Tworzenie linii limfoblastoidalnych przekształconych przez wirusa Epsteina-Barr

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie linii komórkowych limfoblastów transformowanych wirusem Epsteina-Barr (LCL) z ludzkich limfocytów B. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację mononuklearnych komórek krwi obwodowej z ludzkiej krwi.

Następnie komórki zakaża się wirusem Epsteina-Barr (EBV) w obecności FK 5 0 6 oraz czynników immunosupresyjnych. Od trzech do czterech dni po zakażeniu wirusem Epsteina-Barr pojawia się subpopulacja komórek charakteryzująca się wysoką ekspresją CD 23, pozytywnym wynikiem dla CD 58 i przewidywaną proliferacją. Liczbę komórek CD 23 high i CD 58 positive można określić za pomocą cytometrii przepływowej jako wskaźnik pomyślnego wyniku. Proliferujące komórki można dodatkowo zidentyfikować mikroskopowo i makroskopowo na podstawie skupisk linii komórkowych limfoblastów, które tworzą się w pomyślnie przekształconych kulturach komórkowych.

Ostatnim krokiem jest namnożenie linii komórkowych limfoblastów w celu krio konserwacji. W moim laboratorium tworzymy linie komórkowe limfoblastów, tzw. LCL, aby zrozumieć interakcje między gospodarzem a wirusem Epsteina-Barra. Linie komórkowe limfoblastów budzą również szerokie zainteresowanie społeczności naukowej, w szczególności wirusologów, immunologów i biologów nowotworów.

Jako stażysta podoktorski w laboratorium du Macintosh, zaprezentuję procedurę generowania linii komórkowych limfoblastów. Po pobraniu 10 ml krwi od dawcy, należy przenieść krew z heparyną do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie rozcieńczyć ją w stosunku jeden do dwóch. Po dodaniu do probówki 20 ml PBS w temperaturze pokojowej, należy podłożyć rozcieńczoną krew pod 15 ml medium do separacji limfocytów FICO HIA, a następnie wirować krew przy 225 ×g bez hamowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut w celu utworzenia gradientu.

Następnie usuń warstwę białkową (buffy coat) i przenieś ją do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Uzupełnij objętość do 50 ml za pomocą PBS, a następnie odwiruj komórki przy 600 ×g przez 10 minut. Odlej nadsącz, resuspenduj osad w 50 ml PBS, a następnie dwa razy przemyj komórki w tych samych warunkach.

Teraz resuspenduj komórki w jednym mililitrze kompletnego medium RPMI. Używam pięciu mikrolitrów komórek do wykonania rozcieńczenia 1:10 w barwniku trypanieżowym i do policzenia żywych komórek przy użyciu hemocytometru, a następnie używam kompletnego RPMI do dostosowania objętości w celu uzyskania stężenia komórek wynoszącego 2 × 10⁶ komórek na mililitr i przenoszę komórki do 25 cm² kolby do hodowli tkankowej.

Aby przygotować komórki do infekcji wirusem Epsteina-Barr, dodaj FK 506 do kolby z hodowlą tkankową do stężenia końcowego 20 µM. Następnie umieść kolbę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37°C na jedną godzinę. Gdy inkubacja komórek dobiega końca, szybko rozmroź alikwot wirusa Epsteina-Barr, pozyskanego z komórek B 95 8. Następnie wyjmij kolbę z inkubatora i dodaj wirusa Epsteina-Barr do komórek w rozcieńczeniu 1:10; delikatnie zakręć kolbę, aby wymieszać wirusa Epsteina-Barr z roztworem, a następnie umieść kolbę pionowo w inkubatorze z założonym korkiem, lecz lekko poluzowanym w przypadku użycia kolby niewentylowanej, na dwa do trzech tygodni przed ekspansją hodowli do krio konserwacji.

Tydzień po eps, czyli zakażeniu wirusem Epsteina-Barr, w badaniu mikroskopowym światłem widoczne są skupiska komórek, co przedstawia ta reprezentatywna figura wczesnych skupisk mikroskopowych. Wraz z upływem czasu skupiska te powiększają się, tak że w kolbie widoczne stają się makroskopowe aglomeraty, co ukazano na tej figurze, gdzie obserwuje się większe skupiska LCL podczas dokarmiania komórek i podwajania objętości pożywki w kolbie hodowlanej w 12. dniu. Gdy pożywka zmienia kolor na żółty, co zazwyczaj dzieje się raz w tygodniu, jest to zazwyczaj moment na dokarmienie komórek w celu ich namnożenia oraz dwu- lub trzykrotnego zwiększenia objętości hodowli.

Używając pełnego medium RPMI, w ciągu następnych kilku tygodni zwiększ objętość hodowli do 70–100 ml w kolbie o powierzchni 75 cm², aby uzyskać komórki do kriokonserwacji; pomyślny wynik jest zapowiadany przez obecność komórek CD 23 oraz wysoką ekspresję CD 58, co widać na tym wykresie rozrzutu. Około 2–3% żywych komórek w trzecim lub czwartym dniu po ekspozycji na wirusa Epsteina-Barr (EBV) wykazuje taki profil; inne subpopulacje komórek CD 23 pozytywnych, CD 23 negatywnych, CD 58 pozytywnych oraz CD 58 negatywnych zaobserwowane po ekspozycji na EBV wykazują minimalną proliferację, natomiast komórki niezakażone lub zakażone nieuniezmieniającym szczepem EBV nie wykazują wysokiej ekspresji CD 23.

Komórki wykazujące ekspresję CD 58. Komórki można również obserwować za pomocą mikroskopii świetlnej. Jak wspomniano, w ciągu tygodnia od zakażenia wirusem Epsteina-Barr w kolbie widoczne są pod mikroskopem świetlnym małe skupiska komórek.

W miarę upływu czasu i przekształcania się komórek w LCL, skupiska widoczne pod mikroskopem powiększają się, tak że w kolbie stają się widoczne makroskopowe agregaty. Dobrze. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat izolacji mononuklearnych komórek krwi obwodowej z krwi ludzkiej oraz generowania linii komórkowych limfoblastów transformowanych wirusem Epsteina-Barr z ludzkich limfocytów B, mimo że generowanie linii komórkowych limfoblastów zostało opisane przez inne laboratoria.

Zaletą naszego protokołu jest to, że dostarcza on badaczom metody pozwalającej przewidzieć pomyślny wynik już trzy do czterech dni po zakażeniu limfocytów B wirusem Epsteina-Barr.