Name: Monitorowanie aktywności ubikwityny-proteasomu w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego na bazie destabilizowanego degronu (dgn) białka zielonej fluorescencji (GFP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Naucz się monitorować aktywność proteasomu w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego GFP-dgn. Ta metoda oparta na fluorescencji umożliwia tworzenie stabilnych linii komórkowych do badań degradacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było finansowane przez: Narodową Sieć Badawczą nad Starzeniem się (NFN S93) z Austriackiej Fundacji Naukowej (FWF), zintegrowane projekty Komisji Europejskiej MiMAGE i PROTEOMAGE, Holenderską Inicjatywę Genomiki/Holenderską Organizację Badań Naukowych (NGI/NWO; 05040202 oraz 050-060-810 NCHA), finansowaną przez UE Sieć Doskonałości Lifespan (FP6 036894) oraz Zorientowany na Innowacje Program Badawczy w dziedzinie Genomiki (SenterNovem; IGE01014 i IGE5007).

1. Konstrukcja plazmidu
<ol>
 <li>Zamówć odpowiednio zaprojektowane oligonukleotydy kodujące dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL11) oraz dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) i liguj je do wektora pEGFP-C1, aby uzyskać białka fuzyjne GFP z dgn/dgnFS (Rysunek 1). </li>
 <li>Amplifikuj sekwencję kodującą GFP-dgn oraz GFP-dgnFS metodą PCR zgodnie z protokołem zestawu pENTR Directional TOPO Cloning Kit, a następnie kontynuuj procedurę z użyciem zestawu pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (Rysunek 6). </li>
</ol>
2. Produkcja wirusa
<ol>
 <li>Dzień przed transfekcją (Dzień 1) wysiej komórki HEK 293FT do kolb T75 tak, aby w dniu transfekcji osiągnęły konfluencję na poziomie 90-95%. </li>
 <li>W dniu transfekcji rozcieńcz 36 μl odczynnika Lipofectamine 2000 w 1,5 ml DMEM bez surowicy i antybiotyków w probówce Falcon 15 ml. W drugiej probówce Falcon 15 ml rozcieńcz 3 μg plazmidu pLenti6/V5 zawierającego komplementarną konstrukcję DNA dla GFP-dgn lub GFP-dgnFS, 2,5 μg plazmidu pMD2.G kodującego białko otoczki oraz 7,5 μg wektora pomocniczego psPAX2 w 1,5 ml DMEM bez surowicy i antybiotyków. Po 5 min połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem Lipofectamine 2000.</li>
 <li>Inkubuj mieszaninę przez 20 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów DNA-lipofektamina.</li>
 <li>Usuń medium z komórek HEK 293FT, ostrożnie zastąp je 7 ml medium (bez antybiotyków), dodaj do kolby mieszaninę DNA-lipofektamina i delikatnie nią potrząśnij w celu wymieszania (Dzień 2). Inkubuj kolbę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotną atmosferą i 5% CO2.</li>
 <li>Następnego dnia wymień medium (10 ml medium bez antybiotyków; Dzień 3).</li>
 <li>Po 48 h (Dzień 5) zbierz nadsącz, odwiruj go przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie przefiltruj nadsącz przez filtr PVDF 0,45 μm.</li>
</ol>
Pożywka hodowlana - DMEM (HEK 293FT)
DMEM 
10% FBS 
0.1 mM MEM NEAA 
6 mM L-glutamine 
1 mM MEM piwczan sodu 
1% Pen-Strep (opcjonalnie) 
500 μg/ml Geneticin (opcjonalnie)
3. Koncentracja wirusa poprzez wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG)
<ol>
 <li>Do czterech objętości supernatantu dodać jedną objętość roztworu glikolu polietylenowego (50 mM glikol polietylenowy, 41 mM NaCl, autoklawowany, pH =7,2; PEG) i inkubować przez 2 hr w temperaturze 4 °C. Co 20-30 min należy ostrożnie wymieszać zawiesinę poprzez odwracanie probówki. </li>
 <li>Odwirować przy 1500 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Powinien pojawić się biały osad. </li>
 <li>Odssać supernatat i ponownie odwirować przy 1500 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odssać pozostały roztwór PEG. </li>
 <li>Resuspendować osad w medium lub soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), pipetując ciecz w górę i w dół, a następnie intensywnie mieszać na wortexie przez 20 do 30 sekund. Jako wytyczną należy przyjąć 500 μl na jedną kolbę T75 i rozdzielić roztwór na aliquoty po 100 μl. Wirusy przechowywać w temperaturze -80 °C. </li>
</ol>
4. Oznaczanie miana wirusa
<ol>
 <li>Dzień przed transfekcją wysiać 5×104 komórek U2-OS do każdego dołka płytki 6-dołkowej. </li>
 <li>W dniu transfekcji usunąć medium hodowlane i zastąpić je 1 ml DMEM zawierającego 8 μg/ml polybrene (bromek heksadymetryny). Skoncentrowany nadpływ wirusa rozcieńczyć w stosunkach 1:10 oraz 1:100 i dodać po 1 μl każdego rozcieńczenia do osobnych dołków. W celu uzyskania wyższych stężeń wirusa, do pozostałych dołków dodać odpowiednio 1 μl, 5 μl i 10 μl skoncentrowanego nadpływu wirusa. Jeden dołek pozostawić jako kontrolę pozytywną. </li>
 <li>Następnego dnia wymienić medium na 2 ml DMEM. </li>
 <li>Selekcję rozpocząć kolejnego dnia. Do każdego dołka dodać Blastycydynę w stężeniu 10 μg/ml. Medium zawierające antybiotyk wymieniać co drugi dzień. </li>
 <li> fueling Około 6-7 dni po rozpoczęciu selekcji komórki nietransdukowane obumrą. Przed barwieniem przemyć komórki trzykrotnie PBS, a następnie pokryć je fioletem krystalicznym (10 mg/l fioletu krystalicznego w 20% etanolu) i inkubować przez 5-10 min w temperaturze pokojowej. Odessać fiolet krystaliczny (można go wykorzystać ponownie kilka razy), przemyć dołki dwukrotnie ddH2O i wysuszyć płytkę. </li>
 <li>Policzyć kolonie i pomnożyć wynik przez 1 000 oraz odpowiednie rozcieńczenie (Rysunek 7). Procedura ta pozwala na obliczenie jednostek transfekcyjnych (TU) wirusa / ml. </li>
</ol>
Pożywka hodowlana - DMEM (HFF-2/U2-OS)
DMEM 
10% FBS 
6mM L-glutamina 
1% Pen-Strep
5. Transdukcja ludzkich diploidalnych fibroblastów (tę procedurę można zastosować do każdego typu komórek).
<ol>
 <li>Dzień przed transdukcją wysiać 5×104 ludzkich diploidalnych fibroblastów (HDFs) na płytki 6-dołkowe. </li>
 <li>Zastosować wielokrotność zakażenia (MOI) równą dwa oraz 8 μg/ml polybrene jako wzmacniacz transdukcji w całkowitej objętości jednego mililitra.</li>
 <li>Następnego dnia wymienić pożywkę.</li>
 <li>Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, rozpocząć selekcję blastycydyną w stężeniu 10 μg/ml. Po zakończeniu selekcji (gdy nie giną już nieprzetransformowane komórki), można rozpocząć namnażanie komórek; są one wówczas gotowe do eksperymentów. Przewlekła selekcja blastycydyną pozwala na wygenerowanie stabilnej linii komórkowej nadprodukującej białka fuzyjne GFP-dgn lub GFP-dgnFS, gotowej do pomiaru aktywności proteasomów. Procedura ta gwarantuje bardzo wysoką wydajność transfekcji, niezależnie od typu komórek.</li>
</ol>
6. Pomiar metodą cytometrii przepływowej
<ol>
 <li>Dzień przed eksperymentem wysiać 1×105 komórek (wyrażających GFP-dgn lub GFP-dgnFS).</li>
 <li>Komórki kontrolne traktować inhibitorem proteasomów, np. 100 μg/ml LLnL, 3 h przed pomiarem.</li>
 <li>Przemyć dwukrotnie PBS i zebrać komórki, używając 0,5 ml trypsyny. Aby przerwać proces trypsynizacji, dodać 4,5 ml pożywki hodowlanej i przenieść komórki do probówki typu Falcon 15 ml.</li>
 <li>Odwirować komórki z prędkością 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Odssać pożywkę, resuspendować komórki w PBS i ponownie odwirować z prędkością 300 x g przez 5 min w 37 °C.</li>
 <li>Odssać PBS, resuspendować w 400 μl buforu FACS (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH=7,4) i przenieść komórki do probówek do FACS.</li>
 <li>Przechowywać komórki w lodzie i zmierzyć próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki nie powinny być przechowywane dłużej niż 30 min w 4 °C.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Białko fuzyjne GFP-dgn zawiera sekwencję kierującą do proteasomu, w związku z czym białko to ulega natychmiastowej degradacji; odpowiada to spadkowi sygnału fluorescencji GFP. Mutant z przesunięciem ramki odczytu (GFP-dgnFS) posiada zmutowaną wersję tej sekwencji i nie jest degradowany przez proteasom, co prowadzi do wyższej fluorescencji zielonej. Z tych powodów młode komórki HDF o spodziewanie wysokiej aktywności proteasomu, po transdukcji GFP-dgn, wykazują niski sygnał fluorescencji (6% komórek pozytywnych) zarówno w pomiarze cytometrycznym, jak i w epifluorescencji (Rycina 2A i B, Rycina 3). Te same HDFy po transdukcji GFP-dgnFS wykazują 39,7% komórek pozytywnych. Traktowanie komórek inhibitorem proteasomów LLnL (N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-L-norleucynalem) zwiększyło sygnał do maksymalnie 62,9% zarówno w komórkach GFP-dgn, jak i GFP-dgnFS (Rysunek 2A i B).
Aby ocenić możliwy spadek aktywności proteasomów w próbkach skóry ludzkiej osób starszych, fibroblasty skórne wyizolowane od dawców młodych, w średnim wieku i starszych zainfekowano GFP-dgn oraz GFP-dgnFS, zgodnie z opisaną powyżej procedurą, a następnie hodowano do uzyskania tej samej liczby pasaży przed analizą metodą cytometrii przepływowej. W eksperymentach tych zaobserwowano wyraźny wzrost sygnału GFP między osobami młodymi (11,2±0,88% komórek GFP-dodatnich) a dawcami w średnim wieku (20,4±2,27% komórek GFP-dodatnich, P=0,003), co wskazuje na spadek aktywności proteasomów w próbkach pobranych od dawców starszych7 (Rysunek 4). W fibroblastach wyizolowanych od osób najstarszych nie zaobserwowano dalszego spadku aktywności proteasomów (Rysunek 4). Intensywność fluorescencji dla GFP-dgnFS wynosiła we wszystkich przypadkach ~90% (dane niepokażane), co wskazuje na wysoką wydajność transfekcji w trzech różnych grupach wiekowych.
<img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig1.jpg" alt="Schemat sekwencji genetycznej GFP; kodowanie białka; analiza mutacji DNA; ilustracja edycji genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Sekwencje GFP-dgn i GFP-dgnFS. Przedstawiono koniec 3' GFP (kolor zielony), wielomiejscowy klonujący wektor pEGFP-CL1 (kolor szary) oraz sekwencję dgn/dgnFS (kolor czerwony).
<img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig2.jpg" alt="Analiza fluorescencji GFP, wykres słupkowy i histogramy cytometrii przepływowej, z uwzględnieniem wpływu inhibitora proteasomów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Analiza cytometryczna GFP-dgn i GFP-dgnFS w ludzkich diploidowych fibroblastach. A. Młode ludzkie fibroblasty skóry napletka (HFF-2) zainfekowano wektorami lentiwirusowymi niosącymi gen białka fluorescencyjnego (GFP)–dgn lub konstrukt GFP–dgnFS (przesunięcie ramki odczytu), zgodnie z oznaczeniami, a następnie przeanalizowano fluorescencję GFP za pomocą cytometrii przepływowej (FACS Canto II, Becton Dickinson). Tam, gdzie wskazano, komórki poddano również 3-godzinnej inkubacji z inhibitorem proteasomów N-acetylo-L-leucylo-L-leucylo-L-norleucynaldem (LLnL). W jako kontrolę wykorzystano komórki niezainfekowane. Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach. B. Dane są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów. Liczby odzwierciedlają ilość komórek pozytywnych pod kątem GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3327/3327fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

<img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig3.jpg" alt="Porównanie ekspresji GFP w komórkach; obrazy mikroskopowe pokazujące różnice w intensywności fluorescencji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza mikroskopowa fluorescencyjna komórek HFF-2 GFP-dgn i GFP-dgnFS. 
Młode komórki HFF-2 poddano zabiegom zgodnie z opisem na Rysunku 2. W 9. dniu po infekcji komórki wizualizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i fazokontrastowej.
<img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig4.jpg" alt="Wykres słupkowy fluorescencji GFP porównujący odsetek komórek dodatnich w grupach osób młodych, w średnim wieku i starszych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Zmiany w aktywności proteasomów podczas starzenia się ludzkiej skóry.
Fibroblasty z napletka ludzkiego pochodzące od dziewięciu różnych dawców w zaznaczonych grupach wiekowych poddano minimalnej ekspansji, a następnie zainfekowano konstruktami lentiwirusowymi kodującymi GFP–dgn. W 9. dniu po infekcji komórki poddano analizie metodą cytometrii przepłyewej. Dane uzyskano z trzech próbek na grupę wiekową, wykonanych w duplikacie (± SE).
<img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig5.jpg" alt="Schemat konstrukcji plazmidu i produkcji wirusa, transfekcja komórek, analiza cytometrii przepływowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Podejście eksperymentalne. Syntetyczne oligonukleotydy dla dgn i dgnFS są klonowane do wektora pEGFP-C1, a następnie z wykorzystaniem komórek HEK 293FT produkowane są wirusy dla każdej konstrukcji. Wyznaczany jest miano wirusów. Komórki są transdukowane wirusem i namnażane. Po zastosowaniu odpowiedniejy obróbki komórki są analizowane pod kątem sygnału fluorescencji za pomocą cytometrii przepływowej.
<img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig6.jpg" alt="Mapa plazmidu wektora lentiwirusowego GFP-degron; edycja genów; schemat; komponenty ekspresji genów wirusowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Mapa pLenti GFP-dgn. Przedstawiono mapę wektora pLenti6/V5-DEST zawierającą sekwencję GFP-dgn. Skróty: PCMV (promotor CMV), GFP-dgn (sekwencja GFP-dgn), PSV40 (wczesny promotor SV40), EM7 (promotor EM7), Blasticidin (gen oporności na blastycydynę), ΔU3/3'LTR (3'LTR z usuniętym regionem U3), SV40 pA (sygnał poliadenylacji SV40), Ampicillin (gen oporności na ampicylinę), pUC ori (replikon pUC), PRSV/5'LTR (hybrydowy promotor RSV/5'LTR), Ψ (sygnał pakowania HIV-1 Ψ), RRE (element odpowiedzi Rev HIV-1).
<img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig7.jpg" alt="eksperyment z hodowlą komórkową, wyniki testu kolonigennego, analiza hamowania wzrostu, różne rozcieńczenia, płytka 6-dołkowa" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Płytka do miareczkowania U2-OS. Komórki U2-OS wysiano na płytkę 6-dołkową i transfekowano różnymi stężeniami wirusa (rozcieńczenia 1/100 i 1/10, 1, 5 i 10 μl skoncentrowanego nadsączu wirusowego). Jeden dołek posłużył jako kontrola nietransfekowana (NT). Po 6-7 dniach komórki zabarwiono fioletem krystalicznym i wysuszono na powietrzu.

<ol><li>Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functions+of+the+20S+and+26S+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes.</a> Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).</li>
<li>Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+oxidized+proteins+by+the+20S+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimi%22%5BJournal%5D)">Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome.</a> Biochimi. 83, 301-310 (2001).</li>
<li>Stangl, K., Stangl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+pathway+and+endothelial+%28dys%29function%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function.</a> Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).</li>
<li>Tuoc, T. C., Stoykova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+ubiquitin-proteosome+system+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis.</a> Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).</li>
<li>Rock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+proteasome+block+the+degradation+of+most+cell+proteins+and+the+generation+of+peptides+presented+on+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules.</a> Cell. 78, 761-771 (1994).</li>
<li>Lehman, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+proteasome+system+in+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin proteasome system in neuropathology.</a> Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).</li>
<li>Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Interplay+between+mitochondrial+and+proteasome+activity+in+skin+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging.</a> J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).</li>
<li>Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification+of+cellular+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+molecules%3A+role+in+cellular+senescence+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).</li>
<li>Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+declines+in+proteasome+activity+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Age-dependent declines in proteasome activity in the heart.</a> Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).</li>
<li>Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasomal+activity+in+skeletal+muscle%3A+A+matter+of+assay+design%2C+muscle+type%2C+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age.</a> Anal. Biochem. , (2009).</li>
<li>Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li>
<li>Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-lived+green+fluorescent+proteins+for+quantifying+ubiquitin%2Fproteasome-dependent+proteolysis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).</li>
<li>Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+model+of+the+ubiquitin%2Fproteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system.</a> Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+desminopathy+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts.</a> FASEB J. 20, 362-364 (2006).</li>
<li>Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+dysfunction+in+a+polyglutamine+disease+model+occurs+in+the+absence+of+ubiquitin-proteasome+system+impairment+and+inversely+correlates+with+the+degree+of+nuclear+inclusion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).</li>
<li>Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+proteasome+active+site+allostery+as+revealed+by+subunit-specific+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors.</a> Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).</li>
<li>Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+ubiquitin-dependent+proteolysis+with+green+fluorescent+protein+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates.</a> Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).</li>
<li>Lener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NADPH+oxidase+Nox4+restricts+the+replicative+lifespan+of+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.</a> Biochem. J. 423, 363-374 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Pierwsza publikacja wykorzystująca zielone białko fluorescencyjne (GFP) jako substrat reporterowy dla aktywności ubikwityna-proteasomu została opublikowana w 2000 roku 12. Od tego czasu GFP stało się powszechnym narzędziem do wizualizacji procesów komórkowych, w szczególności procesu ubikwityna-proteasomu. W celu monitorowania aktywności ubikwityna-proteasomu in vivo wprowadzono transgeniczny model mysi z reporterem opartym na GFP 13. Dodatkowe badania in vivo pozwoliły na opracowa...

<table><tbody><tr><td>Wektor pEGFP-C1</td><td>BD Bioscience Clontech</td><td>6084-1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kierunkowego klonowania TOPO pENTR</td><td>Invitrogen</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kierunkowego klonowania TOPO pLenti6/V5</td><td>Invitrogen</td><td>V496-10</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>filtr PVDF (Rotilabo-Spritzenfilter) </td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>P667.1</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>1x roztwór soli PBS według Dulbecco (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>bromek heksadymetryny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10,768-9</td><td></td></tr><tr><td>Blastycydyna</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td></td></tr><tr><td>Fiolet krystaliczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>probówki do FACS</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicylina z streptomycyną (Pen-Strep)</td><td>Invitrogen</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Biochrom AG</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy nieessentialne (NEAA) do pożywki MEM 100x</td><td>Invitrogen</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MEM pirogronian sodu 100 mM</td><td>Invitrogen</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza (45%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Genetycyna</td><td>Invitrogen</td><td>11811023</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (gfp) destabilizowanego przez degron (dgn)

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasom jest głównym organellum wewnątrzkomórkowym zaangażowanym w proteolityczną degradację białek nieprawidłowych, błędnie sfałdowanych, uszkodzonych lub utlenionych 1, 2. Utrzymanie aktywności proteasomu jest powiązane z wieloma kluczowymi procesami komórkowymi, takimi jak odpowiedź komórki na stres 3, regulacja cyklu komórkowego i różnicowanie komórkowe 4 czy odpowiedź układu odpornościowego 5. Dysfunkcja systemu ubikwityna-proteasom została powiązana z rozwojem nowotworów i chorób neurodegeneracyjnych 4, 6. Ponadto spadek aktywności proteasomu stwierdzono jako cechę starzenia się komórek i starzenia organizmu 7, 8, 9, 10. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę pomiaru aktywności systemu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka fuzyjnego GFP-dgn. Aby umożliwić monitorowanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach pierwotnych, komplementarne konstrukty DNA kodujące białko fuzyjne zielonego białka fluorescencyjnego (GFP)–dgn (GFP–dgn, niestabilne) oraz wariant z mutacją przesunięcia ramki odczytu (GFP–dgnFS, stabilne 11) są wprowadzane do lentiwirusowych wektorów ekspresyjnych. Preferujemy tę technikę nad tradycyjnymi metodami transfekcji, ponieważ gwarantuje ona bardzo wysoką wydajność transfekcji, niezależnie od typu komórek lub wieku dawcy. Różnicę między fluorescencją wykazywaną przez białko GFP–dgnFS (stabilne) a białko destabilizowane (GFP-dgn) w obecności lub w nieobecności inhibitora proteasomu można wykorzystać do oszacowania aktywności systemu ubikwityna-proteasom w danej linii komórkowej. Różnice te mogą być monitorowane za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub mierzone metodą cytometrii przepływowej.

Opisano metodę monitorowania aktywności ubikwityna-proteasomowej w żywych komórkach. Wygenerowano białka fuzyjne: destabilizowane degronem GFP- (GFP-dgn) oraz stabilne GFP-dgnFS, które następnie wprowadzono do komórek za pomocą lentiwirusem wektora ekspresyjnego. Technika ta pozwala na stworzenie stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję GFP-dgn/GFP-dgnFS, w której aktywność ubikwityna-proteasomową można łatwo ocenić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.

Monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) destabilizowanego przez degron (dgn)

Proteasom jest głównym organellem wewnątrzkomórkowym uczestniczącym w proteolitycznej degradacji białek nieprawidłowych, błędnie sfałdowanych, uszkodzonych lub utlenionych 1, 2. ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności proteasomu w żywych komórkach przy użyciu białka fuzyjnego GFP Deron. W pierwszej kolejności należy sklonować niestandardowe oligonukleotydy dla Deron oraz Deron frameshift. Wprowadzić wektor P-E-G-F-P-C one, a następnie postępować zgodnie z protokołami dla systemu Gateway firmy Vitrogen, po czym wytworzyć wirusy dla każdego konstruktu z wykorzystaniem komórek HEK 2 93 FT. Po określeniu miana należy przeprowadzić transdukcję komórek wirusem i zastosować selekcję antybiotykową, a następnie namnożyć powstałe stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję GFP DRON lub GFP Dron frameshift.Technika ta ułatwia przeprowadzanie eksperymentów monitorujących odpowiedzi komórkowe na określone zabiegi poprzez pomiary sygnału fluorescencji. Na przykład aktywność proteasomów można łatwo ocenić za pomocą fluorescencji epifokalnej lub cytometrii przepływowej. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy luminogenne lub fluorogenne z wykorzystaniem całokomórkowych kwasów, jest to, że aktywność proteasomów jest mierzona w żywych komórkach. Do transfekcji należy rozcieńczyć 36 µL odczynnika lipo 2000 w 1,5 mL DMEM; w

monitoring-ubiquitin-proteasome-activity-living-cells-using-degron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitorowanie aktywności Ubiquityn-proteasomowej w żywych komórkach za pomocą białka reporterowego opartego na zgreenowanym białku fluorescencyjnym (GFP) z destabilizowanym degronem (dgn)

Ten film opisuje test degradacji dla nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą leczenia cykloheksymidem wraz z frakcjonowaniem detergentem. Metoda ta pomaga w badaniu dynamiki nieprawidłowo sfałdowanych białek i odkrywaniu dogłębnych mechanizmów obrotu białkami.

Test degradacji białek podatnych na nieprawidłowe fałdowanie: technika monitorowania nieprawidłowo sfałdowanej degradacji białek przy użyciu obróbki cykloheksymidem i frakcjonowania detergentem

Dynamika glikosomów w afrykańskich trypanosomach jest trudna do zbadania za pomocą tradycyjnych technik biologii komórki, takich jak mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna.  Jako sposób obserwacji dynamicznego zachowania organelli, zastosowano system reporterowy fluorescencyjno-organelli w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

Tutaj opisujemy solidny test biologiczny do ilościowego określania względnego tempa proteolizy przez układ ubikwityna-proteasom. Odczyt testu to tempo wzrostu drożdży w płynnej kulturze, które zależy od poziomów komórkowych białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji połączonego z niezbędnym markerem metabolicznym.

Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Ten protokół opisuje metodę określania okresu półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu znakowania impulsowego i fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego białek fuzyjnych znaczników SNAP.

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Ten artykuł opisuje protokoły do oceny wpływu białek fluorescencyjnych na agregację i toksyczność nieprawidłowo sfałdowanej ekspansji poliglutaminy w celu szybkiej oceny nowo niescharakteryzowanego białka fluorescencyjnego w kontekście reporterów fluorescencyjnych.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Prezentowany tutaj jest protokół monitorowania degradacji białka huntingtyny połączonego z fotokonwertowalnym fluoroforem Dendra2.

Kwantyfikacja in vivo obrotu białek w starzejących się C. elegans przy użyciu fotokonwertowalnego Dendra2

Naucz się monitorować aktywność proteasomu w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego GFP-dgn. Ta metoda oparta na fluorescencji umożliwia tworzenie stabilnych linii komórkowych do badań degradacji białek.

Monitorowanie aktywności ubikwityny-proteasomu w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego na bazie destabilizowanego degronu (dgn) białka zielonej fluorescencji (GFP) (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) destabilizowanego przez degron (dgn)

Przeglądaj więcej filmów