Izolacja RNA z Pseudomonas aeruginosa kolonizującej przewód pokarmowy myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie całkowitego RNA Pseudomonas aerogen odzyskanego z mysich ECM. Osiąga się to najpierw poprzez pobranie zawartości światła jelita końcowego, a następnie poprzez izolację RNA bakteryjnego.

Następnie przeprowadzono obróbkę D'S oraz oczyszczanie RNA. Na koniec określono ilość RNA i sprawdzono czystość izolatu za pomocą bioanalizatora oraz analizy spektrofotometrycznej. W rezultacie uzyskano bakteryjne RNA o odpowiedniej jakości i ilości, które może zostać poddane dalszej ocenie eksperymentalnej, na przykład za pomocą QPCR, analizy, profilowania transkrypcyjnego lub eksperymentów z sekwencjonowaniem RNA.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekstrakcja triolowa, jest fakt, że metoda ta obejmuje wielokrotne etapy lizy w bardzo rygorystycznym środowisku kwasowym oraz etapy ekstrakcji chloroformem, co zapewnia wysoką jakość RNA. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy lizy i ekstrakcji są trudne do opanowania, a protokoły pisemne pomijają drobne szczegóły, które są krytyczne dla sukcesu. Procedurę zaprezentują Eduardo Lopez Medina, stażysta postdoctoralny, oraz Megan Neubauer, kierownik laboratorium, oboje z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem zbioru IMSA czyści moździerz ze stali nierdzewnej w kąpieli z ciekłego azotu.

Następnie, po euthanazji sześciu- lub ośmiotygodniowej myszy szczepu C3 HHEN skolonizowanej przez Pseudomonas aerogen, należy umieścić zwierzę w pozycji grzbietnej na styropianowej płytce i spryskać brzuch 95% etanolem. Następnie należy wykonać podłużne nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry od mostka do krocza. Po tym odsunąć skórę oraz otrzewną, aby odsłonić jamę brzuszną.

Następnie wyciąć całe ślepe jelito za pomocą pincety. Przytrzymać ślepe jelito nad moździerzem ze stali nierdzewnej, a następnie odciąć oba jego końce nożyczkami do sekcji. Napełnić końcówkę pipety P 1000 jednym mililitrem buforu sequel flush eight, a następnie wprowadzić końcówkę do proksymalnego końca ślepego jelita.

Wypłucz zawartość buforu Sequel Flush Eight oraz zawartość światową Sequel do stalowego moździerza. Następnie rozetrzyj zawartość Sequel Flush Eight za pomocą sterylnego tłuczka.

Następnie wlej etanol do pojemnika z suchym lodem i umieść 50 mililitrową stożkowatą probówkę polipropylenową w kąpieli z etanolu i suchego lodu. Przenieś zmieloną mrożoną zawartość światła jelita do probówki stożkowej i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Kolejna seria kroków jest najtrudniejszą częścią procedury.

Ze względu na złożony charakter materiałów pobieranych z kątnicy MI, wielokrotne ekstrakcje na zimno za pomocą fiofilu są absolutnie niezbędne w celu uzyskania odpowiedniej jakości i integralności; może być wymagane od trzech do pięciu ekstrakcji, zanim zostanie wyeliminowana szeroka granica między fazą wodną a organiczną. Przenieś jedną objętość fenolu kwasowego z chloroformem do 50 ml probówki wirówkowej Oak Ridge. Zabezpiecz zakrętkę parafinią, a następnie ogrzej probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C.

Do 50 mililitrowej stożkowej probówki z polipropylenu należy wlać połowę objętości buforu do lizy, a następnie gotować bufor przez pięć minut. Po wyjęciu zawartości luminalnej sekweli z przechowywania w temperaturze minus 80 °C, krótko ogrzać probówkę, energicznie pocierając ją w dłoniach, a następnie dodać do probówki gotujący się bufor do lizy. Wstrząsnąć mieszaniną, aby zhomogenizować roztwór zawartości luminalnej SQL w buforze do lizy.

Gotować bufor do lizy oraz zawartość SQL luminal przez pięć minut. Po okresowym wirowaniu w vortexie otworzyć probówkę wirówkową Oak Ridge zawierającą roztwór fenol-chloroformu i przenieść próbkę lizy z zawartością SQL do probówki. Następnie ponownie zamknąć zakrętkę za pomocą profilu i umieścić probówkę z powrotem w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C na 10 minut, wstrząsając probówką co dwie minuty.

Przemyj próbkę przy 2 500 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej probówki wirówkowej Oak Ridge o pojemności 50 ml, unikając pobrania białej warstwy przejściowej. Następnie dodaj do nowej probówki równą objętość kwasowego fenolo-chloroformu.

Uszczelnić zakrętkę za pomocą Parafilmu i dokładnie wymieszać zawartość, wirując probówkę na vortexie z dużą prędkością. Kontynuować wirowanie próbki i przenieść fazę wodną do probówki wirówkowej. Jeśli objętość górnej fazy wodnej stanie się zbyt mała, można ją przenieść do probówki o mniejszej średnicy.

Kontynuuj ten proces, aż biała granica między fazą wodną a organiczną przestanie być widoczna. Po całkowitym zniknięciu białej granicy ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej probówki do wirowania. Następnie dodaj do probówki taką samą objętość mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego, szczelnie zamknij nakrętkę i dokładnie wymieszaj zawartość za pomocą vortexera.

Następnie, po ponownym odwirowaniu próbki, przenieś fazę wodną do 15 mililitrowej stożkowej probówki polipropylenowej i dodaj równą objętość izopropanolu. Następnie inkubuj roztwór w temperaturze -20 °C przez co najmniej dwie godziny lub przez noc. Po inkubacji próbki odwiruj probówkę przez 45 minut.

Po zidentyfikowaniu żelowatego osadu na dnie probówki, usuń supernatant. Następnie przemyj osad jednym mililitrem lodowatego, 70% etanolu, mieszając probówkę w wstrząsarzu typu vortex, a następnie odwirowuj próbkę przy 10 000 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na koniec usuń supernatant i odwróć probówkę, aby osad wysuszył się na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie resuspenduj osad RNA w 200 µL wody wolnej od RNA. Najpierw dodaj do probówki do wirówki 20 µL 10x buforu turbo DNA oraz 2 µL turbo DNA i delikatnie wymieszaj roztwór. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut, po czym dodaj do probówki 20 µL resuspendowanego odczynnika do inaktywacji DNA i dokładnie wymieszaj.

Następnie inkubuj probówkę przez kolejne pięć minut w temperaturze pokojowej, sporadycznie mieszając zawartość. Potem zwirowuj osad w mikrocentryfużce z prędkością 10,000 ×g przez 1,5 minuty, a następnie przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfużki. Do osadu dodaj jedną objętość zimnego kwasowego fenolu z chloroformem, a następnie dokładnie wymieszaj roztwór, wirując go na wortexie przez jedną minutę.

Po wirowaniu roztworu przez dwie minuty przy 12 500 ×g, przenieś fazę wodną do nowej probówki i dodaj jedną objętość chloroformu z alkoholem izoamylowym. Następnie wymieszaj roztwór za pomocą wortexa i ponownie odwiruj go w tych samych warunkach. Przenieś fazę wodną do nowej probówki do mikrocentryfugi.

Następnie dodać 0,1 objętości trzy molowego octanu sodu oraz 2,5 objętości lodowatego, 100% etanolu. Wymieszać zawartość probówki za pomocą wortexa. Inkubować próbkę w temperaturze -80 °C przez 30 minut.

Następnie, po wirowaniu przy 12 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4°C, należy usunąć nadnadkład. Na koniec przemyć osad 1 ml lodowatego 70% etanolu. Usunąć nadnadkład i pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.

Następnie przesuspenduj osad w 100 µL wody wolnej od RNaz. Agilent Bioanalyzer to platforma oparta na mikrofluidyce służąca do określania wielkości, ilościowego oznaczania oraz kontroli jakości DNA, RNA, białek i komórek, która wykorzystuje wskaźnik integralności RNA znany jako RNA integrity number lub RIN. RNA wyekstrahowane zgodnie z tym protokołem wykazuje stosunki 260 do 280 w zakresie od 1,7 do 2,0 oraz wartości RIN większe lub równe 7,0.

Po lewej stronie przedstawiono przykład elektroferogramu bakteryjnego RNA wykonanego za pomocą bioanalizatora Agilent, a po prawej obraz przypominający żel dla Pseudomonas arosa wyizolowanej z zawartości mysich SQL. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowe PCR lub sekwencjonowanie RNA, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. w zakresie precyzyjnego profilowania ekspresji genów.