Monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) destabilizowanego przez degron (dgn)

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności proteasomu w żywych komórkach przy użyciu białka fuzyjnego GFP Deron. W pierwszej kolejności należy sklonować niestandardowe oligonukleotydy dla Deron oraz Deron frameshift. Wprowadzić wektor P-E-G-F-P-C one, a następnie postępować zgodnie z protokołami dla systemu Gateway firmy Vitrogen, po czym wytworzyć wirusy dla każdego konstruktu z wykorzystaniem komórek HEK 2 93 FT. Po określeniu miana należy przeprowadzić transdukcję komórek wirusem i zastosować selekcję antybiotykową, a następnie namnożyć powstałe stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję GFP DRON lub GFP Dron frameshift.

Technika ta ułatwia przeprowadzanie eksperymentów monitorujących odpowiedzi komórkowe na określone zabiegi poprzez pomiary sygnału fluorescencji. Na przykład aktywność proteasomów można łatwo ocenić za pomocą fluorescencji epifokalnej lub cytometrii przepływowej. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy luminogenne lub fluorogenne z wykorzystaniem całokomórkowych kwasów, jest to, że aktywność proteasomów jest mierzona w żywych komórkach. Do transfekcji należy rozcieńczyć 36 µL odczynnika lipo 2000 w 1,5 mL DMEM; w oddzielnej probówce Falcon 15 mL należy rozcieńczyć konstrukty DNA w 1,5 mL DMEM.

Po pięciu minutach połączyć oba składniki i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąpić medium z konfluencyjnej hodowli komórek HEK 2 93 FT w kolbie T 75 siedmioma mililitrami DMEM. Dodać mieszaninę DNA-liposomy do kolby i wymieszać, delikatnie nią potrząsając.

Inkubować kolbę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2. Następnego dnia wymienić pożywkę na 10 ml DMEM. Po 48 godzinach zebrać nadsącz. Przefiltrować nadsącz zawierający wirusy przez filtr PVDF o rozmiarze porów 0,45 µm.

Aby skoncentrować wirusa, należy dodać jedną objętość roztworu PEG do czterech objętości supernatantu i inkubować przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, okresowo mieszając poprzez odwracanie probówki. Wirus należy zebrać poprzez wirowanie; po odessaniu pozostałości białego osadu należy ponownie odwirować próbkę, aby usunąć resztki roztworu PEG. Ostateczny osad należy resuspender w PBS za pomocą pipety, a następnie intensywnie mieszać w wortexie przez 20 do 30 sekund.

Przechowywać alikwoty wirusa o objętości 100 µL w temperaturze -80 °C. Wysiać komórki U2 OS na płytki 6-dołkowe i inkubować przez noc. W celu transfekcji zastąpić medium hodowlane 1 mL DMEM zawierającego 8 µg/mL Poly brain. Jedną dołkę pozostawić jako kontrolę dodatnią, a w pozostałych dołkach przetestować szereg stężeń wirusa.

Inkubować przez noc w następnym dniu. Wymienić medium na dwa mililitry DMEM i inkubować przez 24 godziny. Rozpocząć selekcję przy użyciu 10 mikrogramów na mililitr blastycyny, a następnie kontynuować wymianę medium zawierającego antybiotyk co drugi dzień.

Około sześciu do siedmiu dni później zweryfikować śmierć komórek nietransdukowanych. Następnie trzykrotnie przemyć komórki buforem PBS w celu ich zabarwienia. Przykryć fioletem krystalicznym i inkubować od 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie odessać barwnik, dwukrotnie opłukać studzienki wodą dwukrotnie destylowaną i wysuszyć płytkę na powietrzu.

Na koniec należy policzyć kolonie, aby obliczyć jednostki transfekcyjne wirusa na mililitr. Ludzkie diploblasty włókniste w płytkach sześciodołkowych z ośmioma mikrogramami na mililitr Polybrene jako wzmacniacza transdukcji.

Zastosować wielokrotność infekcji równą 2 w całkowitej objętości 1 ml. Wymienić pożywkę. Następnego dnia, gdy kultura osiągnie 70 do 80% konfluencji.

Rozpocząć selekcję chroniczną przy stężeniu 10 µg/mL. W kolejnych dniach monitorować całkowitą śmierć komórek, co będzie wskazywać na zakończenie selekcji. Namnożyć stabilnie transdukowane komórki w celu utworzenia stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję białek fuzyjnych GFP DERON lub GFP Deron Frameshift. Rozpocząć od wysiania komórek niosących GFP DRON lub GFP DRON frameshift w dniu poprzedzającym, na trzy godziny przed faksem.

Komórki kontrolne potraktować inhibitorem proteasomów. Przemyć dwukrotnie buforem PBS i zebrać komórki, używając 0.5 milliliters trypsyny. Aby zatrzymać działanie trypsyny.

Użyć 4,5 mililitrów pożywki hodowlanej i przenieść komórki do probówki Falcon o pojemności 15 mililitrów. Zebrać komórki poprzez wirowanie. Po jednym przemyciu PBSem resuspender osad w 400 mikrolitrach buforu fax. Przenieść komórki do probówek fax i umieścić na lodzie.

Następnie zmierz próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Białko fuzyjne GFP Deron zawiera sekwencję ukierunkowaną na proteasom w celu natychmiastowej degradacji. Z kolei mutant z przesunięciem ramki odczytu GFP Deron FS nie ulega degradacji przez proteasomy.

W związku z tym, po transdukcji GFP Deronem, młode ludzkie fibroblasty z oczekiwaną wysoką aktywnością proteasomalną wykazują słaby sygnał fluorescencyjny w mikroskopie epifluorescencyjnym. Te same komórki transdukowane GFP Deron Frameshift wykazują 39,7% komórek pozytywnych. Traktowanie komórek inhibitorami proteasomów ll i L skutkuje zwiększeniem sygnałów do maksymalnie około 63% w obu grupach komórek: GFP dron oraz GFP Dron frameshift.

Podobne pomiary w fibroblastach skóry, wyizolowanych od młodych, średnio wiekowych i starszych dawców, wykazują wyraźny wzrost sygnału GFP pomiędzy osobnikami młodymi a dawcami w średnim wieku, co wskazuje na spadek aktywności proteasomów w próbkach pobranych od starszych dawców. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać biegłą wiedzę na temat tego, jak wytwarzać cząstki lentiwirusowe, transfekować komórki oraz określać aktywność proteasomów w żywych komórkach.