Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Cześć, nazywam się Ryan O'Mara, jestem doktorantem z Uniwersytetu w Ottawie i Instytutu Badawczego Szpitala w Ottawie. Protokół ten opisze metody wytwarzania wzbogaconych populacji komórek prekursorowych oligodendrocytów od myszy, które mogą być różnicowane samodzielnie lub w połączeniu z neuronami zwojowymi korzenia grzbietowego myszy w celu wytworzenia mielinizujących zimnych kultur. Zacznijmy przedstawiać krótki przegląd procedury.

Nowonarodzone mysie dziedzińce są dysocjowane i sadzone w kolbach T 25. Po dziewięciodniowym okresie hodowli na podstawie kolby tworzy się monowarstwa astrocytów, na której proliferują komórki prekursorowe oligodendrocytów. Komórki prekursorowe oligodendrocytów są następnie uzyskiwane i oczyszczane, a następnie mogą być różnicowane w dojrzałe oligodendrocyty we wzbogaconej kulturze.

Jeśli pożądane są mielinizujące się kultury ko. Neurony zwojowe korzenia Doce od myszy P 5 do P 10 są hodowane wraz z mieszanymi kulturami glejowymi. W ciągu dziewięciu dni neurony te tworzą gęste złoże neurytowe, na którym mogą zostać wysiane komórki prekursorowe oligodendrocytów.

Pozwala to na owijanie neurytów za pośrednictwem oligodendrocytów, co skutkuje mielinizacją zimnej kultury. Najpierw całe mózgi od P zero do P dwie myszy umieszcza się w lodowatym MEM i przenosi do mikroskopu preparacyjnego za pomocą skalpela, który przecina warstwę oponową każdej kory w sposób podłużny, a następnie podważa opony mózgowe z leżącej poniżej kory. Następnie usuń opuszki węchowe brzuszną stroną mózgu do góry.

Wykonaj głębokie podłużne nacięcia w miejscu, w którym kora styka się z brzusznym cefalonem Mózgiem grzbietową do góry podważ korę, a następnie pokrój kord w kostkę na około cztery kawałki każdy. Przenieś korę do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 350 mikrolitrów lodu. MEM na mózg.

Mózgi o tym samym genotypie są zebrane w tej samej probówce, tak że cztery mózgi wymagałyby 1400 mikrolitrów MEM. Po zakończeniu sekcji przenieś zebrane mózgi do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni na trzy minuty. Następnie, w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej, przełóż fragmenty mózgu przez końcówkę pipety P 1000, aby rozbić je na mniejsze kawałki.

Dodaj 75 mikrolitrów wstępnie rozgrzanego bólu OPC Pap na mózg do stożkowej rurki. Następnie inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni przez 20 minut. Odwracanie rurki co dwie minuty, aby zapobiec agregacji tkanek.

Po zakończeniu inkubacji dodaj dwa mililitry mieszanej kultury glejowej. Pożywkę na mózg do strawienia, odstawić na 10 minut. Po 10 minutach podwielokrotność zawiesiny tkankowej rozdzielić na pięć mililitrowych plastikowych probówek.

Liczba probówek powinna odpowiadać liczbie mózgów w preparacie za pomocą pipety do pastwiska z polerowania płomieniowego na pastwisko na początku powoli przesuwaj zawartość każdej probówki, a następnie z rosnącą intensywnością, gdy kawałki zaczynają się dysocjować. Przerwę tri rating, gdy w zawiesinie nie pozostały żadne widoczne kawałki tkanki. Zebrać zawartość każdej probówki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów zawierającej cztery mililitry mieszanej kultury glejowej.

Pożywka na mózg po kilkukrotnym delikatnym odwróceniu probówki, podwielokrotność zawiesiny komórek do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Liczba probówek powinna odpowiadać liczbie mózgów w preparacie, odwirować probówki pod 300-krotnością grawitacji przez pięć minut i zawiesić granulki w jednym mililitrze mieszanej pożywki do hodowli glejowej. Dodać zawieszone komórki z każdej stożkowej probówki do kolb T 25 pokrytych poli lizyną i lizyną, które zostały wstępnie zrównoważone z pięcioma mililitrami mieszanych pożywek do hodowli glejowych.

Liczba kolb powinna być równa liczbie mózgów wypreparowanych, inkubować kolby i w inkubatorze 37 stopni przy 8,5% CO2. Po trzech do czterech godzinach komórki należy przykleić do podłoża. Jednak w pożywce pozostanie wiele zanieczyszczeń, które mogą niekorzystnie wpłynąć na żywotność komórek.

Aby tego uniknąć, po trzech do czterech godzinach zastąp pożywkę świeżą mieszaną pożywką do hodowli gleju, tak jak to możliwe. Ta zmiana pożywki usuwa większość zanieczyszczeń komórkowych. Następnego dnia.

Na dnie kolby powinno być widocznych wiele komórek. Trzeciego dnia na podstawie kolby powinna tworzyć się monowarstwa astrocytów. W tym momencie wykonaj zmianę nośnika o dwie trzecie, usuwając cztery mililitry nośnika i dodając z powrotem cztery mililitry świeżego nośnika.

Ten krok należy powtarzać co trzy dni. Szóstego dnia powinna być wyraźnie widoczna monowarstwa astrocytów, na której proliferują komórki prekursorowe oligodendrocytów. W tym momencie uzupełnij pożywkę hodowlaną insuliną o końcowym stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr dziewiątego dnia, komórki prekursorowe oligodendrocytów są gotowe do oddzielenia od monowarstwy astrocytów.

W tym celu należy umieścić kolby na wytrząsarce orbitalnej i inkubatorze o stężeniu 5% CO2. Pozostawić kolbę do poziomu zbliżonego do inkubatora przez jedną godzinę. Następnie potrząsaj komórkami z prędkością 50 obr./min przez 45 minut.

Ten krok usuwa wiele luźno przylegających komórek zanieczyszczających. Wykonaj pełną zmianę pożywki, usuwając wszystkie pożywki i dodając z powrotem cztery mililitry świeżej pożywki hodowlanej. Umieścić kolbę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i pozostawić do wyrównania na trzy godziny.

Po trzech godzinach sprawdź zabarwienie pożywek hodowlanych. Pożywka hodowlana powinna być czerwona, co wskazuje na zrównoważone pH. Jeśli kolor jest pomarańczowy lub fioletowy, odpowiednio dostosuj poziom CO2 w inkubatorze.

Utrzymanie zrównoważonego pH jest ważne dla przetrwania komórek prekursorowych oligodendrocytów podczas nocnego wstrząsania. Po osiągnięciu zrównoważonego pH wstrząsać kolbą z prędkością 220 obr./min przez około 16 godzin. Następnego ranka wyjmij kolbę z wytrząsarki i przenieś pożywkę z kolb na 10-centymetrowe szalki do hodowli tkankowych.

Naczynia te posłużą jako środek do dalszego oczyszczania komórek prekursorowych oligodendrocytów poprzez adhezję różnicową. Każde naczynie powinno przyjmować pożywkę z dwóch kolb, inkubować szalki w 5% CO2 przez 30 minut. Po upływie 15 minut delikatnie szturchnij każde naczynie, aby zapobiec przyleganiu komórek prekursorowych oligodendrocytów do plastiku.

Po 30-minutowej inkubacji zbadaj szalki pod kątem kontrastu fazowego. Komórki prekursorowe oligodendrocytów są widoczne jako małe skupiska komórek. Niektóre z tych komórek mogły przylgnąć do naczynia.

Poluzuj przylegające komórki prekursorowe oligodendrocytów z naczynia przez delikatne mieszanie. Ostrożnie. Zbyt duże pobudzenie może spowodować rozluźnienie zanieczyszczających typów komórek.

Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i wiruj przy 300-krotności grawitacji przez pięć minut. Delikatnie zawiesić osad za pomocą końcówki do pipety P 1000. Następnie zlicza się końcówką pipety P 200, komórki za pomocą hemocytometru, oczyszczone oligodendrocyty można następnie umieścić na pokrytych laminatem szkiełkach nakrywkowych w celu różnicowania we wzbogacone kultury oligodendrocytów w pierwszym dniu.

Po wysiewie wzbogacone komórki prekursorowe oligodendrocytów mają stosunkowo prostą morfologię rozciągającą się tylko na kilka procesów. Do trzeciego dnia różnicujące się oligodendrocyty rozszerzyły liczne procesy przypominające niedojrzałe oligodendrocyty. Szóstego dnia oligodendrocyty rozciągnęły mielinę jak błoniaste arkusze w dowolnym momencie w tym czasie.

Kartki nakrywkowe kursu można naprawić i przetworzyć pod kątem chemii immunocytochemicznej. Zamiast wysiewać oczyszczone komórki prekursorowe oligodendrocytów na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą, można je wysiewać na złoża neurytów zwoju korzenia grzbietowego w celu wytworzenia mielinizujących kultur ko. W następnej sekcji zostaną opisane metody produkcji tych kultur.

Na początek wyizoluj całe kolce od myszy P pięć do P 10 i przenieś je do mikroskopu preparacyjnego za pomocą nożyczek preparacyjnych. Przeciąć brzuszny przyśrodkowy obszar kręgosłupa w sposób podłużny. Ostrożnie usuń zwoje korzenia grzbietowego lub DRG za pomocą czterech cienkich końcówek.

Przenieś zwoje do buforowanego roztworu soli Hanka na szalce Petriego. Przytnij wszelkie DRG z ich nadmiernie długich korzeni. Za pomocą końcówki do pipet knurów o szerokości P 1000.

Przenieś zwoje do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Trzymaj probówkę na lodzie, dopóki wszystkie myszy nie zostaną przetworzone. Po zakończeniu izolacji DRG odwirować probówkę pod ciśnieniem około 300-krotności grawitacji.

Przenieść probówkę do sterylnego kaptura do hodowli tkanek i usunąć supernat. Dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej papiny DRG do probówki i inkubuj w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni przez 10 minut. Gdy trawienie pepanu zakończy się całkowitym odwirowaniem, zastąp roztwór Papine.

Z 500 mikrolitrami wstępnie ciepłej kolagenazy roztworu inkubować w temperaturze 37 stopni przez 10 minut. Powtórzyć etap wirowania i zastąpić roztwór kolagenazy A jednym mililitrem pożywki hodowlanej DRGN. Po naszym ostatnim etapie wirowania dodaj jeden mililitr pożywki DRGN i za pomocą pipety do pastwiska ze szkła polerowanego płomieniem tri.

Na początku oceń zwoje powoli, a następnie ze zwiększoną intensywnością, gdy tkanka zacznie się dysocjować. Gdy nie widać już żadnych fragmentów tkanki, przenieś zawiesinę komórek na szalkę Petriego zawierającą siedem mililitrów pożywki DRGN. Inkubuj naczynie i inkubator w temperaturze 37 stopni przy 8,5% CO2 przez jedną i kwadrans.

Po tej inkubacji obserwuj szalkę Petriego. W kontraście fazowym neurony DRG są udowodnione jako duże komórki. Wiele zanieczyszczających komórek powinno być mocno przyklejonych do szalki Petriego.

Przenieś pożywkę do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i przepłucz naczynie czterema mililitrami pożywki DRGN, aby zebrać pozostałe neurony. Odwirować stożkową rurkę przy 300-krotności grawitacji przez pięć minut. Ponownie zawiesić powstały granulat i 500 mikrolitrów pożywki DRGN.

Policz komórki za pomocą cytometru HEO. Pamiętaj, aby policzyć neurony DRG tylko od 30 do 50 000 neuronów na 12-milimetrowe szkiełko nakrywkowe pokryte laminatem w jednym mililitrze kultury pożywki DRGN. Komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych 8,5% CO2.

Następnego ranka wykonaj pełną wymianę pożywki, zastępując pożywkę DRGN pożywką ol uzupełnianą 10 mikromolowym FUD R co drugi dzień. Następnie wykonaj trzy czwarte zmiany pożywki za pomocą pożywki OL uzupełnionej FUD r Podczas badania pod mikroskopem kontrastu fazowego w pierwszym dniu, neurony zaczęły wydłużać kilka procesów. W trzecim dniu procesy neuronalne uległy wydłużeniu.

W szóstym dniu rozwija się złoże neurytowe złożone z wielu przemieszanych procesów. W dziewiątym dniu to złoże neurytowe ma zwiększoną gęstość i jest gotowe do przyjęcia oligodendrocytów przez wzrost mieszanych kultur mózgu. Wraz z kulturami neuronów, komórki prekursorowe oligodendrocytów mogą być oczyszczane w dziewiątym dniu hodowli neuronów.

Następnie można je usadzić na łóżkach neurytowych. Dodając 50 000 komórek do każdej studzienki w naczyniu z 24 dołkami. W szóstym dniu kohodowli można zaobserwować interakcje komórek przypominających oligodendrocyty z neuronami DRG.

Kultury te można teraz utrwalić i przetworzyć pod kątem chemii immunologicznej. Gdy wzbogacone kultury oligodendrocytów są znakowane przeciwciałami przeciwko markerom oligodendrocytów, wykazano, że NG two mag i MVP immunologicznie dodatnie komórki wykazują morfologie specyficzne dla etapu. Kultury te powstają jako populacja NG dwóch dodatnich prekursorów oligodendrocytów i w ciągu sześciu dni różnicowania wytwarzają dojrzałe oligodendrocyty mag-dodatnie.

Kiedy strona SDS jest wykonywana na lizatach uzyskanych z kultur wzbogaconych w oligodendrocyty, można zauważyć, że oligodendrocyty wyrażają CNPP i MVP w ciągu sześciu dni. Patrząc na neurony DRG przed dodaniem oligodendrocytów, w dziewiątym dniu widoczne są gęste pokłady neurytów Taj one i neurofilament-dodatnie. W szóstym dniu kohodowli neuronów oligodendrocytów DRG można zaobserwować wiele oligodendrocytów MBP dodatnich w interakcji z neurytami neuronów w większym powiększeniu.

Obserwuje się, że oligodendrocyty owijają te neuryty błoną MBP dodatnią, przypominającą mielinizację, widok w powiększeniu cyfrowym pokazuje zakres nakładania się błony dodatniej MVP na proces dodatni neurofilamentu. Cześć, nazywam się Scott Ryan i jestem doktorem habilitowanym w Instytucie Badawczym Szpitala w Ottawie. Techniki te umożliwiają generowanie systemów kohodowli liga, endocytów i neuronów DRG od myszy.

Technika ta jest cenna w badaniu zarówno eksperymentalnie indukowanych, jak i transgenicznych modeli choroby mielinizacyjnej. Jest również skuteczny w badaniach przesiewowych nowych związków terapeutycznych.