Name: Śledzenie pełzania śródświetlnego neutrofili, migracji śródbłonkowej i chemotaksji w tkance za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Poznaj metodę przyżyciowej mikroskopii śródświetlnej do badania pełzania neutrofili, migracji śródbłonkowej i chemotaksji w tkance mięśnia kremasterowego myszy. Ta technika pozwala wizualizować dynamiczne interakcje leukocytów z komórkami śródbłonkowymi w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant badawczy z Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). L. Liu jest laureatem nagrody CIHR New Investigator Award (MSH-95374).

1. Przygotowanie chemoatraktanta w żelu agarozowym
<ol>
<li>Do probówki stożkowej o pojemności 50 mL odpipetować 10 mL 2×PBS, a następnie ogrzać probówkę, umieszczając ją w zlewce z gorącą wodą.</li>
<li>Do drugiej probówki stożkowej o pojemności 50 mL (z lekko poluzowaną zakrętką) odpipetować 10 mL wody destylowanej i dodać 0,4 g proszku agarozy, a następnie podgrzewać mieszaninę w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia (ok. 1 min w kuchence o mocy 70 W).</li>
<li>Dodać ogrzany 2×PBS do probówki z roztworem agarozy, wymieszać roztwór przez delikatne potrząsanie i utrzymać go w cieple w zlewce z gorącą wodą.</li>
<li>Do pokrywki probówki Eppendorf o pojemności 1,5 mL zawierającej 3 µl tuszu chińskiego odpipetować mikrodozownikiem roztwór chemoatraktanta (np. 10 µl 0,5 µg chemokiny CXC MIP-2 lub 12 µl 1 mM WKYMVm) i dokładnie wymieszać poprzez aspirację mikrodozownikiem (unikając powstania pęcherzyków powietrza).</li>
<li>Odciąć końcówkę końcówki do pipety o pojemności 20 µl i odpipetować 10 µl roztworu agarozy (42°C) do pokrywki, a następnie niezwłocznie dokładnie wymieszać inną końcówką do pipety (unikając powstania pęcherzyków powietrza).</li>
<li>Przechowywać żel zawierający chemoatraktant w temperaturze +4°C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mięśnia kremaster do mikroskopii przyżyciowej (Rysunek 1)
<ol>
<li>Zanieść dorosłego samca myszy poprzez wstrzyknięcie do.p. mieszaniny 10 mg/kg ksylazyny i 20 mg/kg chlorowodorku ketaminy.</li>
<li>Ogolić maszynką elektryczną obszar nad prawą żyłą jagłyczną zewnętrzną oraz przednią część moszny. Po znieczuleniu należy poświęcić szczególną uwagę i opiekę znieczulonej myszy. W celu zapobiegania hipotermii myszy można zastosować lampę grzewczą. Mysz nie powinna wykazywać odruchów bólowych.
</li>
<li>Wyciąć nacięcie poziome, odnaleźć i cewnikować żyłę jagłyczną, używając rurki PE-10 wypełnionej solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 10 U/mL. Cewnikowanie żyły jagłycznej jest niezbędne do podawania dodatkowych środków znieczulających i leków w razie potrzeby.</li>
<li>Unieruchomić tylne kończyny myszy taśmą pępkową, kładąc mysz na plecach na własnoręcznie wykonanej desce do badania mięśnia opuszkowatego (Rysunek 1).
</li>
<li>Podłączyć deskę do cyrkulatora wody o temperaturze 37°C, aby utrzymać ciepłotę mięśnia opuszkowatego i ciała myszy.</li>
</ol>

Uwaga: Wszystkie procedury od 2.6 do 2.14 muszą być wykonywane bardzo delikatnie5.

<ol start="6">
<li>Wykonaj nacięcie skóry mosznicy, aby odsłonić lewy mięsień opuszkowy. Ostrożnie oddziel mięsień od powiązana z nim powięzi.
</li>
<li>Przepłucz mięsień opuszkowy roztworem soli fizjologicznej z buforem wodorowęglanowym podgrzanym do 37°C (131.9 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgSO4, 20 NaHCO3, w mM, pH 7.4), używając pompy perystaltycznej.
</li>
<li>Przywiąż szew 4−0 do dystalnego końca mięśnia opuszkowego, aby przymocować go do przezroczystej szklanej podstawy deski do mięśnia opuszkowego.
</li>
<li>Wypal mięsień opuszkowy wzdłużnie. Za pomocą szwu 4–0 rozprostuj mięsień i przymocuj go wzdłuż krawędzi do podstawy. Oddziel jądro i najduszkę od leżącego pod nimi mięśnia i przesuń je do jamy brzusznej.
</li>
<li>Przepłukuj mięsień z prędkością ~0.6 ml/min podgrzanym do 37°C buforem perfuzyjnym i przykryj odsłonięty mięsień szklanym krawędzią o wymiarach 2×2 mm.
</li>
<li>Umieść deskę do mięśnia opuszkowego na stoliku mikroskopu, obejrzyj mięsień pod mikroskopem, znajdź odpowiednią żyłkę pocapilarną (wybierz żyłkę prostą, nierozgałęzioną, o prawidłowej szybkości ścinania i średnicy w zakresie 25−40 µm) i ustaw kamerę wideo tak, aby żyłka była widoczna w pozycji pionowej po lewej lub prawej stronie monitora TV.
</li>
<li>Po 30 min wyrównania zarejestruj za pomocą rejestratora wideo obrazy wybranej żyłki pocapilarnej przez 5 min jako dane kontrolne wyjściowe.
</li>
<li>Zatrzymaj perfuzję i zdejmij szkiełko nakrywkowe z mięśnia.
</li>
<li>Umieść żel zawierający chemoatraktant o objętości ~1-mm3 na powierzchni mięśnia opuszkowego w wcześniej wybranym obszarze, 350 µm od obserwowanej żyłki pocapilarnej i równolegle do niej; nałóż szkiełko nakrywkowe, aby utrzymać żel na miejscu, i przepłukuj tkankę mięśniową z bardzo małą prędkością (≤10 µl/min), aby umożliwić utworzenie gradientu chemoatraktantu, który jest powoli uwalniany i formowany z żelu.
</li>
<li>Rejestruj obraz wideo przez 90 min po dodaniu żelu zawierającego chemoatraktant. Podczas nagrywania dostosuj i utrzymuj ostrość mikroskopu na leukocytach przylegających, pełzających, transmigrujących i wykazujących chemotaksję wewnątrz żyłki oraz w tkance mięśniowej.
</li>
<li>Po zakończeniu eksperymentu zaimportuj plik wideo do komputera w celu analizy.
</li>
</ol>

3. Śledzenie komórek przy użyciu programu ImageJ
<ol><li>Na komputerze wyekstrahuj i przekonwertuj wideo do formatu AVI (np. użyj bezpłatnego oprogramowania komputerowego bitRipper, aby przekonwertować wideo z DVD do pliku AVI).</li>
<li>Użyj oprogramowania do edycji wideo, aby wygenerować film z przyspieszeniem czasu. Na przykład użyj Windows Movie Maker, aby stworzyć film time-lapse (z przyspieszeniem 1/512 lub 1/1024 przy częstotliwości 30-fps) z oryginalnego wideo w czasie rzeczywistym. Przekonwertuj i zapisz nieskompresowany film time-lapse w formacie DV-AVI.</li>
<li>Nagraj obrazy mikrometru kalibracyjnego przy tych samych ustawieniach mikroskopu, zaimportuj obrazy do komputera i otwórz je w programie ImageJ. W programie ImageJ całkowita liczba pikseli wyświetla się w lewym górnym rogu ekranu (np. 720×480 pikseli). Zmierz rozmiar ekranu w obu osiach X i Y (np. 20×150 µm). Na tej podstawie oblicz liczbę pikseli na µm (np. x = 720/20 = 3,6 pikseli/µm oraz y = 480/150 = 3,2 pikseli/µm).
</li>
<li>Aby zaimportować film, otwórz ponownie ImageJ, kliknij „File−Import−Using Quicktime Movies Plug-in”, wybierz film do analizy i kliknij „OK” w interfejsie „QT Movie Opener”.
</li>
<li>Kliknij „Plugins−Manual Tracking”, aby śledzić komórki. Przed rozpoczęciem śledzenia wprowadź odpowiednie informacje w polach na dole. W skrócie:
<ol>
<li>Interwał czasowy (w sek) = stopień przyspieszenia-time-lapse/30 (na przykład dla przyspieszenia 1020× interwał wyniósłby 1020/30 = 34 sek/klatkę).
</li>
<li>Kalibracja x/y = pomiar µm/piksel uzyskany z kalibracji obrazu mikrometru.
</li>
<li>Kalibracja z = 0 (ponieważ mięsień kremaster myszy jest niezwykle cienką warstwą tkanki, a pełzanie i migracja komórek w warunkach transluminacji w polu jasnym są w przybliżeniu dwuwymiarowe).
</li>
<li>Rozmiar kwadratu wyszukiwania dla centrowania = 1.
</li>
<li>Rozmiar kropki/Szerokość linii/Rozmiar czcionki: mogą zostać dostosowane w razie potrzeby.
</li>
</ol>
</li>
<li>Wybierz stabilny i wyraźny punkt jako punkt odniesienia. Punktem odniesienia może być dowolny wyraźny i mały punkt strukturalny, który pozostaje niezmienny i stabilny przez cały eksperyment. Kliknij „Add Track”, aby śledzić punkt odniesienia od pierwszej do ostatniej klatki, a następnie kliknij „End Track”. Dane pojawią się automatycznie w tabeli wyników.

</li>
<li>Śledź pojedynczo pełzające i migrujące neutrofile: kliknij „Add Track”, aby śledzić komórkę od momentu jej pojawienia się w tkance do momentu zniknięcia w każdej klatce, a następnie kliknij „End Track”, aby zakończyć i zapisać wyniki w programie Microsoft Excel.
</li>
</ol>

4. Analiza parametrów rekrutacji neutrofilów

<ol>
<li>Otwórz plik z wynikami w programie Microsoft Excel i przeanalizuj dane (uwzględnij w analizie zmiany punktu odniesienia).
</li>
<li> Pełzanie wewnątrzświatłowe
<ol>
<li>Dystans pełzania: całkowita odległość, jaką komórka przebywa w świetle naczynia od początkowego miejsca przylegania do optymalnego miejsca transmigracji (µm).
</li>
<li>Prędkość pełzania: dystans pełzania/czas (µm/min).
</li>
</ol>
</li>
<li>Migracja transendotelialna
<ol>
<li>Czas transmigracji: od momentu rozpoczęcia transmigracji komórki przez śródbłonek do czasu, gdy całe ciało komórki znajduje się tuż poza żyłą i w świetle naczynia nie widać już żadnej części ciała komórki (min lub sec).
</li>
<li>Czas odrywania: od momentu, gdy całe ciało komórki znajduje się tuż poza żyłą (bezpośrednio po transmigracji), do punktu czasowego, w którym komórka traci kontakt z żyłą (odciągnięcie ogonka) (min lub sec).
</li>
</ol>
</li>
<li>Chemotaksja w tkance
<ol>
<li>Dystans migracji: suma odległości, jaką komórka przemieszcza się od punktu początkowego do punktu końcowego migracji w tkance (µm).
</li>
<li>Prędkość migracji: dystans migracji w tkance/czas (µm/min).
</li>
<li>Dystans chemotaksji: suma odległości, jaką komórka migruje wzdłuż osi x w tkance (µm).
</li>
<li>Prędkość chemotaksji: dystans chemotaksji/czas (µm/min).
</li>
<li>Indeks chemotaksji: stosunek dystansu chemotaksji do dystansu migracji w tkance.
</li>
</ol>
</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Chociaż mikroskopia witalna w jasnym polu jest stosowana do badania oddziaływań między leukocytami a komórkami śródbłonkowymi i nie musi być specyficzna dla neutrofilów, potwierdziliśmy w badaniach histologicznych, że ponad 95% zrekrutowanych komórek w mięśniach opuszkowych traktowanych chemoatraktantami dla neutrofilów stanowiły rzeczywiście neutrofilie. W niniejszym raporcie, z wykorzystaniem selektywnych chemoatraktantów dla neutrofilów, przedstawiamy procedury śledzenia rekrutacji neutrofilów in vivo. W szczególności opisujemy protokół śledzenia pełzania wewnątrznaczyniowego neutrofilów, ich migracji przezśródbłonkowej oraz chemotaksji w tkance mięśnia opuszkowego u znieczulonych myszy z wykorzystaniem wideo-mikroskopii witalnej time-lapse oraz programu ImageJ. Żel agarozowy zawierający chemoatraktant, nałożony na mięsień opuszkowy, powoli uwalnia substancję, co pozwala na ustanowienie gradientu chemoatraktanta w tkance. Chemoatraktant dla neutrofilów indukuje oddziaływania między neutrofilami a komórkami śródbłonkowymi w żylkach posutylarnych mięśnia opuszkowego u myszy. Cały eksperyment jest wizualizowany za pomocą pionowego mikroskopu witalnego w jasnym polu, a obrazy wideo są przesyłane przez kolorową kamerę wideo na monitor telewizyjny i rejestrowane przez rejestrator wideo. Określiliśmy pełzanie wewnątrznaczyniowe, migrację przezśródbłonkową oraz migrację i chemotaksję neutrofilów w tkance mięśniowej w odpowiedzi na chemoatraktanty dla neutrofilów MIP-2 i WKYMVm przygotowane w żelu agarozowym (Rysunek 2). Stwierdziliśmy, że MIP-2 (w stężeniu 0,5 µM) i WKYMVm (w stężeniu 0,1 mM) wywoływały pełzanie wewnątrznaczyniowe neutrofilów z podobną prędkością, migrację przezśródbłonkową neutrofilów oraz ich odrywanie się od żylki w porównywalnym czasie, a także migrację i chemotaksję neutrofilów w tkance mięśniowej z niemal taką samą prędkością i podobnymi indeksami chemotaksji neutrofilów (P &gt; 0,05, test t Studentowi).
<img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="Schemat układu mikroskopowego z kamerami CCD, pompą, kąpielą wodną i optycznym welocymetrem do analizy mięśni." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny rysunek systemu mikroskopu intravitalnego. Mięsień kremaster myszy zostaje wyeksponowany na przezroczystym podestu obserwacyjnym płytki do mięśnia kremaster na stole mikroskopu i poddany superfuzji za pomocą 37°Cpodgrzany roztwór soli fizjologicznej z buforem wodorowęglanowym. Mikroskop pionowy jest połączony z kolorową kamerą wideo CCD do intravitalnej mikroskopii w polu jasnym. Do portu mikroskopu podłączona jest również monochromatyczna, głęboko chłodzona cyfrowa kamera CCD do intravitalnej mikroskopii fluorescencyjnej, z której obrazy są bezpośrednio przetwarzane przez komputer.
<img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący wpływ MIP-2 i WKYMVm na parametry migracji komórek: prędkość, transmigrację." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Parametry rekrutacji neutrofili w jasnopolowej mikroskopii intravitalnej.
Rekrutację neutrofili indukowano poprzez stopniowe uwalnianie chemoatraktantów dla neutrofili: MIP-2 lub WKYMVm z preparatu żelu agarowego umieszczonego 350 µm przylegające do żyłki poprzypillarnej. Dane z filmów poklatkowych analizowano programem ImageJ po przetworzeniu nagrania wideo z eksperymentu w czasie rzeczywistym. Czas pełzania neutrofili w świetle naczynia (A), czas transmigracji i czas odrywania się (B), prędkość migracji i prędkość chemotaksji w tkance (C) oraz indeks chemotaksji w mięśniu kremaster (D) określono po podaniu żelu agarowego z MIP-2 lub WKYMVm na mięsień kremaster u myszy C57BL/6 (n = 3, liczba śledzonych komórek = odpowiednio 2 (w A i B) i 27 (w C i D) dla MIP-2 oraz 26 (w A i B) i 4 (w C i D) dla WKYMVm).

<ol><li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment%3A+organ-specific+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li>
<li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+leukocyte+recruitment%3A+an+in+vivo+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li>
<li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites%3A+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li>
<li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li>
<li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Portal%3A+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22%5BJournal%5D)">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li>
<li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li>
<li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li>
<li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+accelerates%2C+but+is+not+required+for%2C+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Mikroskopia witalna jest niezbędnym narzędziem do odkrywania komórkowych i molekularnych mechanizmów rekrutacji leukocytów podczas stanu zapalnego. Ilościowa wizualizacja służąca do określenia oddziaływań między leukocytami a komórkami śródbłonka w mikrokrążeniu tkanek półprzezroczystych, takich jak mięsień krezmastyczny i krezka, pozostaje złotym standardem zastosowania tej techniki1,5. Konwencjonalna mikroskopia witalna w polu jasnym posiada wiele unikalnych cech technicznych, a mechanizmy rekrutacji ujawnio...

<table><tbody><tr><td>Przewód polietylenowy, PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td>I.D. 0.28mm &amp;#215; O.D. 0.61mm        </td></tr><tr><td>Tusz indyjski</td><td>Speedball Art</td><td>Super Black</td><td>100% pigmentu sadzy, bez barwników</td></tr><tr><td>Kauteryzator</td><td>Aaron Medical</td><td>AA03</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Mysi rekombinowany MIP-2</td><td>R&amp;amp;D	Systems</td><td>452-M2</td><td></td></tr><tr><td>WKYMVm</td><td>Phoenix Pharmaceuticals, Inc.</td><td>072-12</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td>Ultrapure</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H-3393</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Kolorowa kamera wideo 3CCD</td><td>SONY</td><td>DXC-990</td><td></td></tr><tr><td>Rejestrator wideo HD-DVD</td><td>LG Electronics Inc.</td><td>RH398H-M</td><td></td></tr><tr><td>Monitor TV</td><td>LG Electronics Inc.</td><td>22LG30</td><td></td></tr><tr><td>Cyrkulator wody</td><td>Thermo Scientific</td><td>HAAKE DC10</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson; Pharmacia</td><td>Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka do mięśnia dźwigacza jądra</td><td>University	 of Saskatchewan</td><td></td><td>Własnej konstrukcji</td></tr></tbody></table>

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Rekrutacja krążących leukocytów z krwiobiegu do zapalnej tkanki jest kluczowym i złożonym procesem stanu zapalnego1,2. W żylkach poprzecapilarnych zapalnej tkanki leukocyty początkowo wiążą się i toczą po powierzchni luminalnej ściany żylki. Toczące się leukocyty zatrzymują się na śródbłonku i ulegają silnej adhezji w odpowiedzi na chemokiny lub inne chemoatraktanty obecne na powierzchni żylki. Wiele przylegających leukocytów przemieszcza się z pierwotnego miejsca adhezji do miejsca ekstrawazacji w złączach śródbłonka, co jest procesem nazywanym pełzaniem wewnątrzluminalnym3. Po pełzaniu leukocyty przechodzą przez śródbłonek (transmigracja) i migrują w tkance naczyniowej w stronę źródła chemoatraktanta (chemotaksja)4. Mikroskopia witalna jest potężnym narzędziem do wizualizacji oddziaływań leukocytów z komórkami śródbłonka in vivo oraz odkrywania komórkowych i molekularnych mechanizmów rekrutacji leukocytów2,5. W niniejszym raporcie przedstawiamy szczegółowy opis wykorzystania mikroskopii witalnej w polu jasnym do wizualizacji i określenia szczegółowych procesów rekrutacji neutrofili w mięśniu krestrowym myszy w odpowiedzi na gradient chemoatraktanta neutrofili. Aby wywołać rekrutację neutrofili, niewielki fragment żelu agarozowego (rozmiar ~1-mm3) zawierający chemoatraktant neutrofili MIP-2 (CXCL2, chemokina z rodziny CXC) lub WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, syntetyczny analog peptydu bakteryjnego) jest umieszczany na tkance mięśniowej obok obserwowanej żylki poprzecapilarnej. Przy użyciu fotografii wideo z odstępami czasu (time-lapse) oraz oprogramowania komputerowego ImageJ, wizualizowane i śledzone są pełzanie wewnątrzluminalne neutrofili po śródbłonku, migracja transendotelialna neutrofili oraz migracja i chemotaksja w tkance. Protokół ten umożliwia wiarygodną i ilościową analizę wielu parametrów rekrutacji neutrofili, takich jak prędkość pełzania wewnątrzluminalnego, czas transmigracji, czas odrywania się, prędkość migracji, prędkość chemotaksji oraz indeks chemotaksji w tkance. Wykazujemy, że stosując ten protokół, można stabilnie określić te parametry rekrutacji neutrofili i wygodnie śledzić ruch pojedynczych komórek in vivo.

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Rekrutacja krążących leukocytów z krwiobiegu do zapalnej tkanki jest kluczowym i złożonym procesem zapalenia1,2. W...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie mikroskopii w polu jasnym, mikroskopii intravitalnej oraz wideofotografii time-lapse do badania dynamicznych oddziaływań neutrofili z komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na chemoatraktanty neutrofili in vivo. W niniejszym filmie demonstrujemy procedury wykorzystania intravitalnej wideomikroskopii w polu jasnym w celu wizualizacji i określenia pełzania wewnątrznaczyniowego neutrofili, migracji przez śródbłonek oraz chemotaksji w tkance mięśnia gładkiego u myszy. Rekrutacja leukocytów jest znakiem rozpoznawczym stanu zapalnego.Proces rekrutacji rozpoczyna się, gdy leukocyty w krwiobiegu zaczynają toczyć się po śródbłonku naczyń pocapilarnych w miejscu stanu zapalnego. W odpowiedzi na chemokiny lub inne chemoatraktanty na powierzchni luminalnej, toczące się leukocyty zatrzymują się i silnie przylegają do śródbłonka. Po adhezji wiele leukocytów przemieszcza się po powierzchni luminalnej, sprawiając wrażenie poszukiwania optymalnego miejsca transmigracji.Następnie pełzające leukocyty przemieszczają się po śródbłonku, co jest procesem nazywanym migracją śródbłonkową. Po tym etapie neutrofile migrują w tkance naczyniowej w kierunku źródła chemoatraktanta w miejscu stanu zapalnego, co określa się mianem chemotaksji. Niniejszy film przedstawia eksperyment ukazujący, jak wykorzystać wideo intravitalne w świetle przechodzącym, mikroskopową fotografię poklatkową oraz program ImageJ do wizualizacji, śledzenia i określania pełzania wewnątrznaczyniowego neutrofili, ich migracji śródbłonkowej oraz migracji w procesie chemotaksji w tkance mięśnia gładkiego w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili.Witam, nazywam się Lis Liu z Katedry Farmakologii w College of Medicine na Uniwersytecie Saskatchewan. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wykonać gradient chemotaktyczny neutrofili w żelu agarowym oraz jak przygotować mięsień brzuchy szczura do mikroskopii wewnątrzorganizowej.Jak śledzić ruch komórek przy użyciu MEGJ. I na koniec, jak analizować parametry rekrutacji neutrofili – dwaj doktoranci z naszego laboratorium, ngel Naja, sh oraz Chile, zaprezentują szczegółowe procedury eksperymentalne. Cześć, jestem Naja Sh. Cześć, jestem Chile.Aby rozpocząć eksperyment, należy najpierw przygotować chemoatraktant dla neutrofili w żelu agarowym; pipetuj 10 ml dwukrotnego PBS do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Podgrzej probówkę, umieszczając ją w zlewce z gorącą wodą. Pipetuj 10 ml wody destylowanej.Dodaj 0,4 g proszku agarozowego do kolejnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia, aby przygotować 2% agarozę w PBS. Dodaj ciepły dwukrotny PBS do probówki z roztworem agarozy.Zamieszać roztwór ruchem wirowym i utrzymywać go w cieple w beczce z gorącą wodą. Dokładnie zmieszać roztwór chemoatraktanta z 3 µL tuszu indyjskiego w zakrętce probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas mieszania.Odetnij końcówkę końcówki do pipety 200 µL i mikropipety. Nalej 110 µL roztworu agro w temperaturze 42 °C do pokrywki i natychmiast dokładnie wymieszaj. Używając innej końcówki do pipety, przechowuj ten żel zawierający chemoatraktant w lodówce do momentu użycia. Znieczul dorosłego samca myszy poprzez wstrzyknięcie domięśniowo (IP) mieszaniny ksylazyny i ketaminy.Wygolić obszar nad prawą żyłą szyjną zewnętrzną oraz przednią część moszny. Po znieczuleniu należy użyć golarki elektrycznej, zwracając szczególną uwagę i zachowując ostrożność w obchodzeniu się ze znieczuloną myszą. W celu zapobiegania hipotermii myszy można zastosować lampę grzewczą.Mysz powinna nie wykazywać odruchu bólowego. Wykonaj nacięcie poziome, odnajdź i cewnikuj żyłę szyjną, używając rurki PE 10 wypełnionej solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 100 jednostek na mililitr. Podłącz stół do cyrkulatora wodnego ustawionego na 37 °C, aby utrzymać ciepłotę mięśnia dźwigacza jądra oraz organizmu myszy.Umożliwmy unieruchomienie tylnych kończyn myszy za pomocą taśm pępowinowych, kładąc zwierzę na plecach na desce do preparowania mięśnia kremastra. Wykonaj nacięcie skóry worka mosznawego, aby odsłonić lewy mięsień kremastra. Ostrożnie oddziel mięsień od powiązana z nim powięzi.Przepłucz mięsień dźwigacz jądra w podgrzanym do 37 °C roztworze soli fizjologicznej z buforem wodorowęglanowym. Zawiąż szew 4.0 na dystalnym końcu mięśnia dźwigacza jądra, aby przymocować go do przezroczystego szklanego podłoża na płytce do badania mięśnia dźwigacza jądra. Przetnij mięsień dźwigacz jądra wzdłuż za pomocą kauteryzatora i szwu 4.0.Utrzymaj mięsień płasko i przymocuj go wzdłuż krawędzi do podstawki. Oddziel jądro i najądrze od leżącego pod nimi mięśnia i przesuń je do jamy brzusznej. Nanieś cienką warstwę smaru próżniowego na przeciwległe krawędzie szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 by 22 millimeter.Następnie przykryj odsłonięty mięsień szkiełkiem podstawowym. Umieść płytkę do preparatów mięśniowych na stoliku mikroskopu. Zbadaj mięsień pod mikroskopem i znajdź odpowiednie miejsce w odcinku pocapilarnym.Wybierz naczynie o normalnej szybkości ścinania i średnicy od 25 do 40 µm. Dostosuj kamerę wideo tak, aby naczynie było widoczne w pozycji pionowej po prawej lub lewej stronie monitora telewizyjnego. Po 30 minutach zarejestruj obrazy wideo z wybranego naczynia poprodukcyjnego jako dane kontrolne bazowe, korzystając z urządzenia do nagrywania wideo, np. rejestratora DVD.Są to obrazy wideo kontrolne stanu wyjściowego naczynia zakapilarnego. Przed nałożeniem żelu zawierającego chemoatraktant na powierzchnię mięśnia kremaster, należy zatrzymać superfuzję i usunąć szklaną lamellkę. Z pokrywki probówki typu Eppendorf wyciąć fragment żelu zawierającego chemoatraktant o rozmiarze 1 mm³. Używając ściętego końca końcówki do pipety 200 µL, umieścić wycięty żel z chemoatraktantem na powierzchni mięśnia kremaster w wcześniej wyznaczonym obszarze, 350 µm od obserwowanego naczynia zakapilarnego.Nałóż szkiełko podstawowe, aby ustabilizować żel, a następnie przeprowadź superfuzję tkanki mięśniowej z bardzo małą prędkością, mniejszą lub równą 10 µL na minutę, aby umożliwić utworzenie gradientu chemoatraktanta, który jest powoli uwalniany z żelu. Rejestruj obraz wideo przez 90 minut po dodaniu żelu zawierającego chemoatraktant. W trakcie nagrywania reguluj i utrzymuj ostrość mikroskopu na leukocytach przylegających, pełzających, transmigrujących i wykazujących chemotaksję wewnątrz naczynia oraz w tkance mięśniowej.Po zakończeniu eksperymentu zaimportuj plik wideo do komputera. W celu przeprowadzenia analizy komputerowej wyodrębnij i przekonwertuj wideo do formatu AVI. Na przykład można użyć bezpłatnego oprogramowania BitRipper, aby przekonwertować wideo z płyty DVD do pliku AVI.Użyj oprogramowania do edycji wideo, na przykład Windows Movie Maker, aby utworzyć film w technice poklatkowej (time-lapse) z oryginalnego materiału wideo w czasie rzeczywistym, a następnie przekonwertuj i zapisz film poklatkowy w formacie DV A VI. zarejestruj obrazy mikrometru kalibracyjnego przy tych samych ustawieniach mikroskopu. Zaimportuj obrazy do komputera.Otwórz obrazy w programie ImageJ. Zmierz rozmiar pola widzenia w osiach X i Y, a następnie oblicz liczbę pikseli na mikrometr. Aby zaimportować film, otwórz program ImageJ. Ponownie kliknij plik, import, korzystając z wtyczki QuickTime movies, wybierz film do analizy i zatwierdź przyciskiem OK w interfejsie otwierania filmów QT, a następnie kliknij wtyczki. W celu śledzenia komórek wybierz Manual tracking; przed rozpoczęciem śledzenia wprowadź odpowiednie informacje w polach na dole ekranu. Przed rozpoczęciem śledzenia należy określić następujące parametry czasu.Interwał w sekundach to całkowity czas upływu podzielony przez 30; kalibracja xy to pomiar mikrometrów na piksel wynikający z kalibracji obrazu mikrometru; kalibracja Z jest ustawiona na zero; rozmiar kwadratu wyszukiwania dla centrowania wynosi jeden. W nagranym materiale wideo należy wybrać stabilny i wyraźny punkt jako punkt odniesienia. Punkt odniesienia ten może być dowolnym wyraźnym i małym elementem strukturalnym, który pozostaje niezmienny i stabilny przez cały czas trwania eksperymentu.Kliknij „add track”, aby śledzić punkt odniesienia od pierwszej do ostatniej klatki. Następnie kliknij i śledź po kolei pełzające i migrujące neutrofile. Kliknij „add track”, aby śledzić komórkę od momentu jej pojawienia się w tkance aż do jej zniknięcia w każdej klatce.Następnie kliknij i śledź, aby zakończyć pomiar i zapisać wyniki w programie Microsoft Excel. Otwórz plik z wynikami w programie Microsoft Excel. Rozpocznij analizę danych.Ważne jest uwzględnienie ruchów punktu odniesienia w analizie. Podczas śledzenia pełzania neutrofili i przestrzeni świetlnej wyznaczamy dystans oraz prędkość pełzania neutrofili i przestrzeni świetlnej. Podczas analizy transendotelialnej migracji neutrofili mierzymy czas transmigracji neutrofili oraz czas odrywania się.Podczas określania chemotaksji neutrofili w tkance mięśnia gładkiego mierzymy dystans i prędkość migracji oraz chemotaksji neutrofili w mięśniu, a także wyznaczamy indeks chemotaksji podczas chemotaksji neutrofili w tkance mięśniowej. Definicje tych parametrów wyświetlone na ekranie zostały szczegółowo opisane w naszym protokole pisemnym. W tym eksperymencie prezentujemy procedury wykorzystania mikroskopii intravitalnej w świetle przechodzącym do wizualizacji i określania pełzania wewnątrznaczyniowego neutrofili, ich migracji przez śródbłonek oraz migracji w procesie chemotaksji.W odpowiedzi na chemoatraktanty neutrofili in vivo, zastosowaliśmy MIP-2, CXCL2 lub syntetyczny peptyd W-K-Y-M-V-M w formie agarowego żelu, aby wywołać rekrutację neutrofili w tkance mięśnia CMA myszy. Jak widać na tej rycinie, MIP-2 w stężeniu 0.5 µM oraz W-K-Y-M-V-M w stężeniu 0.1 mM wywołały pełzanie wewnątrzświatłowe neutrofili z podobnymi prędkościami. Migracja transendotelialna neutrofili oraz ich odrywanie się od ściany naczynia były porównywalne pod względem czasu trwania.Te dwa chemoatraktanty indukowały również migrację i chemotaksję neutrofili w tkance mięśniowej z niemal taką samą prędkością i podobnymi indeksami chemotaksji neutrofili. Mikroskopia intravitalna jest cennym narzędziem do bezpośredniej obserwacji procesu rekrutacji neutrofili oraz do ilościowego określania funkcji komórek i cząsteczek na każdym etapie rekrutacji. Dzięki zastosowaniu fotografii wideo time-lapse oraz programu Image J, pełzanie wewnątrzświatłowe, migrację przez śródbłonek oraz migrację w chemotaksji leukocytów i tkanek można mierzyć za pomocą intravitalnej mikroskopii w polu jasnym z wykorzystaniem selektywnych inhibitorów, myszy transgenicznych oraz selektywnych chemoatraktantów.System ten może pomóc w wyjaśnieniu funkcji konkretnych białek w rekrutacji leukocytów.

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Rejestracja pełzania neutrofili wewnątrz światła naczyń krwionośnych, migracji przez śródbłonek i chemotaksji w tkankach za pomocą mikroskopii wideo intravitalnej

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Ten obecny protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery, znakowanie in vivo i techniki obrazowania przyżyciowego, aby umożliwić monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.

Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Obrazowanie stawów in vivo to cenna technika wykrywająca migracyjne zachowania leukocytów oraz dynamikę molekularną w obrębie zapalonych stawów. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół obrazowania stawów in vivo z wykorzystaniem modelu myszego zapalenia stawów wywołanego kolagenem II (CIA).

In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

Poznaj metodę przyżyciowej mikroskopii śródświetlnej do badania pełzania neutrofili, migracji śródbłonkowej i chemotaksji w tkance mięśnia kremasterowego myszy. Ta technika pozwala wizualizować dynamiczne interakcje leukocytów z komórkami śródbłonkowymi w czasie rzeczywistym.

Śledzenie pełzania śródświetlnego neutrofili, migracji śródbłonkowej i chemotaksji w tkance za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo (Wideo) | JoVE Journal

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Przeglądaj więcej filmów