Name: Ustanowienie linii komórkowych limfoblastoidów przekształconych we wzrost wirusa Epsteina-Barr (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę generowania linii komórkowych limfoblastoidów z ludzkich limfocytów B przy użyciu wirusa Epsteina-Barr. Protokół umożliwia wczesną predykcję transformacji już po trzech dniach od zakażenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania te zostały sfinansowane z grantów NIH K08 AI062732, K12 HD001401 i 1UL1RR024139-02, a także z grantu na badania nad zdrowiem dzieci przyznanego S.B.-M. przez Fundację Charlesa H. Hooda oraz przez Fundację Badawczą Uniwersytetu Stanowego Nowego Jorku w Stony Brook.

1. Przygotowanie zapasu EBV
<ol>
	<li>Przeszczepić komórki B95-8 (ATCC # CRL 1612; 13) w fazie wzrostu wykładniczego w zagęszczeniu 3 x 105 komórek/ml do kolby hodowlanej o powierzchni 75cm2, stosując technikę sterylną. Komórki hodować w pełnej pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicylinę/streptomycynę w stężeniach odpowiednio 100U/ml i 100 μg/ml oraz amfoterycynę B w stężeniu 0,5 μg/ml w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.</li>
	<li>Po czterdziestu ośmiu godzinach resuspendować komórki w świeżej pełnej pożywce RPMI 1640 w zagęszczeniu 1 x 106 komórek/ml. Aby indukować produkcję wirusa, stymulować komórki tetradekanoilowym octanem forbolu (TPA) w stężeniu 20ng/ml przez 1 godzinę w standardowym inkubatorze CO2. Przemyć komórki trzy razy pożywką RPMI 1640 w celu usunięcia TPA.</li>
	<li>Resuspendować komórki w pierwotnej objętości pełnej pożywki RPMI 1640 (z punktu 1.2) i umieścić kolbę w inkubatorze CO2 na 96 godzin. Wykazano, że metoda ta pozwala na uzyskanie wysokich mian zakaźnych cząsteczek wirusa6.</li>
	<li>Wirować przy 600 x g przez 10 min w temperaturze 4°C, aby oddzielić znadpływ hodowlany zawierający EBV od komórek. Przefiltrować znadpływ przez filtr 0,45 mikrona, podzielić na alykwoy i przechowywać w temperaturze -70°C przez ponad rok. 
	Alternatywnie można pozyskać znadpływ z komórek B95-8 zawierających EBV z ATCC (VR-1492) i stosować go w rozcieńczeniu zalecanym przez ATCC.</li>
</ol>
2. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC)
<ol>
	<li>Pobrać 10 ml krwi od dawcy do heparynowanej strzykawki lub heparynowanej probówki do krwi. Rozcieńczyć krew w 20 ml PBS w temperaturze pokojowej w 50 ml probówce stożkowej.</li>
	<li>Nałożyć rozcieńczoną krew na 15 ml medium do separacji limfocytów Ficoll Hypaque. Wirować przy 225 x g bez hamowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li> zebrać warstwę leukocytarną (buffy coat) i przenieść ją do nowej 50 ml probówki stożkowej. Uzupełnić objętość do 50 ml za pomocą PBS i wirować przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Odlać nadsącz. Przemyć komórki, resuspendując osad w 50 ml PBS i wirując przy 600 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórzyć proces mycia jeszcze dwukrotnie w ten sam sposób.</li>
	<li>Resuspender przemyte komórki w 1 ml kompletnego medium RPMI. Odiebrać 5 μL zawiesiny komórek w celu przygotowania rozcieńczenia 1/10 w błękicie trypanu. Policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Dostosować objętość za pomocą kompletnego medium RPMI w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 25 cm2, aby uzyskać stężenie komórek 2 x 106/ml.</li>
</ol>
3. Infekcja EBV
<ol>
	<li>Do zawiesiny komórek z punktu 2.6 dodać FK506 (AG Scientific) do stężenia końcowego 20 nM. Kolbę umieścić w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C na jedną godzinę.</li>
	<li>Szybko rozmrozić alikwot EBV. Wyjąć kolbę z inkubatora i dodać EBV do komórek w rozcieńczeniu 1/10. Zazwyczaj takie rozcieńczenie zapewnia MOI na poziomie 50-100. Zamieszać zawartość kolby i ustawić ją pionowo w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
Należy pamiętać, że krok 4, wykonywany w celu przewidzenia pomyślnego wyniku, jest krokiem opcjonalnym. Jeśli krok 4 ma zostać przeprowadzony, konieczne będzie inkubowanie dodatkowej kolby niezinfekowanych PBMC w stężeniu 2 x 106 cells/ml jako kontroli.
4. Identyfikacja proliferującej populacji komórek (Krok opcjonalny)
<ol>
	<li>Przygotować bufor FACS: PBS + 5% FBS. Przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Przygotować następujące mieszaniny przeciwciał w objętości 50 μL każda do barwienia komórek w kroku 4.6. Rozcieńczenia przeciwciał należy wykonać w buforze FACS zawierającym 1mg/ml mysiego IgG (Sigma) w celu zahamowania niespecyficznego wiązania przeciwciał.
	<ol class="lroman">
		<li>barwienie pojedyncze przeciwciałem anty-CD23 sprzężonym z PE (rozcieńczenie 1/50)</li>
		<li>barwienie pojedyncze przeciwciałem anty-CD58 sprzężonym z FITC (rozcieńczenie 1/50)</li>
		<li>barwienie pojedyncze przeciwciałem anty-CD19 sprzężonym z PE-Cy5 (rozcieńczenie 1/50)</li>
		<li>barwienie potrójne dla CD23, CD58 i CD19 (każde w rozcieńczeniu 1/50)</li>
		<li>barwienie pojedyncze przeciwciałem kontrolnym izotypowym sprzężonym z PE, dopasowanym do CD23-PE (w tym samym stężeniu co przeciwciało anty-CD23)</li>
		<li>barwienie pojedyncze przeciwciałem kontrolnym izotypowym sprzężonym z FITC, dopasowanym do CD58-FITC (w tym samym stężeniu co przeciwciało anty-CD58)</li>
		<li>barwienie pojedyncze przeciwciałem kontrolnym izotypowym sprzężonym z PE-Cy5, dopasowanym do CD19-PE-Cy5 (w tym samym stężeniu co przeciwciało anty-CD19)</li>
		<li>barwienie potrójne wszystkimi trzema przeciwciałami kontrolnymi izotypowymi.</li>
	</ol>
	Mieszaniny przechowywać tymczasowo w temperaturze 4°C w ciemności.</li>
	<li>Trzeciego dnia po ekspozycji na EBV delikatnie zakręcić kolbą, aby uzyskać bardziej jednorodną zawiesinę komórek. Przenieść 2ml z kolby do probówki Eppendorf o pojemności 2ml. Wirować probówkę w mikrowirówce z prędkością 3000 rpm w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
	<li>Odssać nadsącz i resuspender komórki w buforze FACS w stężeniu od 5 x 106 do 1 x 107komórek/ml.</li>
	<li>Odmierzyć osiem alikwotów po 50μl do oddzielnych probówek Eppendorf lub na płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery V. Wirować probówki lub płytkę z przyspieszeniem 1500 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i wymieszać zawartość probówek/płytki na wstrząsarze typu vortex. Resuspender komórki w każdej probówce/dołku w 50 μL buforu FACS zawierającego odpowiednie rozcieńczenia przeciwciał przygotowane w punkcie 4.2.</li>
	<li>Inkubować probówki/płytkę na lodzie w ciemności przez 30 minut. Wirować komórki z prędkością 3000 rpm przez 3 minuty, usunąć nadsącz i dodać 200 μL buforu FACS. Ponownie wirować komórki i usunąć nadsącz, aby zakończyć przemywanie. Powtórzyć procedurę przemywania jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Resuspender komórki w 200 μL buforu FACS i zebrać dane za pomocą cytometru przepływowego, rejestrując 20 000 zdarzeń/probówkę.</li>
	<li>Przeanalizować dane za pomocą oprogramowania WinMDI (bezpłatne oprogramowanie do analizy danych FACS na komputerach PC). Wyznaczyć bramkę dla żywych komórek na podstawie profilu rozproszenia światła przedniego (FSC) i bocznego (SSC). Następnie wyznaczyć bramkę dla żywych komórek wykazujących ekspresję CD19+ (marker limfocytów B) po porównaniu z komórkami barwionymi przeciwciałem kontrolnym izotypowym dopasowanym do przeciwciała anty-CD19. Przedstawić żywe limfocyty B CD19+ na wykresie, gdzie na osi x znajduje się intensywność fluorescencji dla CD23, a na osi y intensywność fluorescencji dla CD58. Wyznaczyć komórki CD23+ i CD58+ poprzez porównanie z komórkami eksponowanymi na EBV i barwionymi dopasowanymi przeciwciałami kontrolnymi izotypowymi. Obecność komórek CD23hiCD58+ w kulturze eksponowanej na EBV (Rycina 2C) zwiastuje udany wzrost komórek przekształconych wzrostowo zakażonych EBV. W przeciwieństwie do tego, komórki CD23hiCD58+ nie pojawiają się, gdy komórki nie są eksponowane na EBV (Rycina 2A) lub są eksponowane na nieuniezależniający szczep EBV (Rycina 2B). Wykazano eksperymentalnie, że komórki CD23hiCD58+ ulegają proliferacji, a następnie tworzą linie LCL (14).</li>
</ol>
5. Ekspansja i kriokonserwacja LCL
<ol>
	<li>Wizualizacja komórek za pomocą mikroskopii świetlnej: Tydzień po infekcji EBV w mikroskopii świetlnej widoczne są skupiska komórek. Rycina 3 przedstawia przykład wczesnych skupisk mikroskopowych (Rycina 3B) w kolbie.</li>
	<li>Wraz z upływem czasu skupiska mikroskopowe powiększają się, tak że w kolbie widoczne stają się makroskopowe grudki. Rycina 3C przedstawia większe skupiska komórek w ugruntowanych LCL w mikroskopii świetlnej.</li>
	<li>Dokarmianie komórek: W 12. dniu należy podwoić objętość pożywki hodowlanej w kolbie hodowlanej. Następnie należy rozszerzyć hodowlę, zwiększając jej objętość 2-3 krotnie przy użyciu pełnego RPMI.</li>
	<li>Okresowość dokarmiania komórek powinna być określona na podstawie tempa wzrostu komórek. Gdy pożywka hodowlana zmieni kolor na żółty, zazwyczaj nadszedł czas na jej wymianę zgodnie z powyższym opisem. Zazwyczaj dzieje się to raz w tygodniu. Jednak niektóre linie komórkowe mogą wymagać częstszego lub rzadszego dokarmiania. W ciągu kolejnych kilku tygodni należy rozszerzyć hodowlę do 75-100 ml.</li>
	<li>Kriokonserwacja: Podczas zamrażania komórek należy je odwirować przy 600 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Należy usunąć nadsącz i zawiesić osad komórkowy w zimnym medium do zamrażania zawierającym 90% FBS i 10% dimetylosulfotlenku w stężeniu 1 × 107 komórek/ml. Probówkę należy umieścić w ciekłym azocie.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Pomyślny wynik jest przewidywany przez obecność komórek CD23hiCD58+. Około 2-3% żywych komórek w 3-4 dniu po ekspozycji na EBV powinno wykazywać taki profil (Rycina 2C). Inne subpopulacje komórek CD23+, CD23-, CD58+ oraz CD58- obserwowane po ekspozycji na EBV wykazują minimalną proliferację14. Komórki niezinfekowane (Rycina 2A) oraz komórki eksponowane na EBV pochodzący z linii HH514-16 (Rycina 2B), zawierającej nieunieśmiertelniający szczep EBV, nie wykazują obecności komórek CD23hiCD58+.
Można również wizualizować komórki za pomocą mikroskopii świetlnej w celu monitorowania pomyślnego wyniku: jak wspomniano wcześniej, w ciągu tygodnia po infekcji EBV, w kolbie widoczne są pod mikroskopem świetlnym małe skupiska komórek (Rycina 3B). Wraz z upływem czasu i rozwojem komórek w LCL, mikroskopowe skupiska stają się większe (Rycina 3C), tak że grudki są widoczne makroskopowo w kolbie.
<img alt="Schemat procesu transformacji EBV; hodowla PBMC, krio konserwacja, limfoblastoidalna linia komórkowa." src="/files/ftp_upload/3321/3321fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Procedura generowania i kriokonserwacji limfoblastoidalnych linii komórkowych. Krew obwodową wiruje się przez gradient Ficoll. PBMC obecne w warstwie leukocytarnej utworzonego gradientu poddaje się działaniu FK506, a następnie dodaje EBV. Komórki eksponowane na EBV hoduje się w temperaturze 37°C w obecności 5% CO2 w celu utworzenia, a następnie namnożenia LCL do późniejszej kriokonserwacji.
<img alt="Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej: analiza markerów CD23 vs CD58, porównanie warunków ekspozycji na EBV." src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Identyfikacja subpopulacji limfocytów B, w których oczekiwano proliferacji po ekspozycji na EBV. Niezakażone PBMC (A) lub PBMC eksponowane na EBV pochodzące z komórek HH514-16 (B) lub z komórek B95-8 (C) w obecności FK506 zebrano w 3. dniu. Komórki barwiono przeciwciałami koniugowanymi z fluorochromami skierowanymi przeciwko CD19, CD23 i CD58. Po wyznaczeniu bramki dla żywych komórek, badano ekspresję CD23 i CD58 w niezakażonych (A) oraz eksponowanych na EBV (B i C) limfocytach B CD19+. Przedstawiono subpopulację limfocytów B wykazujących ekspresję CD58 i wysoki poziom CD23 (CD23hiCD58+), zaobserwowaną wyłącznie w komórkach eksponowanych na EBV zdolny do transformacji (pochodzący z komórek B95-8).
<img alt="Obraz z mikroskopii hodowli komórkowych przedstawiający kolonie o różnym stopniu konfluencji; analiza wzorców wzrostu komórek." src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wizualizacja skupisk komórek w komórkach zainfekowanych EBV. PBMC poddano działaniu FK506 i zainfekowano EBV. Komórki niezinfekowane (A) oraz eksponowane na EBV (B) zbadano tydzień po infekcji za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej (powiększenie 10X). Na zdjęciu C przedstawiono pięciotygodniową linię komórkową limfoblastoidalną.

<ol><li>Thorley-Lawson, D. A., Gross, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+the+Epstein-Barr+virus+and+the+origins+of+associated+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Persistence of the Epstein-Barr virus and the origins of associated lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 350, 1328-1337 (2004).</li>
<li>Kubuschok, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+spontaneous+Epstein-Barr+virus+lymphoblastoid+cell+lines+genetically+modified+to+express+tumor+antigen+as+cancer+vaccines%3A+mutated+p21+ras+oncogene+in+pancreatic+carcinoma+as+a+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Use of spontaneous Epstein-Barr virus lymphoblastoid cell lines genetically modified to express tumor antigen as cancer vaccines: mutated p21 ras oncogene in pancreatic carcinoma as a model.</a> Hum. Gene Ther. 13, 815-827 (2002).</li>
<li>Kuppers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+under+influence%3A+transformation+of+B+cells+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 801-812 (2003).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat. Med. 10, 871-875 (2004).</li>
<li>Bernasconi, N., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+serological+memory+by+polyclonal+activation+of+human+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.</a> Science. 298, 2199-2202 (2002).</li>
<li>Oh, H. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+rapid+establishment+of+Epstein-Barr+virus+immortalization+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes.</a> Cell Prolif. 36, 191-197 (2003).</li>
<li>Ventura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+simple+method+for+the+Epstein-Barr+virus+transformation+of+lymphocytes+from+members+of+large+families+of+Reunion+Island%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Hered%22%5BJournal%5D)">Use of a simple method for the Epstein-Barr virus transformation of lymphocytes from members of large families of Reunion Island.</a> Hum. Hered. 38, 36-43 (1988).</li>
<li>Henderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transformation+of+lymphocytes+by+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transformation of lymphocytes by Epstein-Barr virus.</a> Virology. 76, 152-163 (1977).</li>
<li>Bird, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Epstein-Barr+virus+activation+of+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Epstein-Barr virus activation of human B lymphocytes.</a> J. Exp. Med. 154, 832-839 (1981).</li>
<li>Neitzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+routine+method+for+the+establishment+of+permanent+growing+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">A routine method for the establishment of permanent growing lymphoblastoid cell lines.</a> Hum. Genet. 73, 320-326 (1986).</li>
<li>Pelloquin, F., Lamelin, J. P., Lenoir, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+lymphocytes+immortalization+by+Epstein-Barr+virus+in+the+presence+of+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B lymphocytes immortalization by Epstein-Barr virus in the presence of cyclosporin A.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. 22, 689-694 (1986).</li>
<li>Pressman, S., Rotter, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+prolonged+experience+with+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes: prolonged experience with technique.</a> Am. J. Hum. Genet. 49, 467-467 (1991).</li>
<li>Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus%3A+Transformation%2C+cytopathic+changes%2C+and+viral+antigens+in+squirrel+monkey+and+marmoset+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus: Transformation, cytopathic changes, and viral antigens in squirrel monkey and marmoset leukocytes.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 69, 383-387 (1972).</li>
<li>Megyola, C., Ye, J., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+sub-population+of+B+cells+that+proliferates+after+infection+with+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a sub-population of B cells that proliferates after infection with Epstein-Barr virus.</a> Virol. J. 8, 84-84 (2011).</li>
<li>Tosato, G., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metoda opisana w niniejszej pracy pozwala na generowanie LCL z krwi obwodowej dawcy z zachowaniem krótkiego czasu immortalizacji i krio konserwacji. Dzięki zastosowaniu FK506, leku immunosupresyjnego dla limfocytów T, oraz wysokich mian wirusa zakaźnego, jesteśmy w stanie promować proliferację zakażonych EBV limfocytów B z mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Interwencje te zwiększają wydajność opisanej metody, co skutkuje szybką ekspansją komórek do późniejszych eksperymentów.
Tradycyjnie transformację wzrostową monitorowano poprzez wizualizację skupisk komórek za pomocą mikroskopii świetlnej około tydzień po ekspozycji na EBV6, 15. Jednak tworzenie skupisk komórek nie jest specyficznym wskaźnikiem transformacji wzrostowej indukowanej przez EBV. Wcześniej wykazaliśmy możliwość spójnej identyfikacji proliferującej populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej14, co zapewnia dokładną i specyficzną metodę określenia pomyślnego wyniku już trzy dni po ekspozycji limfocytów B na EBV.

<table><tbody><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 928-250</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 2650</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana ciepłem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 4135</td><td></td></tr><tr><td>Medium do separacji limfocytów Ficoll Hypaque</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-072</td><td></td></tr><tr><td>FK506</td><td>A.G Scientific</td><td>F 1030</td><td></td></tr><tr><td>IgG z surowicy mysiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I 8765</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD23 sprzężone z PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555711</td><td></td></tr><tr><td>Myszia izotypowa IgG1 sprzężona z PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554680</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD58 sprzężone z FITC</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>MA1-82159</td><td></td></tr><tr><td>Myszia izotypowa IgG1 sprzężona z FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>550616</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD19 sprzężone z PE-Cy5</td><td>BD Biosciences</td><td>555414</td><td></td></tr><tr><td>Myszia izotypowa IgG1 sprzężona z PE-Cy5</td><td>Dako</td><td>X 0955</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Medium RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R 8758</td><td></td></tr><tr><td>Octan tetradekanoyloforbolu (TPA)</td><td>Calbiochem</td><td>407952</td><td></td></tr><tr><td>Bufor FACS (1X roztwór soli fosforanowej PBS + 5% płodowej surowicy bydlęcej)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie linii limfoblastoidalnych przekształconych przez wirusa epsteina-barr

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Zakażenie limfocytów B wirusem Epsteina-Barr (EBV) prowadzi do ich proliferacji i późniejszej unieśmiertelnienia, co skutkuje utworzeniem linii komórkowych limfoblastoidalnych (LCL) in vitro. Ponieważ LCL są zakażone EBV w sposób latentny, stanowią one system modelowy do badania latencji EBV oraz napędzanej przez wirusa proliferacji limfocytów B i tumorigenezy1. LCL były wykorzystywane do prezentacji antygenów w różnych testach immunologicznych2, 3. Ponadto LCL mogą być używane do generowania ludzkich przeciwciał monoklonalnych4, 5 i stanowią potencjalnie nieograniczone źródło materiału w sytuacjach, gdy dostęp do pierwotnych materiałów biologicznych jest ograniczony6, 7.
Opisano szereg metod generowania LCL. Wcześniejsze metody obejmowały stosowanie mitogenów, takich jak fitohemaglutynina, lipopolisacharyd8 oraz mitogen z fitolaki9, w celu zwiększenia wydajności immortalizacji indukowanej przez EBV. W ostatnim czasie inni autorzy stosowali leki immunosupresyjne, takie jak cyklosporyna A, aby zahamować zależne od limfocytów T niszczenie zainfekowanych limfocytów B7, 10-12.
Znaczny odstęp czasu od zakażenia EBV do utworzenia linii komórkowych sprawia, że istnieje zapotrzebowanie na szybsze i bardziej niezawodne metody transformacji wzrostu limfocytów B indukowanej przez EBV. Stosując kombinację EBV o wysokim mianie oraz czynnika immunosupresyjnego, jesteśmy w stanie konsekwentnie zakażać, transformować i generować LCL z limfocytów B krwi obwodowej. Metoda ta wykorzystuje niewielką ilość mononuklearnych komórek krwi obwodowej, które są zakażane in vitro, co pozwala na wykazanie skupisk komórek. Obecność CD23 wraz z EBV w obecności FK506, immunosupresanta komórek T. Tradycyjnie przyrost proliferujących limfocytów B monitoruje się poprzez wizualizację mikroskopijnych skupisk komórek około tydzień po zakażeniu EBV. Agregaty LCL są widoczne gołym okiem po kilku tygodniach. Opisujemy test umożliwiający wczesne określenie, czy transformacja wzrostu pośredniczona przez EBV zakończyła się sukcesem, jeszcze przed momentem, gdy można wykazać mikroskopijne skupiska komórek. Obecność komórek CD23hiCD58+ obserwowana już trzy dni po zakażeniu świadczy o pomyślnym wyniku.

Opisujemy metodę generowania przekształconych linii komórek B z wykorzystaniem wirusa Epstein-Barr. Przedstawiamy również nowatorski test, który pozwala zidentyfikować komórki B przeznaczone do transformacji już trzy dni po infekcji.

Tworzenie linii limfoblastoidalnych przekształconych przez wirusa Epsteina-Barr

Zakażenie limfocytów B wirusem Epsteina-Barra (EBV) prowadzi do ich proliferacji i późniejszej immortalizacji, co skutkuje utworzeniem linii limfoblastoidalnych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie linii komórkowych limfoblastów transformowanych wirusem Epsteina-Barr (LCL) z ludzkich limfocytów B. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację mononuklearnych komórek krwi obwodowej z ludzkiej krwi.Następnie komórki zakaża się wirusem Epsteina-Barr (EBV) w obecności FK 5 0 6 oraz czynników immunosupresyjnych. Od trzech do czterech dni po zakażeniu wirusem Epsteina-Barr pojawia się subpopulacja komórek charakteryzująca się wysoką ekspresją CD 23, pozytywnym wynikiem dla CD 58 i przewidywaną proliferacją. Liczbę komórek CD 23 high i CD 58 positive można określić za pomocą cytometrii przepływowej jako wskaźnik pomyślnego wyniku. Proliferujące komórki można dodatkowo zidentyfikować mikroskopowo i makroskopowo na podstawie skupisk linii komórkowych limfoblastów, które tworzą się w pomyślnie przekształconych kulturach komórkowych.Ostatnim krokiem jest namnożenie linii komórkowych limfoblastów w celu krio konserwacji. W moim laboratorium tworzymy linie komórkowe limfoblastów, tzw. LCL, aby zrozumieć interakcje między gospodarzem a wirusem Epsteina-Barra. Linie komórkowe limfoblastów budzą również szerokie zainteresowanie społeczności naukowej, w szczególności wirusologów, immunologów i biologów nowotworów.Jako stażysta podoktorski w laboratorium du Macintosh, zaprezentuję procedurę generowania linii komórkowych limfoblastów. Po pobraniu 10 ml krwi od dawcy, należy przenieść krew z heparyną do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie rozcieńczyć ją w stosunku jeden do dwóch. Po dodaniu do probówki 20 ml PBS w temperaturze pokojowej, należy podłożyć rozcieńczoną krew pod 15 ml medium do separacji limfocytów FICO HIA, a następnie wirować krew przy 225 ×g bez hamowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut w celu utworzenia gradientu.Następnie usuń warstwę białkową (buffy coat) i przenieś ją do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Uzupełnij objętość do 50 ml za pomocą PBS, a następnie odwiruj komórki przy 600 ×g przez 10 minut. Odlej nadsącz, resuspenduj osad w 50 ml PBS, a następnie dwa razy przemyj komórki w tych samych warunkach.Teraz resuspenduj komórki w jednym mililitrze kompletnego medium RPMI. Używam pięciu mikrolitrów komórek do wykonania rozcieńczenia 1:10 w barwniku trypanieżowym i do policzenia żywych komórek przy użyciu hemocytometru, a następnie używam kompletnego RPMI do dostosowania objętości w celu uzyskania stężenia komórek wynoszącego 2 × 10⁶ komórek na mililitr i przenoszę komórki do 25 cm² kolby do hodowli tkankowej.Aby przygotować komórki do infekcji wirusem Epsteina-Barr, dodaj FK 506 do kolby z hodowlą tkankową do stężenia końcowego 20 µM. Następnie umieść kolbę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37°C na jedną godzinę. Gdy inkubacja komórek dobiega końca, szybko rozmroź alikwot wirusa Epsteina-Barr, pozyskanego z komórek B 95 8. Następnie wyjmij kolbę z inkubatora i dodaj wirusa Epsteina-Barr do komórek w rozcieńczeniu 1:10; delikatnie zakręć kolbę, aby wymieszać wirusa Epsteina-Barr z roztworem, a następnie umieść kolbę pionowo w inkubatorze z założonym korkiem, lecz lekko poluzowanym w przypadku użycia kolby niewentylowanej, na dwa do trzech tygodni przed ekspansją hodowli do krio konserwacji.Tydzień po eps, czyli zakażeniu wirusem Epsteina-Barr, w badaniu mikroskopowym światłem widoczne są skupiska komórek, co przedstawia ta reprezentatywna figura wczesnych skupisk mikroskopowych. Wraz z upływem czasu skupiska te powiększają się, tak że w kolbie widoczne stają się makroskopowe aglomeraty, co ukazano na tej figurze, gdzie obserwuje się większe skupiska LCL podczas dokarmiania komórek i podwajania objętości pożywki w kolbie hodowlanej w 12. dniu. Gdy pożywka zmienia kolor na żółty, co zazwyczaj dzieje się raz w tygodniu, jest to zazwyczaj moment na dokarmienie komórek w celu ich namnożenia oraz dwu- lub trzykrotnego zwiększenia objętości hodowli.Używając pełnego medium RPMI, w ciągu następnych kilku tygodni zwiększ objętość hodowli do 70–100 ml w kolbie o powierzchni 75 cm², aby uzyskać komórki do kriokonserwacji; pomyślny wynik jest zapowiadany przez obecność komórek CD 23 oraz wysoką ekspresję CD 58, co widać na tym wykresie rozrzutu. Około 2–3% żywych komórek w trzecim lub czwartym dniu po ekspozycji na wirusa Epsteina-Barr (EBV) wykazuje taki profil; inne subpopulacje komórek CD 23 pozytywnych, CD 23 negatywnych, CD 58 pozytywnych oraz CD 58 negatywnych zaobserwowane po ekspozycji na EBV wykazują minimalną proliferację, natomiast komórki niezakażone lub zakażone nieuniezmieniającym szczepem EBV nie wykazują wysokiej ekspresji CD 23.Komórki wykazujące ekspresję CD 58. Komórki można również obserwować za pomocą mikroskopii świetlnej. Jak wspomniano, w ciągu tygodnia od zakażenia wirusem Epsteina-Barr w kolbie widoczne są pod mikroskopem świetlnym małe skupiska komórek.W miarę upływu czasu i przekształcania się komórek w LCL, skupiska widoczne pod mikroskopem powiększają się, tak że w kolbie stają się widoczne makroskopowe agregaty. Dobrze. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat izolacji mononuklearnych komórek krwi obwodowej z krwi ludzkiej oraz generowania linii komórkowych limfoblastów transformowanych wirusem Epsteina-Barr z ludzkich limfocytów B, mimo że generowanie linii komórkowych limfoblastów zostało opisane przez inne laboratoria.Zaletą naszego protokołu jest to, że dostarcza on badaczom metody pozwalającej przewidzieć pomyślny wynik już trzy do czterech dni po zakażeniu limfocytów B wirusem Epsteina-Barr.

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ustanowienie linii komórkowych limfoblastoidów przekształconych we wzrost wirusa Epsteina-Barr

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Mięsak Kaposiego (KS) to nowotwór wywołany przez zakażenie wirusem onkogennym ludzkim herpeswirusem-8/herpeswirusem KS (HHV-8/KSHV). Opisany tutaj model hodowli komórek śródbłonka jest wyjątkowo odpowiedni do badania mechanizmów, za pomocą których KSHV przekształca komórki gospodarza.

Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

Prosta metoda lizy czerwonych krwinek do tworzenia B-LCL została opracowana z wysoką efektywnością nieśmiertelności, wymagając niewielkiej ilości krwi i oszczędzając czas od inicjacji do krioprezerwacji.

Prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów B

Prosta metoda pozyskiwania klonów komórek NK i T od pacjentów z CAEBV została opracowana z wysoką wydajnością, niewielką ilością krwi obwodowej i niską dawką IL-2.

Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

Opisujemy metodę łączącą kulki immunomagnetyczne i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolowania i analizowania zdefiniowanych subpopulacji komórek odpornościowych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (monocyty, limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+, limfocyty B i komórki NK). Za pomocą tej metody można oczyścić i przeanalizować komórki znakowane magnetycznie i fluorescencyjnie.

Oddzielenie subpopulacji komórek odpornościowych w próbkach krwi obwodowej od dzieci z mononukleozą zakaźną

Ten protokół pozwala na izolację cząsteczek wirusa Epsteina-Barr z ludzkiej linii komórkowej P3HR1 po wywołaniu cyklu litycznego wirusa za pomocą 12-mirystynianu 13-octanu forbolu. DNA jest następnie ekstrahowane z preparatu wirusowego i poddawane PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia stężenia cząstek wirusa.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1

W tym filmie prezentujemy protokół tworzenia linii komórkowych chłoniaka grasiczego myszy. Postępując zgodnie z tym protokołem, z sukcesem stworzyliśmy kilka linii komórek T z myszy Atm-/- i p53-/- z chłoniakiem grasiczym.

Wytwarzanie linii komórkowych limfomy grasicy z myszy Atm-/- i p53-/-

Poznaj metodę generowania linii komórkowych limfoblastoidów z ludzkich limfocytów B przy użyciu wirusa Epsteina-Barr. Protokół umożliwia wczesną predykcję transformacji już po trzech dniach od zakażenia.

Tworzenie linii limfoblastoidalnych przekształconych przez wirusa Epsteina-Barr

Przeglądaj więcej filmów