Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie mikroskopii w polu jasnym, mikroskopii intravitalnej oraz wideofotografii time-lapse do badania dynamicznych oddziaływań neutrofili z komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na chemoatraktanty neutrofili in vivo. W niniejszym filmie demonstrujemy procedury wykorzystania intravitalnej wideomikroskopii w polu jasnym w celu wizualizacji i określenia pełzania wewnątrznaczyniowego neutrofili, migracji przez śródbłonek oraz chemotaksji w tkance mięśnia gładkiego u myszy. Rekrutacja leukocytów jest znakiem rozpoznawczym stanu zapalnego.

Proces rekrutacji rozpoczyna się, gdy leukocyty w krwiobiegu zaczynają toczyć się po śródbłonku naczyń pocapilarnych w miejscu stanu zapalnego. W odpowiedzi na chemokiny lub inne chemoatraktanty na powierzchni luminalnej, toczące się leukocyty zatrzymują się i silnie przylegają do śródbłonka. Po adhezji wiele leukocytów przemieszcza się po powierzchni luminalnej, sprawiając wrażenie poszukiwania optymalnego miejsca transmigracji.

Następnie pełzające leukocyty przemieszczają się po śródbłonku, co jest procesem nazywanym migracją śródbłonkową. Po tym etapie neutrofile migrują w tkance naczyniowej w kierunku źródła chemoatraktanta w miejscu stanu zapalnego, co określa się mianem chemotaksji. Niniejszy film przedstawia eksperyment ukazujący, jak wykorzystać wideo intravitalne w świetle przechodzącym, mikroskopową fotografię poklatkową oraz program ImageJ do wizualizacji, śledzenia i określania pełzania wewnątrznaczyniowego neutrofili, ich migracji śródbłonkowej oraz migracji w procesie chemotaksji w tkance mięśnia gładkiego w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili.

Witam, nazywam się Lis Liu z Katedry Farmakologii w College of Medicine na Uniwersytecie Saskatchewan. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wykonać gradient chemotaktyczny neutrofili w żelu agarowym oraz jak przygotować mięsień brzuchy szczura do mikroskopii wewnątrzorganizowej.

Jak śledzić ruch komórek przy użyciu MEGJ. I na koniec, jak analizować parametry rekrutacji neutrofili – dwaj doktoranci z naszego laboratorium, ngel Naja, sh oraz Chile, zaprezentują szczegółowe procedury eksperymentalne. Cześć, jestem Naja Sh. Cześć, jestem Chile.

Aby rozpocząć eksperyment, należy najpierw przygotować chemoatraktant dla neutrofili w żelu agarowym; pipetuj 10 ml dwukrotnego PBS do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Podgrzej probówkę, umieszczając ją w zlewce z gorącą wodą. Pipetuj 10 ml wody destylowanej.

Dodaj 0,4 g proszku agarozowego do kolejnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej do momentu wrzenia, aby przygotować 2% agarozę w PBS. Dodaj ciepły dwukrotny PBS do probówki z roztworem agarozy.

Zamieszać roztwór ruchem wirowym i utrzymywać go w cieple w beczce z gorącą wodą. Dokładnie zmieszać roztwór chemoatraktanta z 3 µL tuszu indyjskiego w zakrętce probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza podczas mieszania.

Odetnij końcówkę końcówki do pipety 200 µL i mikropipety. Nalej 110 µL roztworu agro w temperaturze 42 °C do pokrywki i natychmiast dokładnie wymieszaj. Używając innej końcówki do pipety, przechowuj ten żel zawierający chemoatraktant w lodówce do momentu użycia. Znieczul dorosłego samca myszy poprzez wstrzyknięcie domięśniowo (IP) mieszaniny ksylazyny i ketaminy.

Wygolić obszar nad prawą żyłą szyjną zewnętrzną oraz przednią część moszny. Po znieczuleniu należy użyć golarki elektrycznej, zwracając szczególną uwagę i zachowując ostrożność w obchodzeniu się ze znieczuloną myszą. W celu zapobiegania hipotermii myszy można zastosować lampę grzewczą.

Mysz powinna nie wykazywać odruchu bólowego. Wykonaj nacięcie poziome, odnajdź i cewnikuj żyłę szyjną, używając rurki PE 10 wypełnionej solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 100 jednostek na mililitr. Podłącz stół do cyrkulatora wodnego ustawionego na 37 °C, aby utrzymać ciepłotę mięśnia dźwigacza jądra oraz organizmu myszy.

Umożliwmy unieruchomienie tylnych kończyn myszy za pomocą taśm pępowinowych, kładąc zwierzę na plecach na desce do preparowania mięśnia kremastra. Wykonaj nacięcie skóry worka mosznawego, aby odsłonić lewy mięsień kremastra. Ostrożnie oddziel mięsień od powiązana z nim powięzi.

Przepłucz mięsień dźwigacz jądra w podgrzanym do 37 °C roztworze soli fizjologicznej z buforem wodorowęglanowym. Zawiąż szew 4.0 na dystalnym końcu mięśnia dźwigacza jądra, aby przymocować go do przezroczystego szklanego podłoża na płytce do badania mięśnia dźwigacza jądra. Przetnij mięsień dźwigacz jądra wzdłuż za pomocą kauteryzatora i szwu 4.0.

Utrzymaj mięsień płasko i przymocuj go wzdłuż krawędzi do podstawki. Oddziel jądro i najądrze od leżącego pod nimi mięśnia i przesuń je do jamy brzusznej. Nanieś cienką warstwę smaru próżniowego na przeciwległe krawędzie szkiełka nakrywkowego o wymiarach 22 by 22 millimeter.

Następnie przykryj odsłonięty mięsień szkiełkiem podstawowym. Umieść płytkę do preparatów mięśniowych na stoliku mikroskopu. Zbadaj mięsień pod mikroskopem i znajdź odpowiednie miejsce w odcinku pocapilarnym.

Wybierz naczynie o normalnej szybkości ścinania i średnicy od 25 do 40 µm. Dostosuj kamerę wideo tak, aby naczynie było widoczne w pozycji pionowej po prawej lub lewej stronie monitora telewizyjnego. Po 30 minutach zarejestruj obrazy wideo z wybranego naczynia poprodukcyjnego jako dane kontrolne bazowe, korzystając z urządzenia do nagrywania wideo, np. rejestratora DVD.

Są to obrazy wideo kontrolne stanu wyjściowego naczynia zakapilarnego. Przed nałożeniem żelu zawierającego chemoatraktant na powierzchnię mięśnia kremaster, należy zatrzymać superfuzję i usunąć szklaną lamellkę. Z pokrywki probówki typu Eppendorf wyciąć fragment żelu zawierającego chemoatraktant o rozmiarze 1 mm³. Używając ściętego końca końcówki do pipety 200 µL, umieścić wycięty żel z chemoatraktantem na powierzchni mięśnia kremaster w wcześniej wyznaczonym obszarze, 350 µm od obserwowanego naczynia zakapilarnego.

Nałóż szkiełko podstawowe, aby ustabilizować żel, a następnie przeprowadź superfuzję tkanki mięśniowej z bardzo małą prędkością, mniejszą lub równą 10 µL na minutę, aby umożliwić utworzenie gradientu chemoatraktanta, który jest powoli uwalniany z żelu. Rejestruj obraz wideo przez 90 minut po dodaniu żelu zawierającego chemoatraktant. W trakcie nagrywania reguluj i utrzymuj ostrość mikroskopu na leukocytach przylegających, pełzających, transmigrujących i wykazujących chemotaksję wewnątrz naczynia oraz w tkance mięśniowej.

Po zakończeniu eksperymentu zaimportuj plik wideo do komputera. W celu przeprowadzenia analizy komputerowej wyodrębnij i przekonwertuj wideo do formatu AVI. Na przykład można użyć bezpłatnego oprogramowania BitRipper, aby przekonwertować wideo z płyty DVD do pliku AVI.

Użyj oprogramowania do edycji wideo, na przykład Windows Movie Maker, aby utworzyć film w technice poklatkowej (time-lapse) z oryginalnego materiału wideo w czasie rzeczywistym, a następnie przekonwertuj i zapisz film poklatkowy w formacie DV A VI. zarejestruj obrazy mikrometru kalibracyjnego przy tych samych ustawieniach mikroskopu. Zaimportuj obrazy do komputera.

Otwórz obrazy w programie ImageJ. Zmierz rozmiar pola widzenia w osiach X i Y, a następnie oblicz liczbę pikseli na mikrometr. Aby zaimportować film, otwórz program ImageJ. Ponownie kliknij plik, import, korzystając z wtyczki QuickTime movies, wybierz film do analizy i zatwierdź przyciskiem OK w interfejsie otwierania filmów QT, a następnie kliknij wtyczki. W celu śledzenia komórek wybierz Manual tracking; przed rozpoczęciem śledzenia wprowadź odpowiednie informacje w polach na dole ekranu. Przed rozpoczęciem śledzenia należy określić następujące parametry czasu.

Interwał w sekundach to całkowity czas upływu podzielony przez 30; kalibracja xy to pomiar mikrometrów na piksel wynikający z kalibracji obrazu mikrometru; kalibracja Z jest ustawiona na zero; rozmiar kwadratu wyszukiwania dla centrowania wynosi jeden. W nagranym materiale wideo należy wybrać stabilny i wyraźny punkt jako punkt odniesienia. Punkt odniesienia ten może być dowolnym wyraźnym i małym elementem strukturalnym, który pozostaje niezmienny i stabilny przez cały czas trwania eksperymentu.

Kliknij „add track”, aby śledzić punkt odniesienia od pierwszej do ostatniej klatki. Następnie kliknij i śledź po kolei pełzające i migrujące neutrofile. Kliknij „add track”, aby śledzić komórkę od momentu jej pojawienia się w tkance aż do jej zniknięcia w każdej klatce.

Następnie kliknij i śledź, aby zakończyć pomiar i zapisać wyniki w programie Microsoft Excel. Otwórz plik z wynikami w programie Microsoft Excel. Rozpocznij analizę danych.

Ważne jest uwzględnienie ruchów punktu odniesienia w analizie. Podczas śledzenia pełzania neutrofili i przestrzeni świetlnej wyznaczamy dystans oraz prędkość pełzania neutrofili i przestrzeni świetlnej. Podczas analizy transendotelialnej migracji neutrofili mierzymy czas transmigracji neutrofili oraz czas odrywania się.

Podczas określania chemotaksji neutrofili w tkance mięśnia gładkiego mierzymy dystans i prędkość migracji oraz chemotaksji neutrofili w mięśniu, a także wyznaczamy indeks chemotaksji podczas chemotaksji neutrofili w tkance mięśniowej. Definicje tych parametrów wyświetlone na ekranie zostały szczegółowo opisane w naszym protokole pisemnym. W tym eksperymencie prezentujemy procedury wykorzystania mikroskopii intravitalnej w świetle przechodzącym do wizualizacji i określania pełzania wewnątrznaczyniowego neutrofili, ich migracji przez śródbłonek oraz migracji w procesie chemotaksji.

W odpowiedzi na chemoatraktanty neutrofili in vivo, zastosowaliśmy MIP-2, CXCL2 lub syntetyczny peptyd W-K-Y-M-V-M w formie agarowego żelu, aby wywołać rekrutację neutrofili w tkance mięśnia CMA myszy. Jak widać na tej rycinie, MIP-2 w stężeniu 0.5 µM oraz W-K-Y-M-V-M w stężeniu 0.1 mM wywołały pełzanie wewnątrzświatłowe neutrofili z podobnymi prędkościami. Migracja transendotelialna neutrofili oraz ich odrywanie się od ściany naczynia były porównywalne pod względem czasu trwania.

Te dwa chemoatraktanty indukowały również migrację i chemotaksję neutrofili w tkance mięśniowej z niemal taką samą prędkością i podobnymi indeksami chemotaksji neutrofili. Mikroskopia intravitalna jest cennym narzędziem do bezpośredniej obserwacji procesu rekrutacji neutrofili oraz do ilościowego określania funkcji komórek i cząsteczek na każdym etapie rekrutacji. Dzięki zastosowaniu fotografii wideo time-lapse oraz programu Image J, pełzanie wewnątrzświatłowe, migrację przez śródbłonek oraz migrację w chemotaksji leukocytów i tkanek można mierzyć za pomocą intravitalnej mikroskopii w polu jasnym z wykorzystaniem selektywnych inhibitorów, myszy transgenicznych oraz selektywnych chemoatraktantów.

System ten może pomóc w wyjaśnieniu funkcji konkretnych białek w rekrutacji leukocytów.