Name: MISJA LentiPlex Pooled shRNA Library Badania przesiewowe w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę badania przesiewowego z użyciem biblioteki shRNA MISJA LentiPlex w komórkach ssaków. Identyfikuj geny wpływające na przeżycie komórek nowotworowych przy zastosowaniu terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MISSION jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Sigma-Aldrich Biotechnology L.P. 
LentiPlex jest znakiem towarowym firmy Sigma-Aldrich Biotechnology L.P.

Przygotowanie do badania przesiewowego LentiPlex Pooled Screen
W celu zidentyfikowania interesujących sekwencji shRNA krytyczne jest zaprojektowanie badania w taki sposób, aby większość komórek otrzymała tylko jedną konstrukcję shRNA. Dzięki zastosowaniu niskiego MOI (multiplicity of infection), prawdopodobieństwo obecności wielu integrantów w jednej komórce jest znacznie zmniejszone. Jednakże wydajność transdukcji, a co za tym idzie pożądane wartości MOI, silnie zależą od rodzaju komórek docelowych. Dlatego przed rozpoczęciem badania w nowym typie komórek niezbędne jest wyznaczenie optymalnego MOI.
1. Transdukcja komórek docelowych za pomocą puli biblioteki shRNA Mission LentiPlex
<ol>
 <li>Rzeczywista wartość MOI będzie się różnić w zależności od rodzaju komórek. W przypadku chęci wykonania powtórzeń należy odpowiednio zwiększyć liczbę płytek. Ponadto zazwyczaj nie jest korzystne łączenie różnych subpooli. Przechowywanie subpooli oddzielnie ułatwi proces dekonwolucji. Należy zapewnić właściwe oznakowanie każdej szalki hodowlanej numerem subpoola zastosowanego podczas transdukcji. Zaleca się stosowanie niskiego MOI w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa wystąpienia wielu integrantów w jednej komórce. </li>
 <li>Dzień 1 – Wysiać odpowiednią liczbę szalek 60 mm z taką ilością komórek, aby następnego dnia uzyskać ok. 70% konfluencji (łącznie 10 pul, każda wykonana w trzech powtórzeniach = łącznie 30 szalek). W naszym badaniu na szalkach 60 mm wysiano 6 x 10⁵ komórek A549, aby osiągnąć 70% konfluencji przed transdukcją. Zapewnia to, że komórki znajdują się nadal w fazie wzrostu wykładniczego. Szybkość wzrostu będzie się różnić w zależności od typu komórek i musi zostać określona przed rozpoczęciem screeningu.</li>
 <li>Pozostawić komórki do adhezji, inkubując je przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem w atmosferze 5% CO22.</li>
 <li>(Opcjonalnie) Należy dołączyć dwie dodatkowe szalki 60-mm do transdukcji z wykorzystaniem negatywnych shRNA kontrolnych. Szalki należy oznaczyć jako „Control A” dla SHC001H oraz „Control B” dla SHC002H.</li>
 <li>Dzień 2 – Transdukcja komórek za pomocą cząsteczek wirusowych LentiPlex. W dniu transdukcji rozmrozić cząsteczki lentiwirusowe na lodzie.</li>
 <li>Przenieś rozmrożone cząsteczki do komory z laminarnym przepływem powietrza i przechowuj w lodzie, jeśli nie są używane natychmiast.</li>
 <li>Obliczyć, ile z każdego poszczególnego sub-poolu wirusa należy dodać do komórek, aby uzyskać MOI równy 1 we wszystkich naczyniach hodowlanych.
 <ol>
 <li>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 1 x 106 komórek/szalkę; Miano wirusa = 5 x 108 TU/ml; pożądana wielokrotność infekcji (MOI) wynosząca 1. i.) 1 x 106 komórek/szalkę x (MOI = 1) = 1 x 106 jednostek transdukcyjnych (TU) potrzebnych ii.) 1 x 106 TU/(5,0 x 108 TU/ml) uzyskane z C of A = 2 μL roztworu zapasu lentiwirusa należy dodać do odpowiedniej płytki. Obliczoną ilość wirusa należy rozcieńczyć w 100-300 μL pełnej pożywki, aby zapewnić lepszą dystrybucję wirusa po dodaniu go do szalki z hodowlą komórek.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Usunąć pożywkę z wcześniej wysianych komórek. Do każdej szalki dodać pełną pożywkę zawierającą roztwór bromku heksadimetryny. Zalecane stężenie końcowe bromku heksadimetryny w pożywce wynosi 8 μg/mlNależy użyć mniejszej ilości bromku heksadymetryny, jeśli okaże się on toksyczny dla komórek docelowych.</li>
 <li>Dodaj lentiwirusem dostarczane cząsteczki shRNA do odpowiednich naczyń, zgodnie z przyjętym planem doświadczalnym. Delikatnie zakręć płytkami, aby równomiernie rozprowadzić wirusa po komórkach.</li>
 <li>Inkubować przez 18–20 godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem w atmosferze 5% CO22.</li>
 <li>(Opcjonalnie) Powtórzyć kroki 3–8 przy identycznym MOI z zastosowaniem SHC001H (kontrolny pusty wektor shRNA) w szalce kontrolnej A oraz SHC002H (kontrolny shRNA o losowej sekwencji) w szalce kontrolnej B. Szalki te należy traktować w sposób identyczny jak szalki eksperymentalne przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
 <li>Dzień 3 – Wymiana pożywki. Odessać pożywkę zawierającą wirusa i dodać świeżą pożywkę kompletną (bez bromku heksadymetryny). Inkubować komórki w 37°C przez noc.</li>
</ol>
2. Inkubacja wysianych komórek z komponentem terapeutycznym/odczynnikiem
<ol>
 <li>Dzień 4 – Odessać pożywkę z dołków i dodać świeżą pożywkę zawierającą składnik terapeutyczny w optymalnym stężeniu. Podobnie jak w przypadku warunków hodowli, rodzaje terapii będą się różnić, a odpowiednie stężenia i czasy ekspozycji należy ustalić wcześniej. W naszym badaniu zastosowaliśmy 100 ng/mL TRAIL oraz 1 μM Paklitakselu. Komórki były traktowane przez 48 godzin.</li>
 <li>Przeżyłe komórki należy ponownie wysiać do kolb T75 i pozwolić im na namnażanie do osiągnięcia niemal 100% konfluencji.</li>
 <li>(Opcjonalnie) Po zakończeniu selekcji sprawdzić szalkę kontrolną A oraz szalkę kontrolną B. Szalka A i szalka B powinny zawierać mniej kolonii niż co najmniej jedna z szalek z połączoną biblioteką. Jeśli w szalce A znajduje się nieoczekiwanie duża liczba kolonii, oznacza to, że proces transdukcji wpłynął na szlak związany z pożądanym fenotypem lub presja selekcyjna jest niewystarczająco silna, co może wymagać ponownej optymalizacji testu. Jeśli szalka B zawiera zbyt wiele kolonii, ekspresja shRNA i aktywacja szlaku RNAi mogą mieć wpływ na badany fenotyp. W takim przypadku należy powtórzyć procedurę z użyciem SHC001H, aby upewnić się, że efekt nie jest specyficzny dla SHC002H.</li>
</ol>
3. Dekonwolucja z poliklonalnej populacji komórek
<ol>
 <li>Zebierz heterogenną populację komórek z każdej podgrupy i wyizoluj DNA genomiczne. W naszym badaniu komórki krótko przemyto w PBS i poddano trypsynizacji, a następnie wyizolowano DNA genomiczne przy użyciu zestawu GenElute Mammalian Genomic Miniprep i załączonego protokołu (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternatywnie, do izolacji DNA można użyć dowolnych innych dostępnych na rynku zestawów do oczyszczania genomowego. Ważne jest przestrzeganie zaleceń protokołu dotyczących początkowej ilości hodowanych komórek.</li>
 <li>Amplifikacja PCR celów. Procedura odzyskiwania matrycy shRNA umożliwia amplifikację całej puli wstawek shRNA z wybranej populacji komórek lub odzyskanie pojedynczych matryc shRNA z kolonii, które zostały indywidualnie wyselekcjonowane i namnożone. Po amplifikacji wstawek shRNA z komórek kontrolnych i wybranych komórek docelowych, produkty PCR można poddać sekwencjonowaniu.</li>
 <li>Ten etap amplifikacji PCR został zoptymalizowany przy użyciu Sigma ReadyMix, nr katalogowy P2893. Do amplifikacji można użyć innych odczynników, jednak warunki cykliczne i/lub stężenie magnezu mogą wymagać modyfikacji w celu uzyskania pomyślnej amplifikacji. Primery do amplifikacji w stężeniu 20 mM są dołączone do zestawu LentiPlex.</li>
 <li>Przygotuj reakcję PCR zgodnie z opisem w Tabeli 1. Dodawaj składniki w wymienionej kolejności. Opisane ilości dotyczą jednej reakcji o objętości 50 μL. W przypadku większej liczby reakcji przeskaluj składniki master mixu zgodnie z pożądaną liczbą reakcji, uwzględniając 10% nadmiaru. Zalecana ilość matrycy DNA to 50-100 ng.</li>
 <li>Zdecydowanie zaleca się, aby w jednej reakcji matrycę stanowił MISSION shRNA Human Positive Control Vector rozcieńczony do odpowiedniego stężenia. Pomyślna amplifikacja z tą matrycą wskazuje, że składniki testu PCR i warunki cykliczne są odpowiednie. UWAGA: Aby zapobiec kontaminacji przeniesionej (carryover) do próbek i odczynników eksperymentalnych, sugeruje się rozcieńczanie kontroli pozytywnej w innym miejscu niż to, w którym przygotowywane są kolejne reakcje PCR.</li>
 <li>Zapisz program PCR wymieniony w Tabeli 2 w termocyklerze.</li>
 <li>Dla każdej próbki połącz 3 μL reakcji PCR z 1 μL barwnika i przeprowadź elektroforezę wraz z 5 μL DirectLoad™ PCR 100 bp Low Ladder, nr katalogowy D3687, na 1% żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność amplikonu o długości 309 bp.</li>
 <li>Subklonowanie amplikonów PCR: Produkty PCR zostały sklonowane metodą TOPO przy użyciu zestawu do klonowania TOPO-TA, zgodnie z protokołem producenta (Invitrogen, K4575-01). W rezultacie każdy wektor zawiera jeden produkt PCR.</li>
 <li>Wyizolowano 250 pojedynczych kolonii bakteryjnych (każda zawierająca pojedynczy amplikon PCR) i wyhodowano je w 2 mL kulturach LB z 100 mg/mL ampicyliny. Następnie wyekstrahowano DNA plazmidowe przy użyciu zestawu GenElute Plasmid Miniprep (Sigma-Aldrich, PLN70).</li>
 <li>Oczyszczone DNA plazmidowe poddano trawieniu enzymem EcoRI i elektroforezie w celu potwierdzenia obecności wstawki.</li>
 <li>Próbki DNA plazmidowego zostały następnie poddane sekwencjonowaniu, a wstawka shRNA została zidentyfikowana przy użyciu bazy danych LentiPlex shRNA Sequence Search dostarczonej wraz z biblioteką LentiPlex.</li>
</ol>
4. Identyfikacja i walidacja celu
<ol>
 <li>Sekwencja shRNA rozpoczyna się od 5'-GAAACACCGG-3'. Wprowadź co najmniej kolejne 10, ale mniej niż 21 nukleotydów jako sekwencję zapytania w polu wyszukiwania w dołączonym formularzu bazy danych shRNA Sequence Search Access. </li>
 <li>Wybierz gatunek z puli shRNA. Opcjonalnie wybierz podpulę, w której znaleziono sekwencję. </li>
 <li>Kliknij przycisk „Find Potential Hits”, aby przeprowadzić wyszukiwanie. Powinno to zidentyfikować odpowiadające sekwencje shRNA z TRC, które są zgodne z danymi sekwencjonowania. Więcej informacji na temat zidentyfikowanych sekwencji shRNA z TRC i odpowiadających im genów docelowych można łatwo znaleźć w serwisie Sigma-Aldrich Your Favorite Gene: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a></li>
 <li>Zidentyfikowane geny docelowe należy zwalidować poprzez powtórzenie oryginalnego testu przesiewowego z oryginalnym klonem TRC oraz co najmniej dwoma dodatkowymi shRNA celującymi w ten sam gen, stosując format 1 shRNA na 1 dołek. Prawdziwe trafienia wykażą ten sam fenotyp w większości dołków.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład przebiegu procesu przesiewowego LentiPlex pooled screen przedstawiono na rysunku 1. Przetransdukowane komórki, które proliferowały w obecności TRAIL i Paclitaxel, pozostawiono do namnożenia aż do uzyskania konfluencji w kolbach. DNA genomowe zostało wyizolowane i poddane amplifikacji PCR oraz klonowaniu, zgodnie z ilustracją na rysunku 1 A, a następnie przekazane do sekwencjonowania i identyfikacji shRNA, jak opisano na rysunku 1 C. Zsekwencjonowano 250 klonów, z czego 25 było reprezentowanych przez wiele klonów, a pozostałe 225 przez tylko jeden klon i nie były one analizowane na tym etapie.
Jak pokazano na Ryc. 2, kilka genów kandydackich, w tym TBX3, PPP2CA i AKT2, było reprezentowanych przez wiele klonów. czynnik transkrypcyjny T-box, TBX3, pojawił się w łącznie czterech klonach i jest powiązany z migracją nowotworową5. Wykazano, że obniżenie poziomu ekspresji PPP2CA podtrzymuje wzrost komórek LNCaP hodowanych w warunkach niedoboru androgenów poprzez zniesienie indukowanego deprywacją androgenów zatrzymania cyklu komórkowego i zapobieganie apoptozie 6. AKT2 jest RAC-beta seryno-/treonino-proteinową kinazą i domniemanym onkogenem, o którym wykazano, że pełni kilka ról w rozwoju nowotworów 7, 8.
 
<img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tabela przygotowania PCR z objętościami i stężeniami odczynników do amplifikacji DNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
*Końcowe stężenie Mg2+ w roztworze wyniesie 3 mM; 1,5 mM pochodzi z Taq ReadyMix, a 1,5 mM z roztworu chlorku magnezu. 
Tabela 1. Warunki reakcji PCR Lentiplex 
<img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tabela programu PCR przedstawiająca temperaturę, czas i cykle procesu amplifikacji DNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2. Program amplifikacji PCR Lentiplex 
<img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Schemat ekstrakcji z hodowli komórkowej; przebieg procesu od szalki Petriego do kolby i probówki do wirowania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1a"> 
<img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Schemat elektroforezy żelowej PCR; wzory prążków DNA; amplifikacja 1A; przebieg eksperymentu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1b"> 
<img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Wyniki elektroforezy żelowej; dane sekwencjonowania DNA; analiza wektora i insertu w badaniach molekularnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1c"> 
Rysunek 1. (A) Przesiewanie zbiorcze LentiPlex, (B) schemat dekonwolucji poliklonalnej oraz (C) identyfikacja celów shRNA.
A. Przesiewanie z pulą LentiPlex. Najpierw wysiej komórki, a następnie dodaj podpule shRNA (łącznie 10 pul, każda wykonana w trzech powtórzeniach, co daje łącznie 30 szalek). Następnie potraktuj je komponentem terapeutycznym/odczynnikiem (w naszym przypadku odpowiednio TRAIL i Paclitaxel). Potem ponownie wysiej przeżyłe komórki do kolb i pozwól im namnożyć się. Zbierz heterogenną populację komórek z każdej podpuli i wyizoluj DNA genomiczne.
B. Dekonwolucja poliklonalna. Przeprowadź reakcję PCR w celu amplifikacji DNA zawierającego insert shRNA. Produkt PCR jest jednorodny pod względem wielkości, ale poliklonalny pod względem sekwencji, ponieważ matrycowe gDNA było również poliklonalne. Produkt PCR jest klonowany do wektora, a następnie transformowany do kompetentnych bakterii.
C. Identyfikacja celów shRNA. Poszczególne kolonie są izolowane, a następnie ekstrahuje się DNA plazmidowe. Każdy klon zawiera wektor klonujący z jednym pojedynczym fragmentem PCR. DNA plazmidowe jest trawione w celu potwierdzenia obecności insertu, a następnie sekwencjonowane. Insert shRNA jest identyfikowany przy użyciu bazy danych LentiPlex shRNA Sequence Search.
<img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy genów kandydackich zidentyfikowanych za pomocą sekwencjonowania poliklonalnego; przedstawia liczbę trafień na gen." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zidentyfikowane geny kandydackie. Zidentyfikowano 25 genów kandydackich, które wykazały wiele trafień. 225 genów kandydackich miało tylko 1 trafienie i nie było dalej analizowanych. Szczegółowy wykaz poszczególnych klonów dla każdego genu kandydackiego znajduje się w Tabeli Uzupełniającej 1.
<img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tabela danych ekspresji genów przedstawiająca identyfikatory docelowe dla analizy interferencji RNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela uzupełniająca 1. Poszczególne klony biblioteki TRC zidentyfikowane na podstawie sekwencjonowania poliklonalnego: trafienia ID genu i wykryte klony.

<ol><li>Rao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+vs.+shRNA%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">siRNA vs. shRNA: similarities and differences.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).</li>
<li>Root, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+loss-of-function+screening+with+a+lentiviral+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library.</a> Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).</li>
<li>Fan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+antitumor+activity+of+TRAIL+combined+with+chemotherapeutic+agents+in+A549+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).</li>
<li>Ji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+of+shRNAs+targeting+tumor+suppressor+genes+to+identify+factors+involved+in+A549+paclitaxel+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity.</a> Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).</li>
<li>Fillmore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+expands+breast+cancer+stem-like+cells+through+paracrine+FGF%2FTbx3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).</li>
<li>Bhardwaj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+phosphatase+2A+activity+alters+androgen-independent+growth+of+prostate+cancer+cells%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer.+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications.</a> Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2%2C+a+putative+oncogene+encoding+a+member+of+a+subfamily+of+protein-serine%2Fthreonine+kinases%2C+is+amplified+in+human+ovarian+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).</li>
<li>Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+and+Akt2%3A+differentiating+the+aktion%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Akt1 and Akt2: differentiating the aktion.</a> Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).</li>
<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137 (5), 835-835 (2009).</li>
<li>Ketela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).</li>
</ol>

Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sago oraz John Swarthout są zatrudnieni w firmie Sigma-Aldrich, która produkuje narzędzia i odczynniki wykorzystane w niniejszym artykule.

W niniejszym badaniu przedstawiamy przesiew genomowy w celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w cytotoksyczność komórek A549 po zastosowaniu leczenia paklitakselem/TRAIL. Zastosowanie metody pulowanej w przesiewie genomowym pozwala zredukować czas, koszty oraz nakłady sprzętowe zazwyczaj związane z konwencjonalnymi przesiewami w układzie macierzowym. Kluczowe dla sukcesu przesiewu są eksperymenty optymalizacyjne przeprowadzone wcześniej. Warunki transdukcji oraz MOI muszą zostać określone empirycznie.
Metoda selekcji powinna umożliwiać skuteczne wyłonienie komórek wykazujących pożądany fenotyp (np. przeżywalność, ekspresję białek powierzchniowych itp.). Optymalizacja tych parametrów pozwoli ograniczyć liczbę wykrytych wyników fałszywie dodatnich.
W niniejszym badaniu gDNA pozyskano z całej populacji wybranych komórek, a następnie poddano klonowaniu TOPO w celu zidentyfikowania poszczególnych wstawk shRNA. Potencjalną modyfikacją ulepszającą ten eksperyment byłaby selekcja żywych komórek za pomocą FACS, aby zapewnić pobranie wyłącznie żywych komórek. Zidentyfikowane cele zostaną zwalidowane poprzez transdukcję specyficznymi dla celu shRNA w teście przesiewowym. Prawdziwe trafienia będą wykazywać dany fenotyp w większości studzienek.
Biblioteka LentiPlex Pooled Library charakteryzuje się elastycznością zastosowań. Jest ona kompatybilna z szeroką gamą aplikacji następczych i może być wykorzystywana w strategiach selekcji pozytywnej lub negatywnej. W zależności od warunków przesiewania, dekonwolucja wstawek shRNA jest przeprowadzana za pomocą PCR/klonowania, mikromacierzy lub sekwencjonowania nowej generacji 9, 10. Choć moc i szybkość tych technik w dekonwolucji przesiewów RNAi są dobrze udokumentowane, pewną obawą w przypadku metod z użyciem mikromacierzy i sekwencjonowania nowej generacji jest dostępność zasobów bioinformatycznych oraz wiedzy niezbędnej do prawidłowej analizy i interpretacji wyników eksperymentalnych. Koszty związane z tymi technikami mogą często stanowić barierę w realizacji przesiewów w skali całego genomu. Podejście oparte na PCR/klonowaniu, choć nie jest tak wydajne jak mikromacierze i sekwencjonowanie nowej generacji, stanowi skuteczną i tańszą alternatywę.
Firma Agilent oferuje obecnie niestandardową macierz opartą na bibliotece shRNA TRC, aby dodatkowo wspomóc badania przesiewowe LentiPlex. Opcje te umożliwiają badaczom wykorzystanie LentiPlex do analizy szerokiego zakresu funkcji komórkowych.

<table><tbody><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=SHPH01%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;LentiPlex Pooled Array&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=SHPH01%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;SHPH01&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Komórki A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T5694%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;TRAIL&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T5694%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;T5694&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T7402%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;Paklitaksel&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T7402%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;T7402&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Topo TA Cloning Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K4575-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P2893%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;JumpStart Taq ReadyMix&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P2893%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;P2893&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=PLN70%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;GenElute Plasmid Miniprep kit&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=PLN70%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;PLN70&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=H9268%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;bromek heksadymetryny&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=H9268%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC"&gt;H9268&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

przesiewanie biblioteki połączonej shrna mission lentiplex w komórkach ssaków

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

Interferencja RNA (RNAi) jest naturalnym mechanizmem komórkowym służącym do regulacji ekspresji genów. Wykorzystanie wrodzonej mocy tego systemu umożliwia obniżenie poziomów ekspresji genów w badaniach nad utratą funkcji genu.
Istnieją dwie główne metody przeprowadzania RNAi. Pierwsza polega na wykorzystaniu syntetycznie otrzymywanych małych interferujących RNA (siRNAs), a druga opiera się na wykorzystaniu krótkich RNA w formie spinki (shRNAs) kodowanych w plazmidach 1. Te drugie mogą być wprowadzane do komórek bezpośrednio poprzez transfekcję lub pakowane do niezdolnych do replikacji cząsteczek lentiwirusowych. Głównymi zaletami stosowania lentiwirusowych shRNAs są łatwość wprowadzenia ich do szerokiej gamy typów komórek, zdolność do stabilnej integracji z genomem w celu długotrwałego wyciszania genów i selekcji, a także ich skuteczność w prowadzeniu wysokoprzepustowych badań przesiewowych funkcji utraconych. Aby ułatwić ten proces, stworzyliśmy połączoną bibliotekę shRNA LentiPlex.
Biblioteka puli shRNA dla ludzi MISSION LentiPlex jest genomową pulą lentiwirusową wytworzoną przy użyciu zastrzeżonego procesu. Biblioteka składa się z ponad 75 000 konstruktów shRNA z kolekcji TRC, celujących w ponad 15 000 ludzkich genów 2. Każda biblioteka jest testowana pod kątem reprezentatywności shRNA przed wprowadzeniem produktu do obrotu, aby zapewnić szerokie pokrycie biblioteki. Biblioteka jest dostarczana w gotowym do użycia formacie lentiwirusowym o mianie co najmniej 5 x 108 TU/ml określonym za pomocą analizy p24 i jest wstępnie podzielona na dziesięć podpuli, z których każda zawiera około 8 000 konstruktów shRNA. Do późniejszej identyfikacji celów dostarczone są również primery do amplifikacji i sekwencjonowania.
Poprzednie badania wykazały synergistyczną aktywność przeciwnowotworową TRAIL w połączeniu z Paklitakselem w komórkach A549, linii komórkowej raka płuca człowieka 3, 4. W niniejszym badaniu prezentujemy zastosowanie puli biblioteki LentiPlex shRNA w celu szybkiego przeprowadzenia przesiewowego badania selekcji pozytywnej genów zaangażowanych w cytotoksyczność komórek A549 po ekspozycji na TRAIL i Paklitaksel. Jedną z barier często spotykanych w badaniach wysokoprzepustowych jest koszt i trudność dekonwolucji; szczegółowo opisujemy również kosztowo efektywne podejście poliklonalne z wykorzystaniem tradycyjnego sekwencjonowania.

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę pulową LentiPlex oraz tradycyjne metody sekwencjonowania w celu identyfikacji genów docelowych sprzyjających przeżyciu komórek. Przedstawiamy sposób przygotowania i dekonwolucji screeningu LentiPlex oraz walidacji uzyskanych wyników.

Przesiewanie biblioteki połączonej shRNA MISSION LentiPlex w komórkach ssaków

Interferencja RNA (RNAi) jest wrodzonym mechanizmem komórkowym służącym do regulacji ekspresji genów. Wykorzystanie naturalnego potencjału tego systemu pozwala nam na ...

Ogólnym celem poniższego filmu jest zademonstrowanie wykorzystania biblioteki krótkich interferujących RNA (shRNA) dla całego genomu do szybkiego przeprowadzenia przesiewu z selekcją pozytywną. Zostaje to osiągnięte poprzez transdukcję komórek docelowych za pomocą 10 subpooli biblioteki shRNA dla całego genomu w systemie Mission LentiPlex, a następnie dodanie komponentu terapeutycznego. W drugim kroku odzyskiwany jest materiał matrycowy RNA, co umożliwia dekonwolucję przesiewu z puli.Odzyskane S-H-R-N-A jest następnie klonowane do wektora i transformowane do kompetentnych bakterii. Następnie próbki DNA plazmidowego są sekwencjonowane, a cele S-H-R-N-A są identyfikowane przy użyciu bazy danych wyszukiwania sekwencji HRNA lenti PLX. Wyniki eksperymentu przeprowadzonego w tym filmie ujawniają geny zaangażowane w cytotoksyczność linii komórkowej guza nabłonkowego po wystawieniu na działanie przeciwnowotworowych środków farmakologicznych, w oparciu o liczbę trafień sekwencyjnych.Zestaw Lin Duplex pooled. Biblioteka hRNA zawiera konsorcjum RNAi lub kolekcję TRC w 10 probówkach matrycowych i może być wykorzystana do szybkiego przeprowadzania wysokoprzepustowych badań nad utratą funkcji genów. W niniejszym badaniu została ona użyta do szybkiego przeprowadzenia selekcji pozytywnej genów zaangażowanych w cytotoksyczność komórek 5 49 w odpowiedzi na TRAIL i paklitaksel przed transdukcją komórek docelowych.Wysiać odpowiednią liczbę naczyń 60 milimetrowych z taką ilością komórek, aby następnego dnia uzyskać około 70% konfluencji. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Szybkość wzrostu będzie różnić się w zależności od typu komórek i musi zostać określona przed rozpoczęciem przesiewu, aby przygotować się do transdukcji komórek z pulą biblioteki mission lenti plex S-H-R-N-A. Rozmrozić cząstki lentiwirusowe na lodzie, a następnie przenieść rozmrożone cząstki do komory z laminarnym przepływem powietrza, utrzymując je na lodzie, jeśli nie będą użyte natychmiast.Oblicz, jaką ilość każdej poszczególnej subpopulacji wirusa należy dodać do komórek, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą jeden we wszystkich szalkach z hodowlą komórkową. Niską wartość MOI stosuje się w celu zmniejszenia prawdopodobieństwa obecności wielu integryn w jednej komórce. Obliczoną ilość wirusa rozcieńcz w 100 do 300 µL pełnej pożywki, aby zapewnić lepszy rozkład wirusa po dodaniu go do szalki z hodowlą komórkową, a następnie usuń pożywkę z wcześniej przygotowanych komórek. Do każdej szalki dodaj pełną pożywkę zawierającą roztwór poly brain.Dodaj cząsteczki lentiwirusowe HRNA do odpowiednich naczyń zgodnie z ustalonym planem eksperymentu. Delikatnie zakręć płytkami, aby równomiernie rozprowadzić wirusa po komórkach. Inkubuj przez 18 do 20 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem w atmosferze 5% CO2.Następnego dnia odessać medium zawierające wirusa i dodać świeże medium kompletne bez poly brain. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc. W czwartym dniu odessać medium z komórek i dodać świeże medium zawierające komponent terapeutyczny w określonej optymalnej koncentracji. Następnie poddać komórki działaniu komponentu przez określony czas.W niniejszym badaniu komórki poddano działaniu 100 nanogramów na mililitr trail oraz jednej mikromol paclitaxelu przez 48 godzin. Po zakończeniu inkubacji przeżyłe komórki należy ponownie wysiać do kolb T 75 i pozwolić im na namnażanie aż do osiągnięcia niemal 100% konfluencji w celu przeprowadzenia dekonwolucji poliklonalnej. Z każdej subpuli pobiera się heterogenną populację komórek, a następnie izoluje genomowe DNA.Rozpocząć procedurę odzyskiwania matrycy S-H-R-N-A od przygotowania reakcji PCR zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Primery amplifikacyjne o stężeniu 20 millimolar są dołączone do zestawu lenti plex. Przygotować kontrolę pozytywną, wykorzystując wektor kontrolny mission SHRA human rozcieńczony do odpowiedniego stężenia jako matrycę.Pomyślna amplifikacja z tym matrycą wskazuje, że komponenty testu PCR oraz warunki cykli są odpowiednie. Zapisz program PCR wymieniony w protokole pisemnym w termocyklerze i przeprowadź amplifikację docelową. Po zakończeniu cyklu połącz 3 µL każdej reakcji PCR z 1 µL barwnika i przeprowadź elektroforezę wraz z markerem 100 bp na żelu agarozowym 1%, aby potwierdzić obecność amplikonu o długości 309 bp.Na tym etapie produkty PCR poddaje się subklonowaniu. Produkty PCR klonuje się za pomocą zestawu do klonowania Topo TOPO TA, zgodnie z protokołem producenta. W rezultacie w każdym wektorze znajduje się jeden produkt PCR. Po zakończeniu subklonowania izoluje się 250 pojedynczych kolonii bakteryjnych, z których każda zawiera pojedynczy amplikon PCR.Poszczególne kolonie należy hodować w kulturach o objętości dwóch mililitrów, z których można wyekstrahować plazmidowe DNA przy użyciu zestawu Gen Elute plasmid mini prep; po trawieniu oczyszczonego plazmidowego DNA enzymem echo R one obecność insertu można potwierdzić za pomocą elektroforezy. Na koniec, w zsekwencjonowanych próbkach plazmidowego DNA można zidentyfikować insert S-H-R-N-A, korzystając z bazy danych Plex HRNA sequence search dostarczonej z biblioteką PLX. W załączonym formularzu bazy danych S-H-R-N-A sequence search należy odnaleźć pole wyszukiwania i wprowadzić początek sekwencji HRNA.Wprowadź kolejne 10 do 21 nukleotydów sekwencji zapytania. Następnie wybierz gatunek dla zpoolowanego S-H-R-N-A. Opcjonalnie wybierz podpulę, w której znaleziono sekwencję.Teraz kliknij przycisk find potential hits, aby przeprowadzić wyszukiwanie. Powinno to zidentyfikować odpowiadające sekwencje T-R-C-S-H-R-N-A, które pasują do danych sekwencyjnych. Następnie można skorzystać z witryny Sigma aldrich, Twojej ulubionej strony o genach, aby znaleźć więcej informacji na temat zidentyfikowanych sekwencji TR CS HRA i odpowiadających im genów docelowych. Zidentyfikowane geny docelowe należy zwalidować, powtarzając oryginalny test przesiewowy z oryginalnym klonem TRC oraz co najmniej dwoma dodatkowymi RNA celującymi w ten sam gen, stosując format jednego hRNA na jedną szalkę 60 mm.Prawdziwe trafienia będą wykazywać ten sam fenotyp w większości szalek. Klony zawierające wektor klonujący z pojedynczym fragmentem PCR wyizolowano przy użyciu procedury odzyskiwania matrycy SHRA, a insert HRNA zidentyfikowano za pomocą bazy danych wyszukiwania sekwencji lenti plex SHRA. Zsekwencjonowano 250 klonów.Z tych 25 było reprezentowanych przez wiele klonów, a pozostałe 225 reprezentowany był tylko jeden klon i nie były one dalej analizowane. Jak tutaj pokazano, kilka genów kandydujących, w tym TBX three, PPP two, ca i AKT two, było reprezentowanych przez wiele klonów. Czynnik transkrypcyjny T-box TBX three pojawił się w łącznie czterech klonach i był wiązany z migracją nowotworową.Wykazano, że obniżenie poziomu ekspresji PPP2CA pozwala na utrzymanie wzrostu komórek LNCaP hodowanych w warunkach niedoboru androgenów poprzez zniesienie indukowanego deprywacją androgenową zatrzymania cyklu komórkowego oraz zapobieganie apoptozie. Ponadto AKT2 jest kinazą białkową Arak Beta Syrian 3 Anine i domniemanym onkogenem, któremu przypisuje się kilka ról w rozwoju nowotworów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu wykorzystania tej metody.Biblioteka shRNA typu pooled Lentplex do szybkiego przeprowadzania wysokoprzepustowych badań utraty funkcji genów.

mission-lentiplex-pooled-shrna-library-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

MISSION LentiPlex Zbiorowe badania biblioteki shRNA w komórkach ssaków

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę esiRNA w badaniu wysokoprzepustowym w celu identyfikacji genów zaangażowanych w podział komórki. Przedstawiamy sposób przygotowania i przeprowadzenia przesiewu esiRNA, a także metodę analizy i walidacji uzyskanych wyników.

MISSION esiRNA do przesiewania RNAi w komórkach ssaków

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

Informujemy o małym RNA spinki do włosów (shRNA) i protokole sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w linii komórkowej myszy z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycynę połączonymi z genem białka wiążącego metylo CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X.

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe RNA (RNAi) z wykorzystaniem puli lentiwirusowych shRNA mogą być narzędziem do wykrywania terapeutycznie istotnych syntetycznych celów śmiertelnych w nowotworach złośliwych. Zapewniamy zbiorcze podejście do badań przesiewowych shRNA w celu zbadania efektorów epigenetycznych w ostrej białaczce szpikowej (AML).

Zbiorcze badania przesiewowe biblioteki shRNA w celu identyfikacji czynników modulujących fenotyp oporności na leki

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

To badanie przedstawia podwójny system CRISPRi ukierunkowany na długie, niekodujące RNA w komórkach czerniaka. Umożliwia kombinatoryczne knockdown genów i syntetyczne badania przesiewowe ze skutkiem śmiertelnym, identyfikując interakcje lncRNA specyficzne dla raka dla potencjalnych strategii terapeutycznych.

Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

Poznaj metodę badania przesiewowego z użyciem biblioteki shRNA MISJA LentiPlex w komórkach ssaków. Identyfikuj geny wpływające na przeżycie komórek nowotworowych przy zastosowaniu terapii.

Przesiewanie biblioteki połączonej shRNA MISSION LentiPlex w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów