułatwia badanie dużych komórek, a mimo nieco większej pojemności, zapewnia porównywalną dynamikę w przypadku mniejszych komórek. Rutynowo uzyskiwano spontaniczne uszczelnienia między komórką a otworem, a wejście w konfigurację whole-cell miało charakter spontaniczny 14. Wyraźną różnicą między chipami a metodą z użyciem szklanej pipety jest fakt, że sonda stanowi część naczynia do hodowli komórkowej i nie jest wprowadzana w kontakt z błoną komórkową ręcznie. Hodowanie komórek, potencjalnie będących częścią sieci funkcjonalnych, pozwala na uzyskanie bardziej biologicznie istotnych modeli chorób oraz zapewnia inny mechanizm uzyskiwania wysokich uszczelnień między komórką a sondą 16. Jednak w przeciwieństwie do zawiesin komórkowych, do pozycjonowania komórki na sondzie nie można zastosować aspiracji. Neurony ślimaka, podobnie jak inne duże komórki, można pozycjonować ręcznie nad sondą. W przypadku mniejszych komórek wymagających dłuższego czasu hodowli wyeliminowaliśmy konieczność jakiejkolwiek manipulacji i utrzymaliśmy wysokie prawdopodobieństwo uzyskania uszczelnienia poprzez naniesienie wzorów z polipeptydów adhezyjnych na wierzchołki sond w celu rozmieszczenia na nich komórek, co zostało udowodnione w badaniach 17,18.
NRCC opracowuje również polimidowy mikrofluidyczny chip do techniki patch-clamp 19 o pojemności porównywalnej z pojemnością szklanej pipety. Ostatecznym celem tego projektu jest stworzenie wielosondowego chipa patch-clamp, który umożliwi jednoczesne monitorowanie aktywności elektrofizjologicznej kilku neuronów zaangażowanych w zachowania sieciowe z rozdzielczością pojedynczych kanałów jonowych 14. Metoda ta stanowi wysokorozdzielczą metodę komplementarną do macierzy wieloelektrodowych 20.

hodowla i elektrofizjologia komórek na chipach do patch-clampingu nrcc

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Ze względu na wyjątkową czułość oraz możliwość monitorowania i kontrolowania pojedynczych komórek na poziomie kanałów jonowych, technika patch-clamp jest złotym standardem elektrofizjologii stosowanym zarówno w modelach chorób, jak i w badaniach farmakologicznych 1. Tradycyjnie metoda ta polega na delikatnym zetknięciu komórki z szklaną pipetą wypełnioną roztworem fizjologicznym w celu wyizolowania fragmentu błony pod jej wierzchołkiem 2. Elektroda wprowadzona do pipety rejestruje aktywność kanałów jonowych w obrębie fragmentu błony lub, po przerwaniu uszczelnienia, dla całej komórki. W ostatniej dekadzie zaproponowano chipy do patch-clamp jako alternatywę 3, 4: zawieszona błona oddziela medium fizjologiczne od medium hodowlanego, a mikrofabrykowany w błonie otwór zastępuje wierzchołek pipety. Chipy do patch-clamp zostały zintegrowane z systemami zautomatyzowanymi i wprowadzone do obrotu w celu prowadzenia wysokoprzepustowych przesiewów 5. Aby zwiększyć przepustowość, obejmują one fluidyczne dostarczanie komórek z zawiesiny, ich pozycjonowanie nad otworem za pomocą ssania oraz zautomatyzowane procedury wykrywania uszczelnienia między komórką a sondą i przechodzenia w tryb całej komórki. Opisaliśmy proces produkcji krzemowego chipu do patch-clamp z optymalizowaną impedancją i kształtem otworu, który umożliwia wysokiej jakości rejestrację potencjałów czynnościowych w hodowanych neuronach ślimaka 6; niedawno zgłosiliśmy również postępy w badaniu neuronów ssaków 7. Nasze chipy do patch-clamp są produkowane w Canadian Photonics Fabrication Centre 8, komercyjnej odlewni, i są dostępne w dużych seriach. Jesteśmy zainteresowani współpracą z elektrofizjologami w celu walidacji zastosowania technologii NRCC w różnych modelach. Chipy są wykorzystywane zgodnie z ogólnym schematem przedstawionym na Rysunku 1: krzemowy chip znajduje się na dnie pleksiglasowej fiolki hodowlanej, a tył otworu jest połączony z podziemnym kanałem wyposażonym w rurki na obu końcach obudowy. Komórki są hodowane w fiolce, a komórka znajdująca się nad sondą jest monitorowana przez elektrodę pomiarową wprowadzoną do kanału. Dwa zewnętrzne porty fluidyczne umożliwiają wymianę roztworu przy minimalnym zaburzeniu komórki; jest to zaleta w porównaniu z szklanymi pipetami stosowanymi do perfuzji wewnątrzkomórkowej.
<img alt="Układ mikrofluidyczny z wzmacniaczem; na schemacie chip, komórki oraz fiolka do analizy DNA." src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1">
Rysunek 1. Zasada pomiaru z wykorzystaniem chipa do techniki patch-clamp NRCC
Opisujemy tutaj protokoły sterylizacji i przygotowania chipów, ich napełniania pożywką, wysiewania komórek, a na koniec wykorzystania ich do rejestracji elektrofizjologicznych.

Przedstawiamy sposób sterylizacji, przygotowania, napełniania medium, wysiewania komórek oraz wykorzystywania do rejestracji elektrofizjologicznej płaskich chipów do patch-clampu, wyprodukowanych w Narodowej Radzie Badań Kanady (National Research Council of Canada).

Hodowla i elektrofizjologia komórek na chipach do patch-clampingu NRCC

Ze względu na wyjątkową czułość oraz możliwość monitorowania i kontrolowania pojedynczych komórek na poziomie kanałów jonowych, metoda patch-clamp jest złotym standardem ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest rejestracja aktywności elektrofizjologicznej hodowlanych komórek za pomocą planarnego układu patch clamp. Osiąga się to poprzez sterylizację, przygotowanie i testowanie chipów patch clamp, aby umożliwić wzrost hodowli komórkowej i późniejsze monitorowanie jej aktywności elektrofizjologicznej. Po przetestowaniu chipy mogą być przechowywane do czasu ponownego przygotowania w laboratorium biologii komórki.W kolejnym kroku neurony są izolowane z kończyn oraz ogonów, a następnie wysiewane na chipy. Na koniec chipy są podłączone do wzmacniacza patch-clamp w celu monitorowania aktywności elektrofizjologicznej komórek. Główną zaletą tej technologii w porównaniu z istniejącymi chipami do płaskiego patch-clampu jest możliwość zastosowania jej w hodowlach neuronów, co pozwala na badanie komunikacji synaptycznej między neuronami.Niniejsza metoda i podejście pozwolą na lepsze zrozumienie funkcji kanałów jonowych komórek pobudliwych wbudowanych w sieć neuronalną, zarówno w warunkach prawidłowych, jak i patologicznych. Zastosowania tej metody obejmują farmakologię, gdzie może ona zostać wykorzystana do prowadzenia przesiewów leków o średniej przepustowości i wysokiej zawartości informacji w odniesieniu do kanałów jonowych i białek receptorowych. Do zademonstrowania tej metody wybraliśmy neurony ślimaka, ponieważ komórki te można łatwo pozycjonować i hodować.Ponieważ neurony te odtwarzają sieć w hodowli, stanowią one doskonały model do badań nad transformacją. Co ważniejsze, chipy te mogą być również wykorzystywane w innych systemach komórkowych, takich jak komórki kardiomiocytów i komórki nowotworowe. Głównym wyzwaniem przy stosowaniu planarnych chipów do techniki patch clamp jest uzyskanie chipów z czystymi otworami, wysianie oraz hodowla komórek.Niepodłączone chipy byłyby nieprzydatne, dlatego wszystkie chipy są testowane przed użyciem. Najbardziej krytycznym punktem oceny elektrofizjologicznej jest moment, gdy komórki zostaną już wyhodowane. Polega on na utworzeniu giga-uszczelnienia (giga seal) pomiędzy błoną komórkową a górnym krawędziowym otworem chipa.Wszystkie chipy do techniki patch clamp w układzie płaskim produkowane w danej dacie wykorzystywały izolowane komórki w zawiesinie i opierały się na ssaniu w celu przyciągnięcia komórek do otworu w celu utworzenia giga-uszczelnienia. Formowanie giga-uszczelnienia przy użyciu naszych chipów zachodzi spontanicznie.Podczas gdy neurony są w hodowli i nie wymagają odsysania, zaprezentuję etap sterylizacji i przesiewania chipów. Tanya wyjaśni proces ładowania w laboratorium biologii komórki, Colin zilustruje przygotowanie i wysiew komórek. Na koniec Marcia pokaże, w jaki sposób przeprowadzamy pomiary. Aby rozpocząć tę procedurę, wysterylizuj chipy w podstawowej plazmowej myjce herkowej przy resztkowym ciśnieniu powietrza od 0,1 do 0,3 mb przez 15 minut przy maksymalnej mocy 18 W.Obróbka plazmą sprawia również, że chip staje się hydrofilowy, co ułatwia jego przygotowanie (priming). Następnie na szklane rurki nałóż sterylną elastyczną laboratoryjną rurkę silikonową, o długości trzech cali na jednym końcu i jednego cala na drugim końcu. Następnie napełnij rurki sterylnym standardowym roztworem buforu fosforanowego, upewniając się, że nie pozostały w nich żadne pęcherzyki powietrza.Zaciśnij długą rurkę silikonową, poddając PBS ciśnieniu jednego atmosfery od strony krótkiego końca. Następnie zwolnij ciśnienie w kanale płynowym. Po tym kroku napełnij fiolkę PBS za pomocą strzykawki.Zanurz elektrodę srebro/chlorek srebra w fiolce, a elektrodę pomocniczą w krótkiej rurce. Użyj miernika impedancji, aby potwierdzić, że rezystancja dostępowa wynosi od 300 kΩ do 3 MΩ, a pojemność bocznikowa mieści się w zakresie od 10 pF do 25 pF. Następnie przepłucz kanał mikroprzepływowy sterylną wodą dejonizowaną.Opróżnij górną fiolkę i powtórz proces płukania dwukrotnie. Następnie zanurz opakowanie z chipem i probówkami w świeżej, sterylnej wodzie dejonizowanej na 30 minut. Następnie umieść pozostałe chipy w sterylnym pojemniku wypełnionym sterylną wodą dejonizowaną.Zapewnia to, że chipy pozostają hydrofilowe i są chronione przed kontaminacją. Otwórz pojemnik z chipami pod laminarnym przepływem powietrza z filtrem HEPA i wyjmij chipy, kierując górną fiolkę w dół, aby uniknąć zanieczyszczenia przez zanieczyszczenia z opakowania unoszące się na powierzchni wody. Aby usunąć wszelkie pozostałości z powierzchni chipa, przepłucz górną fiolkę dwukrotnie filtrowaną sterylną wodą dejonizowaną. Podłącz jeden koniec elastycznej rurki przymocowanej do kanału fluidycznego do strzykawki ciśnieniowej zawierającej sterylną filtrowaną wodę dejonizowaną.W tym systemie woda w strzykawce jest poddawana ciśnieniu za pomocą zbiornika ze sprężonym powietrzem ustawionego na jedną atmosferę, przy czym w celu zapewnienia sterylności powietrze jest filtrowane przed wprowadzeniem do strzykawki. System ten jest również wyposażony w dwa zawory otwierająco-zamykające, które umożliwiają kontrolę ciśnienia w razie potrzeby. Zaciśnij końcówkę wylotową układu płynowego za pomocą kleszczyków hemostatycznych.Następnie otwórz zawór zbiornika ze sprężonym powietrzem, aby zwiększyć ciśnienie roztworu. Następnie otwórz kleszczyki hemostatyczne na końcu wylotowym układu przepływowego, aby przepłukać chip świeżą sterylną wodą dejonizowaną. Zaciśnij kleszczykami hemostatycznymi koniec wylotowy układu przepływowego, aby wymusić przepływ wody w górę przez otwór.Aby uniknąć odpływu cieczy, zaciśnij wlot układu płynowego kleszczykami hemostatycznymi i zamknij zawory otwierająco-zamykające. Następnie odłącz końcówkę wlotową rurki od strzykawki. Zabezpiecz oba końce rurki i zdejmij kleszczyki hemostatyczne.Napełnij górną fiolkę przefiltrowaną sterylną wodą dejonizowaną. Następnie umieść pokrywkę sterylnej szalki 35 mm na podstawie sterylnej szalki 100 mm. Następnie umieść chip na pokrywce szalki 35 mm i przykryj całość pokrywką szalki 100 mm.W celu upewnienia się, że membrana i otwór w chipach są wolne od zanieczyszczeń lub pęcherzyków powietrza, wykonuje się obrazowanie chipów. W przypadku stwierdzenia obecności zanieczyszczeń lub pęcherzyków powietrza, kanał płynowy oraz górna fiolka są wielokrotnie płukane sterylną wodą.Jeśli zanieczyszczenia lub pęcherzyki powietrza nie mogą zostać usunięte, chip należy odrzucić. Po wykonaniu obrazowania chipów należy przenieść je z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Odłącz oba końce rurki.Podłącz jeden koniec rurki do strzykawki pod ciśnieniem zawierającej medium fizjologiczne i zaklemuj koniec wylotowy rurki za pomocą zacisku hemostatycznego, aby przepłukać podziemny układ płynowy medium fizjologicznym. Otwórz zawory włącznik/wyłącznik i zdejmij zacisk hemostatyczny z końca wylotowego rurki, aby wtłoczyć medium fizjologiczne przez otwór, a następnie zaklemuj koniec wylotowy rurki zaciskiem hemostatycznym, zaklemuj koniec wlotowy rurki zaciskiem hemostatycznym i zamknij zawory włącznik/wyłącznik. Następnie odłącz koniec wlotowy rurki od strzykawki i zakorkuj oba końce rurki korkami szklanymi.Następnie usuń kleszczyki hemostatyczne. Po tym odessaj wodę z górnej fiolki. Napełnij górną fiolkę przefiltrowaną sterylną pożywką.Umieść chip z powrotem w 100 milimetrowej płytce. Następnie ustaw podstawę 35 milimetrowej płytki w 100 milimetrowej płytce i napełnij ją filtrowaną, sterylną wodą dejonizowaną w celu zwiększenia wilgotności. Następnie przykryj płytkę do momentu wysiewania.Aby rozpocząć tę procedurę, usuń zewnętrzną skorupę ślimaków w wieku od dwóch do trzech miesięcy za pomocą tępych pęsety. Następnie znieczul zwierzęta w soli limba zawierającej 10% Listerine w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przypnij ślimaki do naczynia typu cell guard wypełnionego solą limba i usuń cały mózg.Następnie wyizolowane mózgi inkubuje się w zdefiniowanym medium z enzymem trypsyną przez 18 minut. Po tym czasie poddaje się je działaniu zdefiniowanego medium i inhibitora trypsyny. Przez 15 minut mózgi przytwierdza się do małej szalki hodowlanej wypełnionej zdefiniowanym medium o wysokiej osmolarności, używając do tego pęsety precyzyjnej i nożyczek sekcyjnych.Usuń osłonkę zewnętrzną i wewnętrzną wybranych zwojów, aby odsłonić neurony. Następnie przymocuj wypolerowaną ogniowo pipetę szklaną, wypełnioną zdefiniowanym medium o wysokiej osmolarności, do mikroszydrzyki i delikatnie zastosuj ssanie w pobliżu wybranej komórki, aż neuron oddzieli się od mózgu i zostanie zawieszony w pipecie. Po zmianie medium w układzie płynnym neurochipu na odpowiedni roztwór rejestrujący, skieruj końcówkę szklanej pipety do fiolki z kulturą i delikatnie umieść neuron nad otworem chipu.Pozostawić komórki bez zakłóceń przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić ich przytwierdzenie do powierzchni chipa wokół otworu. W celu zapewnienia stabilności zastąpić roztwór w naczyniu hodowlanym odpowiednim roztworem rejestrującym. Przykleić chip do szkiełka przedmiotowego i umieścić go pod mikroskopem, aby podłączyć chipy do wzmacniacza.Odetnij dłuższy koniec rurki i włóż srebrny drut połączony z przedwzmacniaczem głowicowym. Następnie umieść elektrodę odniesienia w naczyniu z hodowlą na chipie. Chip jest teraz gotowy do rejestracji.Poniżej przedstawiono przykład odpowiedzi napięciowej jednego neuronu grzbietowego lewej pedalu na stopniowaną serię wewnątrzkomórkowych impulsów prądowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej hodowlanych komórek za pomocą płaskiego chipu do patch-clampu. Należy pamiętać, że w pierwszym kroku przesiewamy chipy, aby upewnić się, że te, których nie użyto do wysiewania komórek, mają zatkane otwory; użytkownicy Ture Biology rozpoczynają od etapu ładowania i zazwyczaj wciąż znajdują kilka zablokowanych chipów w każdej partii.Ta nowa metoda stanowi istotny przełom w opracowaniu taniej technologii, która umożliwia analizę sieci neuronalnych in vitro z niespotykaną dotąd rozdzielczością. Technologia ta może prowadzić do opracowania zaawansowanych testów służących do identyfikacji celów terapeutycznych, rozwoju leków oraz oceny diagnostycznej. Dalszy rozwój tej technologii dostarczy badaczom w dziedzinie zdrowia nowych narzędzi do poszukiwania innowacyjnych terapii chorób i zaburzeń neurologicznych.Jego potencjał obejmuje komórki serca, nowotwory oraz inne komórki wykazujące właściwości elektrogenne.

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Hodowla komórek i ich elektrofizjologia na układach NRCC Patch-clamp

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

W tym filmie, embrionalne hodowle komórek nerkowych wyrażające zależne od światła białka kanału jonowego połączone fluorescencyjnym reporterem demonstrują wpływ światła na ruch jonów. Zacisk krosowy na całe komórki służy do monitorowania ruchu jonów.

Zapis elektrofizjologii optogenetycznej komórek z kanałami jonowymi zależnymi od światła

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Aferentne neurony czuciowe przekazują informacje sensoryczne z peryferii do ośrodkowego układu nerwowego. Identyfikacja konkretnych neuronów aferentnych pomoże w zrozumieniu ich fizjologii. Opisujemy metodę znakowania wstecznego w celu identyfikacji neuronów aferentnych i badania kanałów jonowych bramkowanych napięciem w tych neuronach za pomocą elektrofizjologii i immunocytochemii za pomocą elektrofizjologii i immunocytochemii.

Identyfikacja specyficznych populacji neuronów czuciowych w celu badania ekspresji kanałów jonowych

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Opisano metodę stymulacji aktywności elektrycznej kultur komórkowych in vitro za pomocą światła widzialnego, opartą na użyciu organicznych polimerów półprzewodnikowych.

Optyczna kontrola aktywności elektrycznej żywych komórek za pomocą sprzężonych polimerów

Ten artykuł opisuje, jak selektywność jonowa rodopsyny kanałowej jest określana za pomocą elektrofizjologicznych zapisów całokomórkowych z użyciem komórek HEK293. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalną procedurę badania selektywności chlorkowej selektywnej dla anionów rodopsyny kanałowej. Procedura ta może być jednak przenoszona na inne rodopsyny kanałowe o wyraźnej selektywności.

Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) okazały się obiecującym modelem in vitro do badań przesiewowych kardiotoksyczności indukowanej lekami i modelowania chorób. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru kurczliwości i elektrofizjologii hiPSC-CM.

Techniczne zastosowania nagrań matrycy mikroelektrod i patch clamp na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę hodowli i elektrofizjologii neuronów na chipach krosowych NRCC. Technika planar patch-clamp umożliwia rejestrację aktywności jonowych kanałów w sieciach neuronalnych z wysoką rozdzielczością.

Hodowla i elektrofizjologia komórek na chipach do patch-clampingu NRCC

Przeglądaj więcej filmów