Name: Izolacja RNA Pseudomonas aeruginosa kolonizująca mysi przewód pokarmowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj niezawodną metodę izolacji RNA z Pseudomonas aeruginosa z mysich jelit cienkich. Technika zapewnia wysoką jakość materiału do analiz qPCR, profilowania transkrypcyjnego i sekwencjonowania RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana z grantów National Institutes of Health AI62983 (AYK) oraz AI22535 (GPB).

1. Mysi model P. aeruginosa Kolonizacja i rozprzestrzenianie się w przewodzie pokarmowym
<ol>
<li>Myszy C3H/HeN (samice, 6-8 tygodni, Harlan) poddaje się leczeniu antybiotykami doustnymi w celu usunięcia flory komensalnej, a następnie mono-kolonizuje się je szczepem PA zgodnie z wcześniej opisaną procedurą4.</li>
</ol>
2. Pobieranie zawartości światła kątnicy myszy
<ol>
<li>Zanurzyć oczyszczony moździerz ze stali nierdzewnej w kąpieli z ciekłego azotu.</li>
<li>Uśmiercić myszy poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla.</li>
<li>Ustabilizować truchło myszy na styropianowej płytce i spryskać 95% etanolem. Wykonać podłużne cięcie pośrodku skóry od mostka do krocza. Odsunąć skórę i otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną.</li>
<li>Wyciąć całe kątnicę. Przytrzymać kątnicę pęsetą nad stalowym moździerzem. Odciąć oba końce kątnicy nożyczkami chirurgicznymi.</li>
<li>Wprowadzić końcówkę pipety P1000 wypełnioną 1 ml buforu do płukania kątnicy (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA i 200 mM NaCl)5 do proksymalnego końca kątnicy. Wpłukać bufor oraz zawartość światła kątnicy do stalowego moździerza. 1 ml buforu do płukania kątnicy będzie wystarczający do usunięcia całej zawartości kątnicy. Wypłukana zawartość kątnicy zamarznie natychmiast po zetknięciu się z moździerzem.</li>
<li>Rozetrzeć zamrożoną zawartość kątnicy sterylnym tłuczkiem.</li>
<li>Przenieść rozdrobnioną, zamrożoną zawartość światła kątnicy do polipropilenowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, zanurzonej w kąpieli z suchego lodu i etanolu.</li>
<li>Powtórzyć kroki od 2.2 do 2.7 dla każdej kolejnej myszy.</li>
<li>Przechowywać w temperaturze -80°C.</li>
</ol>
3. Izolacja bakteryjnego RNA
<ol>
<li>Podgrzać 1 objętość (w odniesieniu do końcowej objętości zawartości światła dwóch kątnic, ok. 3 ml) kwasowego fenolu/chloroformu (5:1, v/v), umieszczonego w 50 ml probówce wirówkowej Oak Ridge z zakrętką zabezpieczoną parafilmem, w łaźni wodnej o temperaturze 65°C.</li>
<li>Gotować 0,5 objętości buforu do lizy (2% SDS, 16 mM EDTA i 200 mM NaCl)6, umieszczonego w 50 ml stożkowej probówce polipropylenowej, przez 5 minut.</li>
<li>Dodać gotujący się bufor do lizy do zawartości światła kątnicy. Homogenizować. Gotować przez 5 minut, okresowo mieszając na wirówce typu vortex.</li>
<li>Przenieść próbkę zawartości kątnicy/buforu do lizy o temperaturze 100°C do kwasowego fenolu/chloroformu o temperaturze 65°C w probówce wirówkowej Oak Ridge. Zakrętkę zabezpieczyć parafilmem.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 65°C przez 10 minut, okresowo mieszając na wirówce typu vortex (co 2 minuty).</li>
<li>Wirować próbkę z prędkością 2,500 g w temperaturze 4° przez 15 minut.</li>
<li>Ostrożnie przenieść fazę wodną (unikając białego interfejsu) do nowej 50 ml probówki wirówkowej Oak Ridge. Objętość fazy wodnej będzie wynosić ok. 50% całkowitej objętości zawartości kątnicy, buforu do lizy i kwasowego fenolu/chloroformu. Dodać równą objętość kwasowego fenolu/chloroformu.</li>
<li>Zakrętkę zabezpieczyć parafilmem i dokładnie wymieszać za pomocą wirówki typu vortex z wysoką prędkością.</li>
<li>Wirować próbkę z prędkością 2,500 g w temperaturze 4° przez 15 minut.</li>
<li>Powtarzać kroki od 3.7 do 3.9, aż do czasu, gdy między fazą wodną a organiczną nie będzie widoczny biały interfejs.</li>
<li>Ostrożnie przenieść fazę wodną do nowej 50 ml probówki wirówkowej Oak Ridge. Dodać równą objętość chloroformu/alkoholu izoamylkowego (24:1, v/v).</li>
<li>Zakręcić probówkę i dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex.</li>
<li>Wirować próbkę z prędkością 2,500 g w temperaturze 4° przez 15 minut. Przenieść fazę wodną (objętość będzie wynosić ok. 50% całkowitej objętości reakcji) do 15 ml stożkowej probówki polipropylenowej i dodać równą objętość izopropanolu.</li>
<li>Inkubować w temperaturze -20° przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.</li>
<li>Wirować próbkę z prędkością 2,500 g w temperaturze 4° przez 45 minut. Na dnie probówki utworzy się żelowaty osad. Usunąć nadosad.</li>
<li>Przemyć osad 1 ml lodowatego 70% etanolu. Wymieszać na wirówce typu vortex. Wirować próbkę z prędkością 10,000 g w temperaturze 4° przez 5 minut.</li>
<li>Usunąć nadosad i odwrócić probówkę, aby osad wysychał w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
<li>Resuspendować osad RNA w 200 μl wody wolnej od RNaz.</li>
</ol>
4. Traktowanie DNazą (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems)
<ol>
<li>Dodać 20 μl 10X buforu Turbo DNase oraz 2 μl Turbo DNase i delikatnie wymieszać.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37° przez 20 minut.</li>
<li>Dodać 20 μl resuspenderowanego odczynnika do inaktywacji DNazy i dobrze wymieszać.</li>
<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, mieszając sporadycznie.</li>
<li>Wirować przy 10 000 g w temperaturze pokojowej przez 1,5 minuty, a następnie przenieść nadsącz do nowej probówki do mikrowirowania.</li>
<li>Dodać jedną objętość zimnego (4°) kwasowego fenolu/chloroformu i dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex przez 1 minutę.</li>
<li>Wirować przy 12 500 g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
<li>Przenieść fazę wodną do nowej probówki i dodać 1 objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego (49:1 v/v), następnie wymieszać w wirówce typu vortex.</li>
<li>Wirować przy 12 500 g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
<li>Przenieść fazę wodną (około 50% całkowitej objętości reakcji) do nowej probówki.</li>
<li>Dodać 0,1 objętości 3M octanu sodu (pH 5,5) oraz 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu. Wymieszać w wirówce typu vortex.</li>
<li>Inkubować w temperaturze -20° przez co najmniej 2 godziny lub w -80° przez 30 minut.</li>
<li>Wirować przy 12 000 g przez 30 minut w temperaturze 4°.</li>
<li>Usunąć nadsącz.</li>
<li>Przemyć osad 1 ml lodowatego 70% etanolu, wirując przez 5 minut przy 10 000 g w temperaturze 4°.</li>
<li>Usunąć nadsącz i suszyć na powietrzu przez 10 minut.</li>
<li>Resuspenderować osad w 100 μl wody wolnej od RNaz. Może być konieczne umieszczenie probówki w kąpieli wodnej o temperaturze 65°, aby resuspenderować i rozpuścić osad.</li>
<li>Aby sprawdzić skuteczność traktowania DNazą, można przeprowadzić standardową reakcję RT-PCR w celu amplifikacji białka rybosomalnego (lub innego genu referencyjnego) dla próbek traktowanych i nietraktowanych, stosując kontrole bez RT.</li>
</ol>
5. Etap oczyszczania RNA (Qiagen, zestaw RNeasy)
<ol>
<li>Należy zapoznać się z stronami 56-57 podręcznika Qiagen RNeasy Mini Handbook (4th Edition, kwiecień 2006). Postępować zgodnie z instrukcjami.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Ilość całkowitego bakteryjnego RNA odzyskanego przy użyciu tego protokołu wynosi około 2-3 μg z dwóch kątnic. Odzyskane RNA posiada wystarczającą ilość i jakość do późniejszych eksperymentów qPCR, profilowania transkrypcyjnego oraz RNA Seq. Czystość RNA jest rutynowo oceniana poprzez pomiar stosunku 260nm/280nm7 próbki, jednak metoda ta nie dostarcza informacji o integralności RNA. Agilent Bioanalyzer to platforma oparta na mikrofluidyce służąca do określania wielkości, kwantyfikacji i kontroli jakości DNA, RNA, białek i komórek; wykorzystuje ona wskaźnik integralności RNA znany jako RNA Integrity Number (RIN)8. RNA ekstrahowane zgodnie z tym protokołem daje stosunki 260/280 w zakresie od 1.7 do 2.0 oraz wartości RIN ≥ 7.0. Przykład analizy bakteryjnego RNA odzyskanego tym protokołem za pomocą Agilent Bioanalyzer przedstawiono na Rysunku 1.
<img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="Wyniki elektroforezy; rozdział DNA, analiza długości fragmentów z wykresem i prążkami żelu, drabina DNA." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Elektroferogram z Agilent Bioanalyzer oraz obraz przypominający żel dla próbki całkowitego RNA Pseudomonas aeruginosa wyizolowanego i odzyskanego z treści kątnicy myszy. RIN 8.0.

<ol><li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li>
<li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endemicity%2C+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li>
<li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li>
<li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li>
<li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li>
<li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li>
<li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda ekstrakcji RNA pozwala na odzyskanie wystarczającej ilości wysokiej jakości całkowitego RNA Pseudomonas aeruginosa pobranego z przewodu pokarmowego myszy. Metoda ta nie ogranicza się wyłącznie do P. aeruginosa i potencjalnie może być zastosowana do innych bakterii. Odzyskiwanie wystarczającej liczby mikroorganizmów z jelit będzie się znacznie różnić w zależności od gatunku. W naszym modelu mysim P. aeruginosa zazwyczaj kolonizuje przewód pokarmowy myszy na poziomach od 5 x 107 do 5 x 108 cfu/g kału4. Ponieważ odzyskana treść kątnicy waży około 0,5 grama, szacowana liczba P. aeruginosa odzyskana z dwóch kątnic wynosi od 5 x 107 do 5 x 108 cfu. W przypadku użycia innych mikroorganizmów zasadne byłoby zweryfikowanie poziomów kolonizacji przewodu pokarmowego, a następnie obliczenie liczby kątnic niezbędnych do odzyskania docelowej liczby cfu. Należy również zauważyć, że przy zastosowaniu tego konkretnego modelu mysiego, u myszy leczonych antybiotykami i niezakażonych PA nie izoluje się mierzalnych ilości RNA z treści kątnicy.
Nasz mysi model kolonizacji i rozprzestrzeniania się Pseudomonas aeruginosa w przewodzie pokarmowym ma na celu odwzorowanie patogenezy bakteriemii wywołanej przez P. aeruginosa u pacjentów z nowotworami oraz osób po przeszczepieniu komórek macierzystych. W tej populacji pacjentów flora komensalna jest często zubożona w wyniku leczenia antybiotykami lub chemioterapią (np. antybiotykowe wyniszczenie komensalnej flory przewodu pokarmowego), co prowadzi do nadmiernego rozrostu drobnoustrojów patogennych (np. monoasocjacji z P. aeruginosa), a następnie do ich rozprzestrzeniania się po immunosupresji. Zalety i ograniczenia tego mysiego modelu zostały omówione we wcześniejszych publikacjach4. Celem niniejszego badania jest przedstawienie metodologii izolacji całkowitego RNA mikrobiologicznego z przewodu pokarmowego. Niniejszy protokół można łatwo zaadaptować do innych modeli mysich służących do badania innych aspektów patogenezy mikrobiologicznej w przewodzie pokarmowym (np. interakcji flory komensalnej, wpływu bakterii na nieswoiste zapalne choroby jelit itp.).
Zaletą tej metody jest zastosowanie wielu etapów lizy, w tym cykli zamrażania i rozmrażania, rozrywania mechanicznego (rozcierania w moździerzu, homogenizacji), gotowania oraz lizy chemicznej (np. SDS). Pomimo licznych etapów lizy, niektóre mikroorganizmy (zwłaszcza bakterie Gram-dodatnie oraz grzyby/drożdże) mogą wymagać dodatkowego rozrywania mechanicznego. Po inkubacji w warunkach gorącej lizy z fenolem i chloroformem w środowisku kwasowym (Krok 3.5), dodanie kulek (0,1 mm dla bakterii i/lub 0,5-0,7 mm dla drożdży) oraz następujący po tym etap homogenizacji kulkowej powinny być wystarczające do lizy tych organizmów9, 10.
Ze względu na złożony charakter materiałów pozyskiwanych z kąkolicznicy mysiej, wielokrotne zimne ekstrakcje kwasem fenolowym/chloroformem (Krok 3.7 do 3.9) są absolutnie niezbędne do uzyskania akceptowalnej jakości i integralności RNA do dalszych reakcji. Może być wymagane przeprowadzenie od 3 do 5 zimnych ekstrakcji kwasem fenolowym/chloroformem, zanim biała warstwa przejściowa między fazą wodną a organiczną zostanie całkowicie usunięta. Ostatecznie, połączenie traktowania DNazą (Krok 4) oraz protokołu oczyszczania RNeasy (Krok 5) jest niezbędne do usunięcia zanieczyszczeń w postaci DNA oraz małych cząsteczek niebędących mRNA (5s i tRNA). Jak wspomniano wcześniej, RNA odzyskane przy użyciu niniejszego protokołu charakteryzuje się ilością i jakością wystarczającą do późniejszych eksperymentów z profilowaniem transkrypcyjnym 3, qPCR (nieopublikowano) oraz RNA Seq (nieopublikowano).

<table><tbody><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-947-1</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>Omni</td><td>TM-125</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Oak Ridge (50 ml)</td><td>Nalge Nunc international</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Kwasowy fenol/chloroform</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoamylkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>Węglan diethylopirokarbonianu (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718</td><td></td></tr><tr><td>DNaza</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>3M octan sodu</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja rna z pseudomonas aeruginosa kolonizującej przewód pokarmowy myszy

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) powodują znaczną zachorowalność i śmiertelność u gospodarzy z upośledzonym układem odpornościowym, takich jak pacjenci z białaczką, rozległymi oparzeniami lub po przeszczepach organów1. U pacjentów z wysokim ryzykiem wystąpienia zakażeń krwi PA, głównym rezerwuarem kolonizacji jest przewód pokarmowy (GI)2, jednak mechanizmy, dzięki którym PA przechodzi z postaci bezobjawowego mikroba kolonizującego w inwazyjny i często śmiertelny patogen, pozostają niejasne. Wcześniej przeprowadziliśmy eksperymenty z profilowaniem transkrypcji in vivo, izolując mRNA PA z komórek bakteryjnych znajdujących się w kątnicach skolonizowanych myszy 3, aby zidentyfikować zmiany w ekspresji genów bakteryjnych podczas zmian stanu odporności gospodarza.
Podobnie jak w każdym eksperymencie z profilowaniem transkrypcji, etapem ograniczającym tempo jest izolacja wystarczającej ilości wysokiej jakości mRNA. Biorąc pod uwagę obfitość enzymów, detrytusów, resztek pokarmowych i cząsteczek stałych w przewodzie pokarmowym, izolacja RNA stanowi ogromne wyzwanie. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę niezawodnej i powtarzalnej izolacji bakteryjnego RNA pozyskanego z przewodów pokarmowych myszy. Metoda ta wykorzystuje dobrze ugruntowany model mysi kolonizacji przewodu pokarmowego przez PA oraz dysseminacji indukowanej neutropenią4. Po potwierdzeniu kolonizacji przewodu pokarmowego przez PA, myszy są uśmiercane, a zawartość kąkrzewnika jest pobierana i błyskawicznie mrożona. Następnie RNA jest ekstrahowane z wykorzystaniem kombinacji rozbicia mechanicznego, gotowania, ekstrakcji fenol/chloroform, traktowania DNazą oraz chromatografii powinowactwa. Ilość i czystość są potwierdzane za pomocą spektrofotometrii (Nanodrop Technologies) i bioanalizatora (Agilent Technologies) (Rys 1). Tę metodę izolacji mikrobiologicznego RNA z przewodu pokarmowego można łatwo zaadaptować również do innych bakterii i grzybów.

Opisano niezawodną metodę izolacji RNA z Pseudomonas aeruginosa wyizolowanej z kątnic myszy. Odzyskane RNA charakteryzuje się ilością i jakością wystarczającą do późniejszych eksperymentów qPCR, profilowania transkrypcyjnego oraz sekwencjonowania RNA (RNA Seq). Technikę tę można dostosować do izolacji RNA z innych drobnoustrojów jelitowych.

Izolacja RNA z Pseudomonas aeruginosa kolonizującej przewód pokarmowy myszy

Zakażenia wywołane przez Pseudomonas aeruginosa (PA) prowadzą do znacznej zachorowalności i śmiertelności u gospodarzy z upośledzonym układem odpornościowym, takich jak pacjenci z...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie całkowitego RNA Pseudomonas aerogen odzyskanego z mysich ECM. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie zawartości światła jelita końcowego, a następnie poprzez izolację RNA bakteryjnego.Następnie przeprowadzono obróbkę D'S oraz oczyszczanie RNA. Na koniec określono ilość RNA i sprawdzono czystość izolatu za pomocą bioanalizatora oraz analizy spektrofotometrycznej. W rezultacie uzyskano bakteryjne RNA o odpowiedniej jakości i ilości, które może zostać poddane dalszej ocenie eksperymentalnej, na przykład za pomocą QPCR, analizy, profilowania transkrypcyjnego lub eksperymentów z sekwencjonowaniem RNA.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekstrakcja triolowa, jest fakt, że metoda ta obejmuje wielokrotne etapy lizy w bardzo rygorystycznym środowisku kwasowym oraz etapy ekstrakcji chloroformem, co zapewnia wysoką jakość RNA. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy lizy i ekstrakcji są trudne do opanowania, a protokoły pisemne pomijają drobne szczegóły, które są krytyczne dla sukcesu. Procedurę zaprezentują Eduardo Lopez Medina, stażysta postdoctoralny, oraz Megan Neubauer, kierownik laboratorium, oboje z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem zbioru IMSA czyści moździerz ze stali nierdzewnej w kąpieli z ciekłego azotu.Następnie, po euthanazji sześciu- lub ośmiotygodniowej myszy szczepu C3 HHEN skolonizowanej przez Pseudomonas aerogen, należy umieścić zwierzę w pozycji grzbietnej na styropianowej płytce i spryskać brzuch 95% etanolem. Następnie należy wykonać podłużne nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry od mostka do krocza. Po tym odsunąć skórę oraz otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną.Następnie wyciąć całe ślepe jelito za pomocą pincety. Przytrzymać ślepe jelito nad moździerzem ze stali nierdzewnej, a następnie odciąć oba jego końce nożyczkami do sekcji. Napełnić końcówkę pipety P 1000 jednym mililitrem buforu sequel flush eight, a następnie wprowadzić końcówkę do proksymalnego końca ślepego jelita.Wypłucz zawartość buforu Sequel Flush Eight oraz zawartość światową Sequel do stalowego moździerza. Następnie rozetrzyj zawartość Sequel Flush Eight za pomocą sterylnego tłuczka.Następnie wlej etanol do pojemnika z suchym lodem i umieść 50 mililitrową stożkowatą probówkę polipropylenową w kąpieli z etanolu i suchego lodu. Przenieś zmieloną mrożoną zawartość światła jelita do probówki stożkowej i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Kolejna seria kroków jest najtrudniejszą częścią procedury.Ze względu na złożony charakter materiałów pobieranych z kątnicy MI, wielokrotne ekstrakcje na zimno za pomocą fiofilu są absolutnie niezbędne w celu uzyskania odpowiedniej jakości i integralności; może być wymagane od trzech do pięciu ekstrakcji, zanim zostanie wyeliminowana szeroka granica między fazą wodną a organiczną. Przenieś jedną objętość fenolu kwasowego z chloroformem do 50 ml probówki wirówkowej Oak Ridge. Zabezpiecz zakrętkę parafinią, a następnie ogrzej probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C.Do 50 mililitrowej stożkowej probówki z polipropylenu należy wlać połowę objętości buforu do lizy, a następnie gotować bufor przez pięć minut. Po wyjęciu zawartości luminalnej sekweli z przechowywania w temperaturze minus 80 °C, krótko ogrzać probówkę, energicznie pocierając ją w dłoniach, a następnie dodać do probówki gotujący się bufor do lizy. Wstrząsnąć mieszaniną, aby zhomogenizować roztwór zawartości luminalnej SQL w buforze do lizy.Gotować bufor do lizy oraz zawartość SQL luminal przez pięć minut. Po okresowym wirowaniu w vortexie otworzyć probówkę wirówkową Oak Ridge zawierającą roztwór fenol-chloroformu i przenieść próbkę lizy z zawartością SQL do probówki. Następnie ponownie zamknąć zakrętkę za pomocą profilu i umieścić probówkę z powrotem w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C na 10 minut, wstrząsając probówką co dwie minuty.Przemyj próbkę przy 2 500 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej probówki wirówkowej Oak Ridge o pojemności 50 ml, unikając pobrania białej warstwy przejściowej. Następnie dodaj do nowej probówki równą objętość kwasowego fenolo-chloroformu.Uszczelnić zakrętkę za pomocą Parafilmu i dokładnie wymieszać zawartość, wirując probówkę na vortexie z dużą prędkością. Kontynuować wirowanie próbki i przenieść fazę wodną do probówki wirówkowej. Jeśli objętość górnej fazy wodnej stanie się zbyt mała, można ją przenieść do probówki o mniejszej średnicy.Kontynuuj ten proces, aż biała granica między fazą wodną a organiczną przestanie być widoczna. Po całkowitym zniknięciu białej granicy ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej probówki do wirowania. Następnie dodaj do probówki taką samą objętość mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego, szczelnie zamknij nakrętkę i dokładnie wymieszaj zawartość za pomocą vortexera.Następnie, po ponownym odwirowaniu próbki, przenieś fazę wodną do 15 mililitrowej stożkowej probówki polipropylenowej i dodaj równą objętość izopropanolu. Następnie inkubuj roztwór w temperaturze -20 °C przez co najmniej dwie godziny lub przez noc. Po inkubacji próbki odwiruj probówkę przez 45 minut.Po zidentyfikowaniu żelowatego osadu na dnie probówki, usuń supernatant. Następnie przemyj osad jednym mililitrem lodowatego, 70% etanolu, mieszając probówkę w wstrząsarzu typu vortex, a następnie odwirowuj próbkę przy 10 000 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na koniec usuń supernatant i odwróć probówkę, aby osad wysuszył się na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie resuspenduj osad RNA w 200 µL wody wolnej od RNA. Najpierw dodaj do probówki do wirówki 20 µL 10x buforu turbo DNA oraz 2 µL turbo DNA i delikatnie wymieszaj roztwór. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut, po czym dodaj do probówki 20 µL resuspendowanego odczynnika do inaktywacji DNA i dokładnie wymieszaj.Następnie inkubuj probówkę przez kolejne pięć minut w temperaturze pokojowej, sporadycznie mieszając zawartość. Potem zwirowuj osad w mikrocentryfużce z prędkością 10,000 ×g przez 1,5 minuty, a następnie przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfużki. Do osadu dodaj jedną objętość zimnego kwasowego fenolu z chloroformem, a następnie dokładnie wymieszaj roztwór, wirując go na wortexie przez jedną minutę.Po wirowaniu roztworu przez dwie minuty przy 12 500 ×g, przenieś fazę wodną do nowej probówki i dodaj jedną objętość chloroformu z alkoholem izoamylowym. Następnie wymieszaj roztwór za pomocą wortexa i ponownie odwiruj go w tych samych warunkach. Przenieś fazę wodną do nowej probówki do mikrocentryfugi.Następnie dodać 0,1 objętości trzy molowego octanu sodu oraz 2,5 objętości lodowatego, 100% etanolu. Wymieszać zawartość probówki za pomocą wortexa. Inkubować próbkę w temperaturze -80 °C przez 30 minut.Następnie, po wirowaniu przy 12 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4°C, należy usunąć nadnadkład. Na koniec przemyć osad 1 ml lodowatego 70% etanolu. Usunąć nadnadkład i pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.Następnie przesuspenduj osad w 100 µL wody wolnej od RNaz. Agilent Bioanalyzer to platforma oparta na mikrofluidyce służąca do określania wielkości, ilościowego oznaczania oraz kontroli jakości DNA, RNA, białek i komórek, która wykorzystuje wskaźnik integralności RNA znany jako RNA integrity number lub RIN. RNA wyekstrahowane zgodnie z tym protokołem wykazuje stosunki 260 do 280 w zakresie od 1,7 do 2,0 oraz wartości RIN większe lub równe 7,0.Po lewej stronie przedstawiono przykład elektroferogramu bakteryjnego RNA wykonanego za pomocą bioanalizatora Agilent, a po prawej obraz przypominający żel dla Pseudomonas arosa wyizolowanej z zawartości mysich SQL. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowe PCR lub sekwencjonowanie RNA, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. w zakresie precyzyjnego profilowania ekspresji genów.

rna-isolation-pseudomonas-aeruginosa-colonizing-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Morrill, S. R., et al. Modele kolonizacji pochwy przez bakterie hodowane beztlenowo. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia protokół modelowania kolonizacji pochwy u myszy przy użyciu bakterii beztlenowych opornych na antybiotyki. Rozpoczyna się od leczenia hormonalnego w celu zwiększenia podatności nabłonka, a następnie inokulacji dopochwowej i koinokulacji w warunkach beztlenowych. Procedura kończy się pobraniem próbek po inokulacji i hodowlą w celu oceny kolonizacji bakteryjnej i...

Modelowanie kolonizacji pochwy myszy przez bakterie beztlenowe

Źródło: Taylor, M. N., et.al. Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności interakcji Caenorhabditis elegans z bakteriami. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje narażenie wolnych od zarazków, dopasowanych do wieku robaków Caenorhabditis elegans na szczep bakteryjny w celu kolonizacji jelit. Wyjaśnia selektywne usuwanie nieprzylegających i zewnętrznych bakterii, pozostawiając tylko żywe bakterie przylegające do nabłonka jelitowego w celu...

Ocena kolonizacji bakteryjnej jelit u C. elegans wolnych od zarazków

Opisano kolonizację mysiego nosogardzieli Streptococcus pneumoniae i późniejszą ekstrakcję przylegających lub zrekrutowanych komórek. Technika ta polega na przepłukiwaniu nosogardzieli i zbieraniu płynu przez nozdrza i można ją dostosować do różnych odczytów, w tym różnicowej kwantyfikacji komórek i analizy ekspresji mRNA in situ.

Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Sorter robaków ułatwia badania genetyczne u Caenorhabditis elegans, sortując robaki według ekspresji fluorescencyjnych reporterów. W tym miejscu opisujemy nowe zastosowanie: sortowanie według kolonizacji przez patogen wykazujący ekspresję GFP i wykorzystujemy je do zbadania słabo poznanej roli rozpoznawania patogenu w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej.

Automatyczna separacja C. elegans skolonizowanych przez patogen bakteryjny

Tutaj opisana jest procedura przeprowadzania infekcji ogólnoustrojowej u noworodka szczura za pomocą kultur Escherichia coli K1. Ten nieinwazyjny zabieg pozwala na kolonizację przewodu pokarmowego, translokację patogenu do krążenia ogólnoustrojowego oraz inwazję ośrodkowego układu nerwowego w splocie naczyniówkowym.

Nieinwazyjny model neuropatogennego zakażenia Escherichia coli u nowonarodzonego szczura

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania pojedynczych, zainfekowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego od mysiego modelu infekcji dróg moczowych.

Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek

Tutaj opisujemy prosty i powtarzalny protokół mysiego modelu infekcji do oceny osłabienia genetycznie zmodyfikowanych szczepów Pseudomonas aeruginosa w porównaniu z zatwierdzonymi przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) Escherichia coli do zastosowań komercyjnych.

Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Protokół ten opisuje niezbędne kroki kolonizacji myszy z pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych, a także nieinwazyjne metody walidacji kolonizacji i oceny ekspansji pks+ E. coli w kału.

Kolonizacja przez myszą pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych

Poznaj niezawodną metodę izolacji RNA z Pseudomonas aeruginosa z mysich jelit cienkich. Technika zapewnia wysoką jakość materiału do analiz qPCR, profilowania transkrypcyjnego i sekwencjonowania RNA.

Izolacja RNA z Pseudomonas aeruginosa kolonizującej przewód pokarmowy myszy

Przeglądaj więcej filmów