Name: Budowa niskobudżetowego systemu do aksotomii laserowej do badania regeneracji aksonów u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę budowy niskobudżetowego systemu laserowej aksotomii do badania regeneracji aksonów u C. elegans. Technika umożliwia precyzyjne cięcie z minimalnymi uszkodzeniami pobocznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez National Science Foundation, McKnight Endowment Fund for Neuroscience, Christopher and Dana Reeve Foundation oraz Amerisure Charitable Foundation.

<ol><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li>
<li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage%2C+ephrin+signaling%2C+and+synaptic+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li>
<li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li>
<li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li>
<li>Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li>
<li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li>
<li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-mediated+ablation%3A+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li>
<li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Chem.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li>
<li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nanosecond+laser+axotomy%3A+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li>
<li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Istnieje wiele wartościowych opracowań dotyczących mikrochirurgii laserowej z wykorzystaniem różnych systemów laserowych3,5-11. Lasery femtosekundowe IR są uznawane za „złoty standard” w subkomórkowej ablacji laserowej12 i są wygodne, jeśli są zintegrowane z systemem obrazowania, lecz często okazują się zbyt kosztowne dla pojedynczych użytkowników. Jeśli do obrazowania próbki ze względu na głębokość penetracji wymagany jest laser femtosekundowy IR, prawdopodobnie będzie on niezbędny również do aksonotomii laserowej. W przypadku tkanek przezroczystych, w których aksony docelowe znajdują się w odległości 30-50 µm od powierzchni, możliwe jest zastosowanie niebieskich i zielonych laserów impulsowych o energii rzędu 20 µJ/impuls, kierowanych przez soczewkę imersyjną o wysokiej aperturze numerycznej (na). Uszkodzenia poboczne będą większe w przypadku laserów nanosekundowych i pikosekundowych w porównaniu z laserem femtosekundowym, szczególnie wraz ze wzrostem głębokości położenia aksonu docelowego. C. elegans jest przezroczysty, a wszystkie aksony znajdują się w odległości 20-30 µm od powierzchni. Rutynowo przecinamy aksony ruchowe położone w odległości do 5 µm od powierzchni. Z łatwością przecinaliśmy również aksony w obrębie pierścienia nerwowego, znajdujące się około 20 µm od powierzchni kutykuli. Ustaliliśmy, że granicą możliwości przecinania aksonów jest głębokość około 30-50 µm w obrębie średnicy dorosłego nicienia. Prawdopodobne jest, że opisany tutaj system ablacji laserowej będzie działał skutecznie w wielu różnych preparatach spełniających kryteria przezroczystości i głębokości położenia aksonów docelowych. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę teoretyczne zalety laserów femtosekundowych IR, jest nieco zaskakujące, że nanosekundowe i pikosekundowe lasery o długości fali 355 nm i 532 nm sprawdzają się tak dobrze w aksonotomii laserowej u C. elegans6,13. Nie obserwujemy różnic w regeneracji aksonów w odpowiedzi na aksonotomię wykonaną za pomocą nanosekundowych laserów 440 nm, nanosekundowych laserów 532 nm oraz laserów femtosekundowych IR.
Stałe UV lasery 355 nm kosztują mniej więcej tyle samo, co pompowane diodowo pasywnie przełączane w Q stałe lasery 532 nm, ale wymagają albo wyższych mocy, albo optyki, która efektywnie przepuszcza te krótsze długości fal. Większość elementów optycznych jest zaprojektowana tak, aby działać sprawnie z widzialnym światłem w zakresie 400-700 nm. Lasery 355 nm oferowałyby pewne zalety6, takie jak obniżony próg plazmy, mniejszy rozmiar plamki, a dichroik długoprzepustowy efektywnie kierowałby 100% lasera ablacyjnego na cel i pozwalał na jednoczesne obrazowanie GFP bez utraty sygnału z próbki. Niebieskie lasery 440 nm zachowałyby zalety pracy z laserem światła widzialnego (dobra wydajność ze standardową optyką i bezpieczeństwo). Niestety, koszt pompowanego diodowo przełączanego w Q stałego lasera 440 nm jest obecnie 3 razy wyższy niż koszt lasera 355 nm lub 532 nm o podobnej mocy. Projektując nowy system dla C. elegans, gdzie głębokość celu jest minimalna, wybralibyśmy soczewkę przezroczystą dla UV (koszt ok. 3 000 $ za soczewkę olejową 40X 1.3na z transmitancją 50-70% przy 355 nm) oraz laser 355 nm generujący 5-10 uJ/impuls przy 1-20 kHz.
Uważa się, że ablacja aksonów wynika z powstawania plazmy. Krótsze impulsy generują progi plazmowe przy niższej mocy, a objętości plazmy są mniejsze6. Celem jest wytworzenie jak najmniejszej i najkrótszej plazmy poprzez dostosowanie energii impulsu do najniższej mocy. Większe, długotrwałe plazmy generują pęcherzyki kawitacyjne, które uszkadzają sąsiednie komórki. Zazwyczaj stwierdzono, że ablacja z użyciem około 50-100 impulsów przy najwyższej częstotliwości (tj. 2,5kHz) daje najlepsze wyniki. Sugeruje to, że uszkodzenia mogą być stopniowo kumulowane w serii impulsów, co pozwala na lepszą kontrolę zakresu uszkodzeń. Opisany tutaj system ablacji laserowej jest bardzo tolerancyjny, pod warunkiem że wiązka jest precyzyjnie ustawiona i rozszerzona. Przecinanie aksonów u dorosłych nicieni rozpoczynamy przy 10% mocy lasera (średnio 0,3 mW mierzone przy 2500 Hz i szacowane 1 uJ/pulse) i możemy przecinać z ograniczonymi uszkodzeniami miejscowymi aż do 14% mocy. Przy mocy lasera od 15-39% można zaobserwować większe obszary uszkodzeń, jednak dopiero powyżej 40% mocy (średnio około 1 mW mierzone przy 2500 Hz) nicienie ulegają rozerwaniu z powodu dużych pęcherzyków kawitacyjnych i uszkodzenia kutykuli nicienia.
Artykuł Steinmeyer i wsp. 20102 stanowi doskonałe źródło informacji na temat budowy systemu ablacji laserowej. Leon Avery opracował również przejrzysty opis praktyczny systemu ablacji laserowego opartego na niedrogim laserze azotowym (N2) o długości fali 337 nm, w którym zamieścił cenne wskazówki praktyczne (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/). Projektując własny system, należy w pierwszej kolejności skonsultować się z przedstawicielem producenta mikroskopu, aby ustalić sposób skierowania wiązki lasera ablacyjnego do obiektywu mikroskopu. Mikroskop powinien być zamontowany na stole wibroizolacyjnym (Newport, TMI, Thor). Optymalnym rozwiązaniem jest blat typu breadboard, jednak można zastosować również pełny blat stalowy z pozycjonerami magnetycznymi. Dedykowany moduł pośredni w mikroskopie pionowym jest korzystny, ponieważ wszystkie elementy optyczne mogą pozostać na swoim miejscu. Jednak tańszym i wygodniejszym rozwiązaniem może być wykorzystanie portu kamery (w mikroskopie odwróconym) lub „kombinatora” podłączonego do portu epi-fluorescencyjnego. Należy znać rozmiar tylnej apertury oraz transmitancję (dla długości fali lasera ablacyjnego) obiektywu, którego zamierza się użyć. Po wyborze lasera (np. Crylas, TEEM, Crystal lub CRC) należy skontaktować się z firmą Thor lub Newport w celu uzyskania pomocy w doborze odpowiednich elementów optycznych, osprzętu i sprzętu bezpieczeństwa. W naszym przypadku zdecydowaliśmy się na podwójny rozszerzacz wiązki Galileusza w celu oszczędności miejsca, ale opcją jest również prostszy rozszerzacz Keplera (f2/f1=czynnik powiększenia). Najmniej kosztowny będzie rozszerzacz wiązki wykonany na zamówienie, jednak firmy Newport, Thor oraz kilku producentów laserów oferują wysokiej jakości komercyjne rozszerzacze wiązki. Niektórzy producenci laserów oferują również tłumiki manualne i sterowane elektronicznie, które mogą być ekonomiczne i oszczędzać miejsce, choć nie są tak wszechstronne jak polaryzator Glana-Thompsona i płytka półfalowa. Należy również zdecydować o sposobie sterowania laserem. Można zaprojektować sterownik oparty na LabView, użyć komercyjnego generatora TTL lub oprogramowania dostarczonego przez producenta lasera. Opcje te należy omówić z konkretnym producentem lasera.
Przedstawiona lista wykorzystanego sprzętu służy jedynie jako ogólna wskazówka. Opisany tutaj system kosztował około 15 000 USD przy rozbudowie naszego istniejącego systemu obrazowania. W lokalnych wydziałach fizyki zazwyczaj można znaleźć osobę, która chętnie wprowadzi w praktykę bezpiecznej pracy z laserami z otwartą wiązką.
W literaturze opisano niedawno alternatywne metody unieruchamiania i obrazowania poklatkowego C. elegans.14
Rozwiązywanie problemów
Najtrudniejszym i najbardziej krytycznym etapem jest dopasowanie wycentrowanej wiązki rozszerzonej do osi optycznej mikroskopu. Po wycentrowaniu i rozszerzeniu wiązki za pomocą soczewek Galileusza należy dołożyć wszelkich starań, aby dopasować ją z dokładnością do 5 um względem osi optycznej mikroskopu PRZED użyciem luster sterujących do końcowej regulacji centrowania. Nadmierne korzystanie z luster sterujących w celu dopasowania wiązki do mikroskopu spowoduje przesunięcie jej poza oś rozszerzacza wiązki. ZACHOWUJĄC NAJWYŻSZA OSTROŻNOŚĆ można osłabić wiązkę laserową za pomocą odpowiedniego filtra ND i bezpośrednio obserwować profil wiązki laserowej na celu refleksyjnym (lustrze o powierzchni przedniej). Można delikatnie przesuwać mikroskop, aby precyzyjnie wycentrować wiązkę w polu widzenia obiektywu 60X (jeśli nie można jej wycentrować w zakresie góra/dół, należy dostosować wysokość szyny). Profil wiązki można wykorzystać do precyzyjnego dopasowania osi optycznej mikroskopu, aby uzyskać wycentrowaną wiązkę, która jest okrągła i symetrycznie „rozszerza się” (flaring). Asymetryczne rozszerzenie wskazuje, że oś mikroskopu nie jest idealnie dopasowana (lub szyna nie jest wypoziomowana). Na koniec należy wyregulować L3 i zaobserwować równomierne i symetryczne rozszerzanie oraz zwężanie wiązki. Należy precyzyjnie ustawić ostrość mikroskopu na powierzchni celu, a następnie wyregulować L3 tak, aby skupić wiązkę laserową w jak najmniejszym punkcie. Powinno to skutkować tym, że wiązka laserowa znajduje się w odległości do 5 um od centrum podczas obrazowania za pomocą systemu LSCM lub CCD, a punkt ablacji znajduje się w odległości do 1um od ogniska Z.
Jeśli zauważysz, że dochodzi do „rozrywania” nicieni lub systematycznie powstają duże pęcherzyki kawitacyjne podczas przecinania aksonów, problem najprawdopodobniej wynika z precyzyjnego ustawienia lasera ablacyjnego. Upewnij się, że punkt ablacji o minimalnej średnicy (&lt;500nm) jest zlokalizowany w ognisku Z (reguluj konwergencję za pomocą soczewki L3) oraz w punkcie referencyjnym XY (reguluj za pomocą ostatniego lustra zamontowanego kinematycznie).
Celowanie w aksony znajdujące się bliżej powierzchni będzie wymagało mniejszej mocy lasera. Podobnie, w przypadku mniejszych zwierząt (L1 i L2) aksonotomia będzie wymagać mniejszej mocy lasera w porównaniu do celowania w te same aksony u osobników dorosłych.
Jeśli aksony typu dzikiego nie regenerują się lub ulegają blaknięciu, należy spróbować zmniejszyć moc lasera obrazującego lub obniżyć częstotliwość próbkowania. Jeśli nicienie giną lub stają się chore, należy spróbować zmniejszyć procentową zawartość agarozy w krokach 1%. Należy upewnić się, że szkiełko nakrywki nie jest przesuwane po zamocowaniu nicieni, ponieważ w przypadku stosowania agarozy o wysokim stężeniu i mikrosfer często prowadzi to do ich śmierci.
Jeśli nicienie pękają lub giną podczas sesji time-lapse, przyczyną jest: 1. Zbyt wysokie stężenie agarozy. 2. Uszkodzenie kutykuli przez laser ablacyjny. 3. Przesunięcie szkiełka nakrywkowe po montażu. Jeśli przyczyną jest uszkodzenie kutykuli, dotyczyć będzie ono wyłącznie zamontowanych nicieni, które były poddawane działaniu lasera ablacyjnego.
Jeśli robak zbyt mocno porusza się podczas sesji time-lapse, należy spróbować zwiększyć stężenie agarozy w krokach 0,5%. Zdrowe aksony u zdrowych osobników są zawsze „aktywne” i wykazują stały poziom fluorescencji. Jeśli zauważysz nagły spadek fluorescencji lub aktywności, oznacza to, że robak obumiera lub jest martwy. Liczne paciorkowate lub pofragmentowane aksony są pewnym znakiem obumierającego lub martwego osobnika.
Jeśli mają Państwo problem z utrzymaniem aksonów w ognisku przez całą sesję time-lapse, przyczyną może być kilka różnych problemów. W pierwszej kolejności należy sprawdzić dryft stolika, obrazując obojętny preparat na szkiełku przedmiotowym przez 10 hrs. Dryft rzędu kilku mikronów może wynikać z niestabilności termicznej, ale przesunięcie większe niż 5 um prawdopodobnie wynika z problemów mechanicznych mikroskopu. Częściej występują problemy z montażem. Przed rozpoczęciem sesji time-lapse należy pozwolić zamocowanym nicieniom na wyrównanie temperatury ze stolikiem mikroskopu przez 30 minut. Należy również sprawdzić, czy uszczelnienie z wazeliny nie uległo rozszczelnieniu w trakcie sesji time-lapse.

<table><tbody><tr><td>Nazwa odczynnika</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi (opcjonalnie)</td></tr><tr><td>Laser 535 nm</td><td>Crylas</td><td>FDSS532Q3</td><td>(TEEM, Crystal oraz CRC oferują również porównywalne lasery)</td></tr><tr><td>Wszystkie elementy optyczne i sprzęt</td><td></td><td></td><td>(Thor oferuje porównywalną optykę i sprzęt)</td></tr><tr><td>Uchwyt optyczny SUPREMA, średnica 1,0 cala</td><td>Newport Corp.</td><td>SS100-F2KN</td><td>2</td></tr><tr><td>Słupek o średnicy 1&quot;, wysokości 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Widelec do słupka o średnicy 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Achromatyczna płytka falowa zerowego rzędu, opóźnienie &amp;frac12; fali, 400-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10RP52-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Stoły obrotowy, otwór 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>RSP-1T</td><td>1</td></tr><tr><td>Słupek o średnicy 1&quot;, wysokości 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Widelec do słupka o średnicy 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Polaryzator kalcytowy Glan-Laser, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10GL08AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>Obrotowy uchwyt polaryzatora</td><td>Newport Corp.</td><td>RM25A</td><td>1</td></tr><tr><td>Dystans &amp;#188;&quot; do słupka o średnicy 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.25</td><td>1</td></tr><tr><td>Słupek o wysokości &amp;frac12;&quot; i średnicy 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.5</td><td>1</td></tr><tr><td>Widelec do słupka o średnicy 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Pułapka wiązki</td><td>Newport Corp.</td><td>PL15</td><td>1</td></tr><tr><td>Uchwyt obiektywu mikroskopowego</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-OBJ1</td><td>1</td></tr><tr><td>Słupek o średnicy 1&quot;, wysokości 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>Widelec do słupka o średnicy 1&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Lustro laserowe Nd:YAG wysokiej energii, średnica 25,4 mm, 45&amp;#x00B0;, 532 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10Q20HE.2</td><td>4</td></tr><tr><td>Uchwyt optyczny SUPREMA, średnica 1,0 cala, z otworem montażowym</td><td>Newport Corp.</td><td>SN100C-F</td><td>2</td></tr><tr><td>Precyzyjna śruba regulacyjna z pokrętłem, zakres 12,7 mm, 100 TPI</td><td>Newport Corp.</td><td>AJS100-0.5K</td><td>4</td></tr><tr><td>Adapter gwintowy, &amp;#188;-20 zewnętrzny, 8-32 wewnętrzny</td><td>Newport Corp.</td><td>SS-1-B</td><td>2</td></tr><tr><td>Zacisk prętowy do pręta o średnicy 1,5 cala</td><td>Newport Corp.</td><td>340-RC</td><td>2</td></tr><tr><td>Pręt, wysokość 14 cali (35,5 cm)</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>1</td></tr><tr><td>Wózek szynowy dla X26, kwadratowy, długość 40 mm</td><td>Newport Corp.</td><td>CN26-40</td><td>4</td></tr><tr><td>Szyna stalowa, długość 384 mm (15&quot;)</td><td>Newport Corp.</td><td>X26-384</td><td>1</td></tr><tr><td>Platforma prętowa dla pręta o średnicy 1,5 cala</td><td>Newport Corp.</td><td>300-P</td><td>2</td></tr><tr><td>Pręt, wysokość 14 cali (35,5 cm)</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>2</td></tr><tr><td>Soczewka plano-wklęsła, średnica 12,7 mm, EFL -25 mm, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPC025AR.14</td><td>2</td></tr><tr><td>Soczewka plano-wypukła, średnica 25,4 mm, EFL 50,2 mm, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX082AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>Soczewka plano-wypukła, średnica 25,4 mm, EFL 62,9 mm, 430-700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX085AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>Stały uchwyt soczewki, średnica 0,5&quot;, wysokość osi 1,0&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-0.5</td><td>2</td></tr><tr><td>Stały uchwyt soczewki, średnica 1,0&quot;, wysokość osi 1,0&quot;</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-1</td><td>2</td></tr><tr><td>Mikrosfery 0,1 µm</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td>EEO matters</td></tr><tr><td>Muscimol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1523</td><td></td></tr></tbody></table>

budowa niskobudżetowego systemu laserowej aksonotomii do badania regeneracji aksonów u c. elegans

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Aksonotomia laserowa z następującą za nią mikroskopią poklatkową jest czułym testem fenotypów regeneracji aksonów u C. elegans1. Główną trudnością w tym badaniu jest postrzegany koszt (25-100 tys. USD) oraz wiedza techniczna wymagana do wdrożenia systemu ablacji laserowej2,3. Jednakże impulsowe lasery półprzewodnikowe o umiarkowanych kosztach (&lt;10 tys. USD) mogą zapewnić niezawodne działanie podczas ablacji laserowej w preparatach przezroczystych, w których docelowe aksony znajdują się „blisko” powierzchni tkanki. Konstrukcja i wyrównanie systemu mogą zostać zrealizowane w ciągu jednego dnia. Tor optyczny od światła skupionego kondensatora do lasera ablacyjnego stanowi wygodny przewodnik do wyrównania. Moduł pośredni z usuniętą całą optyką może zostać przeznaczony dla lasera ablacyjnego, co gwarantuje, że żadne elementy optyczne nie muszą być przesuwane podczas sesji ablacji laserowej. Lustro dichroiczne w module pośrednim umożliwia jednoczesne obrazowanie i ablację laserową. Centrowanie wiązki lasera względem wiązki wychodzącej z ogniskujejącej soczewki kondensatora mikroskopu prowadzi początkowe wyrównanie systemu. Różnorodne soczewki są wykorzystywane do kondycjonowania i rozszerzania wiązki laserowej w celu wypełnienia tylnej apertury wybranej soczewki obiektywu. Końcowe wyrównanie i testowanie przeprowadza się z użyciem szkiełka przedmiotowego z lustrem na przedniej powierzchni jako celu. Moc lasera jest dostosowywana tak, aby uzyskać minimalną wielkość punktu ablacyjnego (&lt;1um). Punkt ablacyjny jest centrowany za pomocą precyzyjnych regulacji ostatniego lustra zamontowanego kinematycznie, tak aby przeciął się z nitkami utrwalonymi w oknie obrazowania. Moc lasera do aksonotomii będzie około 10X wyższa niż ta potrzebna do uzyskania minimalnego punktu ablacyjnego na szkiełku docelowym (wartość ta może się różnić w zależności od użytego celu). Nicienie mogą być unieruchomione do aksonotomii laserowej i obrazowania poklatkowego poprzez montaż na podkładkach agarozy (lub w komorach mikroprzepływowych4). Podkładki agarozy łatwo przygotować z 10% agarozy w soli zrównoważonej, roztopionej w mikrofalówce. Kroplę stopionej agarozy umieszcza się na szkiełku przedmiotowym i spłaszcza drugim szkiełkiem przedmiotowym do postaci podkładki o grubości około 200 um (jako przekładki stosuje się pojedynczą warstwę taśmy czasowej na sąsiednich szkiełkach). Nakrętka markera typu „Sharpie” służy do wycięcia okrągłej podkładki o jednolitej średnicy 13mm. Do środka podkładki dodaje się środek znieczulający (1ul muscimolu 20mM) i mikrosfery (komunikacja osobista z Chrisem Fang-Yenem) (1ul 2,65% polistyrenu 0,1 um w wodzie), a następnie 3-5 nicieni zorientowanych tak, aby leżały na lewym boku. Nakłada się szkiełko cover-slip, a następnie używa wazeliny do uszczelnienia szkiełka i zapobiegania odparowaniu próbki.

Aksonotomia laserowa z następującym po niej obrazowaniem time-lapse jest czułą metodą badania wpływu mutacji u C. elegans na regenerację aksonów. Wysokiej jakości, a jednocześnie niedrogi system ablacji laserowej można z łatwością dołączyć do większości mikroskopów. Obrazowanie time-lapse trwające 15 godzin wymaga starannego unieruchomienia nicienia.

Budowa niskobudżetowego systemu laserowej aksonotomii do badania regeneracji aksonów u C. elegans

Aksonotomia laserowa z następującą po niej mikroskopią poklatkową jest czułą metodą badania fenotypów regeneracji aksonów u C. elegans1. Główną trudnością w tej metodzie...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu montażu i ustawiania systemu ablacji laserowej do badania regeneracji aksonów w organizmach C. elegans. Jest to realizowane poprzez zamontowanie polaryzatora laserowego, płytki półfalowej Thomsona, lustra odchylającego, peryskopu szynowego oraz lustra szynowego na płycie optycznej. Kolejnym krokiem procedury jest dopasowanie wiązki lasera do wiązki wychodzącej z soczewki kondensora mikroskopu.Następnie zamontowano, wyrównano i ustawiono soczewkę ekspandera wiązki laserowej, aby wycentrować wiązkę lasera i sprawić, by była ona niedywergentna. Ostatnim krokiem procedury jest dopasowanie plamki ablacji laserowej do ogniska obrazu poprzez wprowadzenie precyzyjnych korekt. W rezultacie, przy zastosowaniu wiązki laserowej o dyfrakcyjnej granicy skupienia, możliwe jest precyzyjne przecięcie aksonów o grubości pół mikrona przy minimalnym uszkodzeniu tkanek sąsiednich, nawet w przypadku niedoskonałego wyrównania XY NC.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak lasery femtosekundowe, jest jej stosunkowo niski koszt wynoszący 15 000. Jest ona praktycznie bezobsługowa i zapewnia bardzo precyzyjne przecinanie aksonów. Chociaż metoda ta pozwala na badanie regeneracji aksonów u C. elegans, może być ona również zastosowana w innych systemach, takich jak muszki owocowe, rybki danio-pręgowane, myszy, obwodowy układ nerwowy oraz komórki in vitro.W zasadzie każda komórka znajdująca się w odległości od 30 do 50 µm od powierzchni. Rozpocznij od rozmieszczenia komponentów na płycie montażowej, a następnie przykręć statyw peryskopu laserowego oraz podwyższone podpory szyny. System ten wykorzystuje laser klasy 3B, który może łatwo uszkodzić wzrok, dlatego prosimy o rygorystyczne przestrzeganie zasad bezpieczeństwa pracy z laserem.Skonsultuj się z pracownikami lokalnego instytutu fizyki w celu zapoznania się z zasadami bezpiecznej pracy z laserami o wiązce otwartej. Podczas procesu pozycowania zawsze ustawiaj laser na najniższą moc. Sprawdzając obraz przez okulary, upewnij się, że wiązka lasera jest mechanicznie przesłonięta, a urządzenie jest wyłączone.Następnie ustaw mikroskop: najpierw wyrównaj go z osią szyny. Po drugie, wyrównaj go z wiązką światła przechodzącego z soczewki kondensora mikroskopu. Po trzecie, wyrównaj oba końce szyny z wiązką kondensora, używając przymocowanej do szyny regulowanej apertury lub soczewki.Przed kontynuacją należy użyć poziomicy oraz podnośników laboratoryjnych, aby wyregulować wysokość szyny. Należy upewnić się, że oba końce szyny są wyrównane. Następnie należy sprawdzić, czy wiązka lasera przechodzi przez gniazdo, polaryzator Thompsona i płytkę półfalową i nie uderza w ich krawędzie podczas obrotu.Płytka półprzepuszczalna posłuży do regulacji mocy lasera po zamocowaniu wszystkich komponentów do stołu optycznego. Włącz laser, ustaw częstotliwość impulsów na tryb ciągły 100 i zredukuj moc do minimum za pomocą płytki półprzepuszczalnej. Aby zwizualizować wiązkę lasera, użyj karteczki samoprzylepnej lub papieru do soczewek.Następnie należy skierować wiązkę lasera w górę z płyty optycznej. Należy kolejno regulować i mocować lustra w oprawach kinematycznych, zaczynając od lasera, aby doprowadzić wiązkę do lustra zamontowanego na końcu podwyższonej szyny. Po zakończeniu wiązka lasera powinna być wyrównana w przybliżeniu do środka luster, a lustra powinny być ustawione pod kątem około 45 stopni względem osi wiązki lasera, przed przystąpieniem do wyrównania wiązki lasera z wiązką światła transmitowanego mikroskopu.Zdejmij lub otwórz wszelkie filtry ND oraz przysłony w module pośrednim. Przystępujemy teraz do najważniejszego etapu, aby zapewnić precyzyjne przecięcie aksonów bez nadmiernych uszkodzeń pobocznych. Dokonamy precyzyjnego ustawienia lasera w osiach x, y i Z przy najniższej mocy lasera, aby uzyskać najmniejszą plamkę ablacji.Wiązka lasera oraz wiązka światła przechodzącego są widoczne jednocześnie na papierze. Na początek umieść papier w pobliżu otworu mikroskopu. Następnie przystąp do ustawiania lasera, korzystając z pokręteł wstępnych lustra na górze peryskopu oraz lustra na końcu szyny.Umieść arkusz papieru pomiędzy wyrównaną soczewką kondensora a otwartym obrotowym uchwytem obiektywów. Kontynuuj regulację za pomocą pokręteł precyzyjnych lustra na szynie, aby wyrównać wiązkę lasera ze środkiem szerszej wiązki światła przechodzącego. Następnie unieruchom mikroskop za pomocą zacisków.Dodatkowe kroki dotyczące oceny wyrównania lasera znajdują się w tekście manuskryptu. Należy zainstalować podwójne galileuszowe rozszerzacze wiązki, aby 33-krotnie rozszerzyć wiązkę lasera o średnicy 300 micron, w celu wypełnienia tylnej apertury obiektywu 10 millimeter. Rozpocznij od zamontowania czterech soczewek w uchwytach.Następnie przymocuj soczewki do szyny w taki sposób, aby wszystkie znajdowały się na tej samej osi optycznej i były ustawione dokładnie prostopadle do wiązki lasera. Włącz laser i ustaw go na minimalną moc oraz tryb ciągły. Wykonaj wstępną regulację wyrównania wiązki przechodzącej przez każdą soczewkę.Użyj papieru, aby zobaczyć wiązkę. Teraz wyłącz laser. Zastosuj przesłonę bezpieczeństwa do lasera i usuń mikroskop z drogi wiązki laserowej.Ponownie włącz laser i zwizualizuj wiązkę na pobliskiej ścianie. Użyj precyzyjnej regulacji soczewek, aby poszerzyć wiązkę. Następnie ustaw dwa ostatnie lustra w mocowaniach kinematycznych, aby skierować wiązkę w formie koła o jednorodnej jasności do szacowanej pozycji tylnej apertury obiektywu.Oceń rozmiar i jednorodność wiązki na papierze. Następnie ustaw wiązkę na zerową konwergencję, obserwując zmiany jej rozmiaru podczas oddalania papieru od soczewki. Wyłącz laser i zamknij migawkę mechaniczną.Przesuń mikroskop z powrotem na drogę wiązki lasera, używając stałych zacisków do zdefiniowania prawidłowego wyrównania. Załóż zaciski po wolnej stronie mikroskopu, ale nie dokręcaj ich. Teraz włącz laser.Zdejmij osłonę zabezpieczającą i obróć rewolwer obiektywów do pozycji otwartej, kładąc papier na stole przedmiotowym; rozszerzona i jednorodna wiązka lasera powinna być widoczna i wycentrowana względem wiązki światła przechodzącego z kondensora. Jeśli wiązki nie są wycentrowane, należy je wyrównać, poluzowując zaciski mikroskopu i ostrożnie przesuwając urządzenie. Następnie zamknij osłonę zabezpieczającą i ustaw laser w tryb wyzwalania.Obróć obiektyw 60x na miejscu. Teraz wykonaj obraz powierzchniowych zarysowań na szkiełku obiektowym. Usuń migawkę zabezpieczającą, uruchom laser ablacyjny i dostosuj moc lasera, aby uzyskać minimalny punkt ablacji.Plamka powinna być okrągła i znajdować się w odległości od 5 do 10 mikronów od środka obrazu, który stanowi centrum plamki ablacyjnej. Aby utrzymać plamkę w centrum i zapewnić jednorodny profil wiązki, konieczne będzie iteracyjne regulowanie lustra na szynie kinematycznej oraz górnego lustra peryskopu przy użyciu pokręteł precyzyjnych. Należy ocenić ostrość w osi Z lasera, systematycznie przesuwając ognisko w górę i w dół w krokach o wielkości jednego mikrona, wyzwalając laser ablacyjny na każdym etapie.Jeśli wiązka jest prawidłowo rozszerzona, wyrównana i posiada odpowiednio dostrojoną zbieżność, ablacja powinna być maksymalna w punkcie ogniskowania obrazu oraz słaba lub nieobecna jeden mikron powyżej lub poniżej tego punktu. Jeśli maksymalna plamka ablacji znajduje się powyżej lub poniżej ogniskowania obrazu, należy dokonać końcowych korekt ogniskowej osi Z rozszerzonej wiązki poprzez przesuwanie soczewki L3 teleskopu Galileusza, aż ablacja laserowa będzie zgodna z ogniskowaniem obrazu. Nicienie zamocowano na dostosowanym szkiełku, a aksony usunięto za pomocą skonstruowanego systemu Laser exo somy; obrazowanie regeneracji aksonów w trybie time-lapse było bardzo stabilne.Dzięki zastosowaniu zmotoryzowanego stolika możliwe było rutynowe i precyzyjne przecięcie oraz obrazowanie pięciu aksonów u pięciu różnych zwierząt na jednym szkiełku. Czas obrazowania aksonów stanowił czynnik ograniczający.Około 10% eksperymentów pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości filmów time-lapse. Pozostałe eksperymenty dostarczyły dobrych danych, lecz były mniej atrakcyjne pod względem estetycznym ze względu na niewielkie, drgające ruchy nicienia, które zazwyczaj rozpoczynały się po pięciu do ośmiu godzinach unieruchomienia. Podczas przeprowadzania tej procedury zawsze istotna jest dokładna ocena wyrównania lasera w osiach x, y i Z.Najczęstszym problemem podczas prób przecinania aksonów są uszkodzenia poboczne lub całkowita niezdolność do przecięcia aksonów, co niemal zawsze wynika z błędnego ustawienia lasera. Ten system ablacji laserowej oraz technika wizualizacji regeneracji aksonów w c Agains pozwolą na rutynowe badanie wpływu dowolnej mutacji genetycznej na regenerację aksonów. NCL Agains.

constructing-low-budget-laser-axotomy-system-to-study-axon

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Budowanie niedrogiego systemu aksotomii laserowej do badania regeneracji aksonów w C. elegans

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Przedstawiono protokół przecinania neuronów u C. elegans przy użyciu impulsowego lasera MicroPoint. Opisujemy konfigurację systemu, unieruchamianie nicieni oraz przecinanie znakowanych neuronów. Zalety obejmują relatywnie niski koszt systemu oraz możliwość przecinania wypustek neuronalnych lub ablacji komórek in vivo.

In vivo laserowa aksonotomia u C. elegans

Ten film opisuje dwufotonową laserową ablację aksonów u larwy Drosophila melanogaster oraz przykładowy protokół wywoływania obrażeń i obrazowania miejsca urazu.

Uszkodzenie neuronów wywołane laserem dwufotonowym: metoda obserwacji zwyrodnienia i regeneracji aksonów u larw Drosophila

Ten film przedstawia metodę laserowego ranienia, która jest używana do powodowania bardzo precyzyjnych uszkodzeń naskórka robaka. Przykładowy protokół pochodzi z badania reakcji i naprawy ran.

Laserowe ranienie naskórka: wywoływanie miejscowych uszkodzeń w celu zbadania procesów naprawczych u C. elegans

Ten film opisuje metodę uszkadzania aksonów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą aksotomii lasera dwufotonowego i obserwacji regeneracji aksonów po urazie.

Aksotomia lasera dwufotonowego: metoda uszkadzania aksonów w zarodkach danio pręgowanego i obserwowania regeneracji aksonów

Ten film demonstruje metodę wywoływania ukierunkowanego uszkodzenia neuronów u larw Drosophila za pomocą lasera o dużej mocy. Po umieszczeniu larwy pod mikroskopem, laser o małej mocy skanuje w poszukiwaniu neuronów fluorescencyjnych, a następnie zwiększa moc lasera w celu wywołania miejscowego uszkodzenia. Uraz potwierdza zwiększona fluorescencja i krater w miejscu urazu.

Wywoływanie ukierunkowanego uszkodzenia neuronów za pomocą lasera o dużej mocy u larwy Drosophila

Obrazowanie dwufotonowe, sprzężone z nanodysekcją laserową, są użytecznymi narzędziami do badania procesów zwyrodnieniowych i regeneracyjnych w ośrodkowym układzie nerwowym z rozdzielczością subkomórkową. Protokół ten pokazuje, jak oznaczać, obrazować i preparować pojedyncze włókna pnące w korze móżdżku in vivo.

Laserowa nanochirurgia aksonów móżdżku in vivo

Skóra dorosłego C. elegans jest łatwym modelem do badań nad reakcjami na rany nabłonkowe, w tym zamykaniem ran, tworzeniem blizn i odpornością wrodzoną.

Metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący model uszkodzenia neuronów neuronu czuciowego Drosophila - dendrytycznej arboryzacji (da), który łączy obrazowanie na żywo in vivo, dwufotonową laserową aksotomię/dendriotomię oraz potężny zestaw narzędzi genetycznych much, jako platformę do badań przesiewowych potencjalnych promotorów i inhibitorów neuroregeneracji.

Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Poznaj metodę budowy niskobudżetowego systemu laserowej aksotomii do badania regeneracji aksonów u C. elegans. Technika umożliwia precyzyjne cięcie z minimalnymi uszkodzeniami pobocznymi.

Budowa niskobudżetowego systemu laserowej aksonotomii do badania regeneracji aksonów u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów