Name: Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Poznaj metody wyprowadzania wzbogaconych kultur oligodendrocytów z tkanek noworodkowych myszy oraz tworzenia kokultur mielinizujących z neuronami DRG. Protokół umożliwia badanie biologii mielinizacji w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany z grantu Kanadyjskiego Towarzystwa Stwardnienia Rozsianego dla R.K. R.W.O jest laureatem stypendium Kanadyjskiego Towarzystwa Stwardnienia Rozsianego. S.D.R jest stypendystą Kanadyjskiego Towarzystwa Stwardnienia Rozsianego i Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem.

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W niniejszym raporcie opisano metodę izolowania mysich OPC w celu różnicowania w kulturach wzbogaconych w OL lub kokulturach OL/DRGN. Podczas samodzielnej hodowli OPC różnicują się w MBP+ve OL, wytwarzając błoniaste arkusze podobne do mieliny. Po dodaniu do złoża neurytów DRGN, neuryty DRGN otaczają je membraną MBP+ve . Model ten jest korzystny dla badania złożonych podstaw rządzących powłoką aksonalną, w której pośredniczy OL.
Chociaż ma to wielką wartość, ustanowienie takich kultur jest technicznie trudne. W szczególności wymagające aspekty obejmują efektywne trawienie/dysocjację tkanek, utrzymanie zrównoważonego pH pożywek hodowlanych oraz zmiany pożywek DRGN. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że długość trawienia, ilość trawionej tkanki i ilość rozcierania wpływa na skuteczność i końcowy wynik dysocjacji tkanek. Nie jest niczym niezwykłym, że doświadczeni badacze uzyskują niską wydajność komórkową z dysocjowanych tkanek układu nerwowego. Ponadto mysie OPC są zwykle wrażliwe na zmiany pH pożywki hodowlanej, szczególnie w warunkach zasadowych. Utrzymanie kultur na poziomie 8,5% CO2 ma na celu zapobieżenie temu, ponieważ OPC wydają się lepiej tolerować lekko kwaśne warunki niż zasadowe. Jeśli chodzi o karmienie DRGN, zmiany pożywki muszą być wykonywane szybko, aby nie wysuszyć neuronów, jednak muszą być delikatne, aby nie zakłócić rozwijającego się łożyska neurytowego. Nagłe zmiany podłoża mogą spowodować przemieszczenie złoża neurytów z podłoża i prawdopodobnie spowodować jego całkowitą dysocjację od szkiełka nakrywkowego.
Potencjalne zalety tego modelowego systemu znacznie przyćmiewają jego wymagający technicznie charakter. Jedną z zalet tego systemu jest wykorzystanie myszy po urodzeniu do uzyskania hodowli komórkowych, co pozwala uniknąć konieczności poświęcania samic hodowlanych w celu pobrania tkanki embrionalnej. Kolejną zaletą jest brak wymogu stosowania czynników wzrostu (GF) do ekspansji OPC. Mieszane kultury glejowe zapewniają środowisko, które wspiera rozmnażanie OPC, prawdopodobnie ze względu na obecność czynników troficznych pochodzących z astrocytów. Inne metody, takie jak wyprowadzanie za pomocą neurosfer7,8, opierają się na mitogennych właściwościach GF, takich jak podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) do ekspansji OPC. Podobnie, użycie myszy po urodzeniu (P5-10) do DRGN pozwala uniknąć konieczności uzupełniania pożywki hodowlanej o czynnik wzrostu nerwów (NGF), czynnik neurotroficzny wymagany do przeżycia in vitro zarodkowych DRGN 9, 10. Interesujące jest unikanie stosowania NGF, ponieważ negatywnie wpływa on na zdolność mielinizacyjną OL podczas hodowli z DRGNs 4. Unikanie stosowania pożywek z dodatkiem GF przynosi również korzyści ekonomiczne, ponieważ odczynniki te stają się kosztowne, gdy są stosowane na dużą skalę.
Być może najważniejszą zaletą tego modelu hodowli jest jego pochodzenie z tkanek wyłącznie myszy, co daje możliwość uzyskania zarówno OPC, jak i DRGN z szerokiej gamy transgenicznych linii myszy. Pozwala to na badanie zarówno właściwości specyficznych dla DRGN, jak i/lub OPC, które rządzą mielinizacją. Będzie to szczególnie ważne dla wyjaśnienia interakcji receptor/ligand regulujących mielinizację aksonów za pośrednictwem OL. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta ma ogromną wartość w odniesieniu do badań neurobiologicznych ze względu na jej zastosowania w zrozumieniu sygnałów molekularnych leżących u podstaw mielinizacji.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Multicell</td><td></td> <td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Podłoża (MEM)</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (Pen/Strep)</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Poli-l-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko oczyszczone merozyną (LN2)</td><td>EMD Millipore</td><td>CC085</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany szczurzy rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF)</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>L-tyroksyna</td><td>Biochemika</td><td>89430</td><td></td></tr><tr><td>Holotransferyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>0080085-SA</td><td></td></tr><tr><td>Insulina bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5- Triiodo-L-tyronina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>5-fluoro-2'-deoksyurydyna (FuDR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór papainy</td><td>Worthington Biochemiczny</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche Group</td><td>1010159001</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Cellstar</td><td>662-160</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych T25 z nasadką odpowietrzającą</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Grupa Roche</td><td>103578</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 50 &mu; Filtr m (opcjonalnie)</td><td>PARTEC</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko zasadowemu białku mieliny (MBP)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA409S</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało NG2</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało glikoproteiny związanej z mieliną (MAG)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1567</td><td></td></tr><tr><td>2',3'-cykliczny nukleotyd 3'-fosfodiesterazy (CNP)</td><td>Covance</td><td>SMI-91R-100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Actin pan Ab-5 </td><td>Fitzgerald</td><td>10R-A106AX</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Neurofilament-200 (NF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4142</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko łańcuchowi beta-3 tubuliny (Tuj1)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB5544</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 kozie przeciwciało antyszczurze (IgG) (H+L) drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A21247</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)-HRP sprzężone drugorzędowe</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H+L)-HRP sprzężone przeciwciało drugorzędowe</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-2065</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przepisy medialne <silny>100X Suplement OL* <table border="1"> <tbody> <tr><td>Składnik</td><td> Ilość do dodania</td> </tr> <tr><td>DMEM</td><td>100 mL</td> </tr> <tr><td>BSA</td><td>1,02 g</td> </tr> <tr><td>Progesteron</td><td>0,6 mg</td> </tr> <tr><td>putrescyna</td><td>161 mg</td> </tr> <tr><td>Selenin sodu</td><td>0,05 mg</td> </tr> <tr><td>3,3',5-Trijodo-L-tyronina</td><td>4 mg</td> </tr> </tbody> </table>*Przechowywać przy -80 &deg; C w 250 &mu; L porcje OL media<table border="1"> <tbody> <tr><td>Składnik</td><td>Ilość do dodania</td> </tr> <tr><td>DMEM</td><td>23,75 mL</td> </tr> <tr><td>100X OL-Suplement</td><td>250 &mu; L</td> </tr> <tr><td>Insulina bydlęca (od 1 mg/ml insuliny podstawowej)</td><td>125 &mu; L</td> </tr> <tr><td>GlutaMAX</td><td>250 &mu; L</td> </tr> <tr><td>Holotransferyna (z zapasów 33 mg/ml)</td><td>37,5 &mu; L</td> </tr> <tr><td>B27 Suplement</td><td>500 &mu; L</td> </tr> <tr><td>FBS</td><td>125 &mu; L</td> </tr> <tr><td>CNTF (od 50 ng/&mu; L zapasy)</td><td>25 &mu; L</td> </tr> </tbody> </table>Mieszane podłoża do hodowli glejowych (wykonane w DMEM)<table border="1"> <tbody> <tr><td>Składnik</td><td>Końcowe stężenie </td> </tr> <tr><td>FBS</td><td>10%</td> </tr> <tr><td>Pen/Strep (0,33% od magazynu)</td><td>33 jednostek/ml Penicyliny i 33 &mu; g/mL Streptomycyny</td> </tr> <tr><td>GlutaMAX</td><td>1%</td> </tr> </tbody> </table> DRGN media (utworzone w DMEM) <table border="1"> <tbody> <tr><td>Składnik</td><td>Końcowe stężenie </td> </tr> <tr><td>FBS</td><td>10%</td> </tr> <tr><td>Pen/Strep (1% z magazynu)</td><td>100 jednostek/ml Penicyliny i 100 &mu; g/ml Streptomycyny</td> </tr> </tbody> </table>Przepisy na roztwór trawienny: OPC roztwór papainy (złożony z MEM)<table border="1"> <tbody> <tr><td>Składnik</td><td>Stężenie końcowe </td> </tr> <tr><td>roztwór papainy</td><td>1,54 mg/ml</td> </tr> <tr><td>L-cysteina</td><td>360 &mu; g/mL</td> </tr> <tr><td>DNaseI</td><td>60 &mu; g/mL</td> </tr> </tbody> </table> DRG roztwór papainy (złożony z HBSS) <table border="1"> <tbody> <tr><td>Składnik</td><td>Końcowe stężenie </td> </tr> <tr><td>papaina</td><td>1,54 mg/ml</td> </tr> <tr><td>L-cysteina</td><td>360 &mu; g/mL</td> </tr> </tbody> </table> DRG Roztwór kolagenazy A (złożony w HBSS) <table border="1"> <tbody> <tr><td>Składnik</td><td>Stężenie końcowe </td> </tr> <tr><td>Kolagenaza A</td><td>4 mg/ml</td> </tr> </tbody> </stół></td></tr></tbody></table>

wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identyfikacja mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju OL jest nie tylko kluczowa dla pogłębienia naszej wiedzy na temat biologii, ale ma również implikacje dla zrozumienia patogenezy chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (MS). Rozwój komórkowy jest powszechnie badany za pomocą pierwotnych modeli hodowli komórkowych. Pierwotna hodowla komórkowa ułatwia ocenę danego typu komórek poprzez zapewnienie kontrolowanego środowiska, wolnego od zmiennych zewnętrznych, które są obecne in vivo. Podczas gdy kultury OL pochodzące od szczurów dostarczyły ogromnego wglądu w biologię OL, podobne wysiłki zmierzające do ustanowienia kultur OL od myszy napotkały poważne przeszkody. Opracowanie metod hodowli mysich pierwotnych OL jest konieczne, aby można było wykorzystać dostępne transgeniczne linie myszy. 
Opisano wiele metod ekstrakcji OPC z tkanek gryzoni, począwszy od wyprowadzania neurosfery, różnicowego oczyszczania adhezji i oczyszczania immunologicznego 1-3. Podczas gdy wiele metod zapewnia skuteczność, większość z nich wymaga długiego czasu hodowli i/lub kosztownego sprzętu/odczynników. Aby temu zapobiec, należy oczyścić OPC z tkanki mysiej za pomocą adaptacji metody pierwotnie opisanej przez McCarthy'ego i 
Preferowany jest de Vellis 2. Metoda ta polega na fizycznym oddzieleniu OPC od mieszanej kultury glejowej pochodzącej z kory noworodków gryzoni. Rezultatem jest oczyszczona populacja OPC, którą można zróżnicować w kulturę wzbogaconą w OL. Takie podejście jest atrakcyjne ze względu na stosunkowo krótki czas hodowli i niepotrzebne zapotrzebowanie na czynniki wzrostu lub przeciwciała immunopanujące. 
O ile badanie mechanizmów rozwoju OL w oczyszczonej kulturze jest pouczające, o tyle nie dostarcza najbardziej fizjologicznie istotnego środowiska do oceny powstawania osłonki mielinowej. Wspólna hodowla OL z neuronami dałaby wgląd w molekularne podstawy regulujące mielinizację aksonów za pośrednictwem OL. W wielu badaniach nad współkulturą OL/neuronów, neurony zwojowe korzenia grzbietowego (DRGN) okazały się być typem neuronów z wyboru. Idealnie nadają się do kohodowli z OL ze względu na łatwość ekstrakcji, minimalną ilość komórek zanieczyszczających i tworzenie gęstych pokładów neurytów. Chociaż badania z użyciem ksenokultur mielinizacyjnych szczurów/myszy opublikowano 4-6, nie opisano metody wyprowadzania takich kokultur mielinizujących OL / DRGN z pourodzeniowej tkanki myszy. Poniżej przedstawiamy szczegółowe metody, jak skutecznie produkować takie kultury, wraz z przykładami oczekiwanych rezultatów. Metody te są przydatne w rozwiązywaniu problemów związanych z rozwojem/funkcją mielinizacyjną OL i są użytecznymi narzędziami w dziedzinie neuronauki.

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Witam, nazywam się Ryan O'Mara i jestem doktorantem na Uniwersytecie w Ottawie oraz w Instytucie Badawczym Szpitala w Ottawie. Niniejszy protokół opisuje metody otrzymywania wzbogaconych populacji prekursorów oligodendrocytów z myszy, które mogą być różnicowane samodzielnie lub w połączeniu z neuronami zwojów korzeni grzbietowych myszy w celu wytworzenia mielinizujących kultur współhodowlanych. Rozpocznijmy od krótkiego przeglądu procedury.Kory noworodków myszy są dysocjowane i wysiewane do kolb T 25. Po dziewięciodniowym okresie hodowli na dnie kolby tworzy się monowarstwa astrocytów, na której proliferują komórki prekursorowe oligodendrocytów. Następnie komórki prekursorowe oligodendrocytów są pozyskiwane i oczyszczane, a w kolejnym etapie mogą być różnicowane w dojrzałe oligodendrocyty w hodowli wzbogaconej.W przypadku chęci uzyskania kokultur mielinizujących, neurony z zwojów korzeni grzbietowych myszy od P5 do P10 hoduje się wraz z mieszanymi kulturami gleju. W ciągu dziewięciu dni neurony te tworzą gęstą sieć neurytów, na której można wysiać komórki prekursorowe oligodendrocytów.Umożliwia to oplatanie neurytów przez oligodendrocyty, co prowadzi do powstania mielinizującej hodowli w niskiej temperaturze. Najpierw całe mózgi myszy od P0 do P2 umieszcza się w lodowatym medium MEM i przenosi pod mikroskop sekcyjny; za pomocą skalpela wykonuje się cięcie wzdłużne przez warstwę opon mózgowych każdej z półkul kory mózgowej, a następnie oddziela się opony od leżącej pod nimi kory. Następnie, przy brzusznej stronie mózgu skierowanej ku górze, usuwa się opłaty węchowe.Wykonaj głębokie nacięcia wzdłużne w miejscu, gdzie kory łączą się z brzuszną stroną głowy. Ustawiając mózg grzbietową stroną do góry, odseparuj kory, a następnie podziel każdą z nich na około cztery części. Przenieś kory do konicznej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 350 µL lodowatego MEM na jeden mózg.Mózgi o tym samym genotypie łączy się w jednej probówce, tak aby cztery mózgi wymagały 1400 µL MEM. Po zakończeniu sekcji należy przenieść połączone mózgi do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na trzy minuty. Następnie, w sterylnej komorze do hodowli tkanek, należy przepuścić fragmenty mózgu przez końcówkę pipety P 1000, aby rozbić je na mniejsze kawałki.Do probówki stożkowej dodać 75 µL ogrzanego wcześniej roztworu OPC Pap pain na mózg. Następnie inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut, odwracając probówkę co dwie minuty, aby zapobiec agregacji tkanki.Po zakończeniu inkubacji do trawionego materiału należy dodać dwa mililitry mieszanej hodowli glejowej na mózg i odstawić na 10 minut. Po 10 minutach zawiesinę tkankową należy rozdzielić do pięciomililitrowych probówek plastikowych.Liczba probówek powinna odpowiadać liczbie mózgów w preparacie. Używając wypalanej nad płomieniem szklanej pipety Pasteura, trituruj zawartość każdej probówki, początkowo powoli, a następnie z coraz większą intensywnością, gdy fragmenty zaczną się rozdzielać. Przerwij triturację, gdy w zawiesinie nie będzie już widocznych grudek tkanki. Przenieś zawartość wszystkich probówek do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 4 ml mieszanej hodowli glejowej.Po delikatnym kilkukrotnym odwróceniu probówki, podziel zawiesinę komórkową do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Liczba probówek powinna odpowiadać liczbie mózgów wykorzystanych w preparacie. Odwiruj probówki z prędkością 300 ×g przez pięć minut, a następnie ponownie zawieś osady w 1 ml mieszanej pożywki do hodowli gleju. Przenieś ponownie zawieszone komórki z każdej probówki stożkowej do kolb T25 pokrytych poli-L-lizyną, które zostały uprzednio równoważone 5 ml mieszanej pożywki do hodowli gleju.Liczba kolb powinna odpowiadać liczbie wypreparowanych mózgów. Inkubuj kolby w inkubatorze w temperaturze 37°C przy 8,5% CO2. Po trzech do czterech godzinach komórki powinny przywrzeć do podłoża. W medium pozostanie jednak dużo zanieczyszczeń, co może negatywnie wpłynąć na żywotność komórek.Aby tego uniknąć, po trzech do czterech godzinach wymień medium na świeże mieszane medium do hodowli glejowej, o ile jest to możliwe. Ta wymiana medium usuwa znaczną część debris komórkowego. Następnego dnia.Na dnie kolby powinno być widocznych wiele komórek. Trzeciego dnia na dnie kolby powinna zacząć tworzyć się monowarstwa astrocytów. W tym momencie należy wymienić dwie trzecie pożywki, usuwając 4 mL pożywki i dodając 4 mL świeżej pożywki.Krok ten należy powtarzać co trzy dni. Szóstego dnia na powierzchni powinna być wyraźnie widoczna monowarstwa astrocytów, na której proliferują komórki prekursorowe oligodendrocytów. W tym momencie należy uzupełnić pożywkę hodowlaną insuliną do stężenia końcowego 5 µg/mL. Dziewiątego dnia komórki prekursorowe oligodendrocytów są gotowe do oddzielenia od monowarstwy astrocytów.Aby to zrobić, należy umieścić kolby na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze z 5% CO2. Pozostawić kolby w inkubatorze na jedną godzinę w celu wyrównania temperatury. Następnie inkubować komórki przy wytrząsaniu z prędkością 50 RPM przez 45 minut.Krok ten pozwala na usunięcie wielu słabo przylegających komórek zanieczyszczających. Należy przeprowadzić całkowitą wymianę pożywki poprzez usunięcie całej zawartości i dodanie 4 mL świeżej pożywki hodowlanej. Flask należy umieścić w inkubatorze z 5%CO2 i pozostawić na trzy godziny w celu wyrównania parametrów.Po trzech godzinach należy sprawdzić barwę pożywki. Pożywka powinna mieć kolor czerwony, co wskazuje na zrównoważone pH. Jeśli kolor przechodzi w pomarańczowy lub fioletowy, należy odpowiednio dostosować poziom CO2 w inkubatorze.Utrzymanie zrównoważonego poziomu pH jest istotne dla przeżycia prekursorów oligodendrocytów podczas nocnego inkubowania z wytrząsaniem. Po osiągnięciu zrównoważonego pH, inkubuj kolbę przy 220 RPM przez około 16 godzin. Następnego ranka wyjmij kolbę z wytrząsarki i przelej pożywkę z kolb do 10 centymetrowych naczyń hodowlanych.Szalki te posłużą do dalszego oczyszczania prekursorowych komórek oligodendrocytów poprzez adhezję różnicową. Do każdej szalki należy przenieść medium z dwóch kolb, a następnie inkubować szalki w 5%CO2 przez 30 minut. Po 15 minutach należy delikatnie potrząsnąć każdą szalką, aby zapobiec przyleganiu prekursorowych komórek oligodendrocytów do plastiku.Po 30-minutowej inkubacji należy zbadać szalki pod mikroskopem w kontraście fazowym. Prekursory oligodendrocytów są widoczne jako małe skupiska komórek. Niektóre z tych komórek mogły przylgnąć do szalki.Odczep przylepione prekursorowe komórki oligodendrocytów z naczynia poprzez delikatne potrząsanie. Należy zachować ostrożność. Zbyt intensywne potrząsanie może doprowadzić do odczepienia zanieczyszczających typów komórek.Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 Milliliter i odwiruj z prędkością 300 Times gravity przez pięć minut. Delikatnie resuspenduj osad za pomocą końcówki do pipety P 1000. Następnie, używając końcówki do pipety P 200, oblicz liczbę komórek za pomocą hemocytometru; oczyszczone oligodendrocy można następnie wysiać na szkiełka podstawowe pokryte lamininą w celu różnicowania w wzbogacone kultury oligodendrocytów w dniu pierwszym.Po wysianiu wzbogacone komórki prekursorowe oligodendrocytów wykazują stosunkowo prostą morfologię z niewielką liczbą wypustek. Do trzeciego dnia różnicujące się oligodendrocy wykształcają liczne wypustki przypominające niedojrzałe oligodendrocyty. Do szóstego dnia oligodendrocy wykształcają błoniaste płaty przypominające mielinę w dowolnym momencie tego okresu.Kryształy osłonowe do kursu mogą zostać utrwalone i poddane obróbce w celu przeprowadzenia immunocytochemii. Zamiast wysiewać oczyszczone komórki prekursorowe oligodendrocytów na szkiełka zakrywkowe pokryte lamininą, można je wysiać na złoża neurytów z zwojów korzeni grzbietowych w celu wytworzenia mielinizujących kokultur. W następnej sekcji opisane zostaną metody wytwarzania tych kultur.Aby rozpocząć, należy wyizolować całe rdzenie kręgowe od myszy P5 do P10 i przenieść je pod mikroskop stereoskopowy za pomocą nożyczek sekcyjnych. Przetnij brzuszno-przyśrodkowy obszar rdzenia kręgowego wzdłużnie. Ostrożnie usuń zwoje rdzeni grzbietowych (DRG) za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami.Przenieś zwoje do zbuforowanego roztworu soli Hanksa w szalce Petriego. Przytnij nadmiernie długie korzenie w obrębie zwojów rdzeniowych (DRG). Użyj końcówki do pipety P 1000 z szerokim otworem.Przenieś zwoje do probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml. Przechowuj probówkę w lodzie do momentu przetworzenia wszystkich myszy. Po zakończeniu izolacji DRG odwiruj zawartość probówki z prędkością około 300 ×g.Przenieś probówkę do sterylnego dygestorium do hodowli tkankowych i odlej nadsącz. Do probówki dodaj 500 µL podgrzanej papainy do DRG i inkubuj w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Po zakończeniu trawienia papainą odwiruj próbkę, a następnie usuń roztwór papainy.Inkubować z 500 µL podgrzanej wcześniej kolagenazy A przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Powtórzyć etap wirowania i zastąpić roztwór kolagenazy A jednym ml pożywki DRGN. Po końcowym etapie wirowania dodać jeden ml pożywki DRGN i przenieść próbkę za pomocą pipety pasterskiej z polerowanego ogniem szkła.Rozcieraj zwoje początkowo powoli, a następnie z coraz większą intensywnością, gdy tkanka zacznie ulegać dysocjacji. Gdy nie będą już widoczne fragmenty tkanki, przenieś zawiesinę komórek do szalki Petriego zawierającej siedem mililitrów pożywki DRGN. Inkubuj szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 8,5%CO2 przez jedną i jedną czwartą godziny.Po tej inkubacji należy zaobserwować szalkę Petriego. W kontraście fazowym neurony DRG widoczne są jako komórki o dużych ciałach. Wiele komórek zanieczyszczających powinno być silnie przyległych do szalki Petriego.Przenieś medium do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml i wypłucz szalkę czterema ml medium DRGN, aby zebrać pozostałe neurony. Wirowarkuj probówkę stożkowatą przy 300 ×g przez pięć minut. Resuspenduj powstały osad w 500 µl medium DRGN.Policz komórki przy użyciu cytometru HEO. Upewnij się, że liczysz tylko neurony DRG; wysiej od 30 do 50 000 neuronów na pokrywkę szkiełkową o średnicy 12 milimetrów pokrytą lamininą w 1 mililitrze pożywki hodowlanej DRGN. Komórki umieść w inkubatorze do hodowli tkankowej z 8,5% CO2.Następnego dnia rano przeprowadź całkowitą wymianę pożywki, zastępując pożywkę DRGN pożywką OL uzupełnioną o 10 µM FUD R co drugi dzień. Następnie przeprowadź wymianę trzech czwartych pożywki na pożywkę OL uzupełnioną o FUD r. Podczas badania pod mikroskopem kontrastowym w pierwszym dniu obserwuje się, że neurony zaczęły wysuwać kilka wypustek. W trzecim dniu wypustki neuronalne uległy wydłużeniu.W szóstym dniu wykształciła się warstwa neurytów składająca się z wielu przeplatających się wypustek. W dziewiątym dniu gęstość tej warstwy neurytów wzrosła, co czyni ją gotową do przyjęcia oligodendrocytów poprzez hodowlę mieszaną tkanek mózgu. Równolegle z hodowlami neuronów, w dziewiątym dniu ich wzrostu, można przeprowadzić oczyszczanie komórek prekursorowych oligodendrocytów.Następnie można je osadzić na warstwach neurytów, dodając 50 000 komórek do każdej studni płytki 24-dołkowej. W szóstym dniu kokultury można zaobserwować komórki przypominające oligodendrocyty, które wchodzą w interakcje z neuronami zwojów korzeni grzbietowych (DRG).Kultury te można teraz utrwalić i przygotować do immunocytochemii. Po znakowaniu wzbogaconych kultur oligodendrocytów przeciwciałami przeciwko markerom oligodendrocytów, komórki immunologicznie dodatnie dla NG2, MAG i MVP wykazują morfologię charakterystyczną dla poszczególnych stadiów. Kultury te rozpoczynają się jako populacja prekursorów oligodendrocytów dodatnich dla NG2, a w ciągu sześciu dni różnicowania wytwarzają dojrzałe oligodendrocyty dodatnie dla MAG.W przypadku przeprowadzenia elektroforezy SDS-PAGE na lizatach uzyskanych z kultur wzbogaconych w oligodendrocyty można zauważyć, że oligodendrocyty wykazują ekspresję CNPP i MVP w ciągu sześciodniowego okresu obserwacji. W przypadku neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) przed dodaniem oligodendrocytów, w dziewiątym dniu stwierdza się obecność gęstych sieci neurytów wykazujących pozytywność na Taj 1 i neurofilamenty. W szóstym dniu kokultury oligodendrocytów z neuronami DRG, przy większym powiększeniu można zaobserwować wiele oligodendrocytów wykazujących pozytywność na MBP, które wchodzą w interakcje z neurytami neuronów.Widać, że oligodendrocy owijają te neuryty membraną pozytywną pod kątem MBP, co przypomina mielinizację; cyfrowo powiększony widok pokazuje zakres nakładania się membrany pozytywnej pod kątem MVP na wypustkę pozytywną pod kątem neurofilamentów. Cześć, jestem Scott Ryan, stażysta postdoktorski w Ottawa Hospital Research Institute. Techniki te umożliwiają stworzenie systemów kokultury oligodendrocytów i neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) pochodzących od myszy.Technika ta jest cenna w badaniach nad modelami chorób demielinizacyjnych, zarówno indukowanymi eksperymentalnie, jak i transgenicznymi. Jest ona również skuteczna w przesiewowym badaniu nowych związków terapeutycznych.

derivation-enriched-oligodendrocyte-cultures-oligodendrocyteneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Uzyskanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kultur współkomórkowych oligodendrocytów/neuronów mielinizujących z tkanek po urodzeniu u myszy

Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania prekursorów ograniczeń glejowych (Glial Restricted Precursors) z płodowych rdzeni kręgowych oraz ich utrzymywanie in vitro w celu transplantacji lub badania linii oligodendrocytów.

Wyizolowanie prekursorów ograniczonych do linii glejowej (GRP) od myszy w 13. dniu embrionalnym (E13)

Pierwotne, wielopotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z ludzkiego płodowego mózgu proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony i astrocyty. Niniejsza praca wykazuje, że progenitorom neuralnym można indukować różnicowanie poprzez kolejne stadia linii oligodendrocytarnej za pomocą kondycjonowania wybranymi czynnikami wzrostu.

System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Ten film pokazuje proces generowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, a następnie dojrzewania OPC do oligodendrocytów. Ten proces generowania oligodendrocytów otwiera wiele możliwości poprawy badań i leczenia chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera.

Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w oligodendrocyty

Ten film demonstruje ustanowienie kokultury ludzkich neuronów indukowanych (iN) i indukowanych komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC). iN są mieszane z iOPC w kokulturze, a następnie inkubowane, aby wspierać dojrzewanie zarówno iN do neuronów, jak i iOPC do oligodendrocytów. Neurony tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami i oligodendrocytami, podczas gdy oligodendrocyty rozwijają osłonki mielinowe wokół aksonów neuronów.

Metoda wspólnej hodowli do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Film demonstruje protokół różnicowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) na oligodendrocyty i indukowania mielinizacji w kokulturze z neuronami zwoju korzenia grzbietowego (DRG). OPC są transdukowane za pomocą wektorów lentiwirusowych kodujących białko sygnałowe, które reguluje mielinizację. Transdukowane OPC są hodowane wspólnie z neuronami DRG w celu oceny różnicowania w oligodendrocyty i mielinizacji indukowanej białkiem sygnałowym.

Test mielinizacji indukowanej transdukcją in vitro dla komórek prekursorowych oligodendrocytów

Oligodendrocyty to komórki mielinizujące ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje metodę izolacji i hodowli ich prekursorów, komórek progenitorowych oligodendrocytów, z kory szczura, a także szybką i wiarygodną metodę ilościową oceny oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne.

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę oczyszczania oligodendrocytów i produkcji pożywki kondycjonowanej przez oligodendrocyty, która może być wykorzystana do eksperymentów z kokulturą.

Wytwarzanie oligodendrocytów i pożywki kondycjonowanej oligodendrocytami do eksperymentów z kokulturą

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Poznaj metody wyprowadzania wzbogaconych kultur oligodendrocytów z tkanek noworodkowych myszy oraz tworzenia kokultur mielinizujących z neuronami DRG. Protokół umożliwia badanie biologii mielinizacji w układzie nerwowym.

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy (Wideo) | JoVE Journal

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Przeglądaj więcej filmów