Budowa niskobudżetowego systemu do aksotomii laserowej do badania regeneracji aksonów u C. elegans
15 listopada 2011
Aksotomia laserowa, po której następuje obrazowanie poklatkowe, jest czułym sposobem na zbadanie wpływu mutacji u C. elegans na regenerację aksonów. Wysokiej jakości, ale niedrogi system ablacji laserowej można łatwo dodać do większości mikroskopów. Obrazowanie poklatkowe powyżej 15 godzin wymaga starannego unieruchomienia robaka.
Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak zmontować i ustawić system ablacji laserowej do badania regeneracji aksonów w CL gans. Osiąga się to poprzez uprzednie zamontowanie dławika laserowego, polaryzatora Thompsona, półfalowego zwierciadła obrotowego, szyny peryskopowej i lustra szynowego na płytce stykowej. Kolejnym krokiem procedury jest wyrównanie wiązki laserowej z wiązką wychodzącą z soczewki kondensatora mikroskopu.
Następnie soczewka ekspandera wiązki laserowej zamontowana, wyrównana i ustawiona tak, aby wyśrodkować wiązkę laserową i sprawić, że będzie ona zerowa. Ostatnim krokiem zabiegu jest dostosowanie plamki ablacji laserowej do ostrości obrazu poprzez dokonanie precyzyjnych regulacji. Ostatecznie możliwe jest precyzyjne cięcie aksonów półmikronowych przy minimalnym ubocznym uszkodzeniu tkanek przy użyciu wiązki laserowej ograniczonej dyfrakcją, gdy jest to niedoskonałe wyrównanie XY NC.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak drugie lasery Femto, jest to, że jest stosunkowo niedroga i wynosi 15 000. Jest stosunkowo bezobsługowy i zapewnia bardzo precyzyjne cięcie aksonów. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w regenerację aksonów Sea Elgan, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak muchy, danio pręgowany, obwodowy układ nerwowy i komórki in vitro.
Zasadniczo każda komórka, która znajduje się w odległości od 30 do 50 mikrometrów od powierzchni. Zacznij od elementów umieszczonych na płytce stykowej i przykręć laserowy słupek peryskopowy i podniesione wsporniki szyn. Ten system wykorzystuje laser klasy trzeciej B, który może łatwo uszkodzić oczy, dlatego należy poważnie traktować bezpieczeństwo lasera.
Porozmawiaj z kimś z lokalnego wydziału fizyki o tym, jak bezpiecznie pracować z laserami o swobodnej wiązce. Zawsze podczas procesu wyrównywania ustaw laser na najniższą moc. Kiedy patrzysz przez okulary, upewnij się, że laser jest mechanicznie zamknięty, a laser jest wyłączony.
Teraz najpierw ustaw mikroskop, wyrównaj go z osią szyny. Po drugie, wyrównaj go z wiązką światła przepuszczanego z soczewki kondensatora mikroskopu. Po trzecie, dopasuj oba końce szyny do belki skraplacza za pomocą regulowanej apertury lub soczewki przymocowanej do szyny.
Użyj poziomicy i podnośników laboratoryjnych, aby wyregulować wysokość szyny przed kontynuowaniem. Upewnij się, że oba końce szyny są wyrównane. Teraz upewnij się, że wiązka lasera przechodzi przez dławnicę, polaryzator Thompsona i płytkę w połowie drogi i nie uderza w ich obracające się krawędzie.
Płytka pośrednia dostosuje moc lasera ze wszystkimi elementami przymocowanymi do płytki stykowej. Włącz laser, ustaw częstotliwość impulsów na 100 w trybie ciągłym i zmniejsz moc do minimum za pomocą płytki półdrożnej. Użyj karteczki samoprzylepnej lub papieru do soczewek, aby zobrazować wiązkę laserową.
Teraz, aby podnieść wiązkę laserową z płytki stykowej. Wyreguluj i zamocuj kinematycznie zamontowane lustra w kolejności od lasera, aby skierować wiązkę do lustra zamontowanego na końcu podwyższonej szyny. Po zakończeniu wiązka laserowa powinna być ustawiona mniej więcej do środka luster, a lustra powinny być ustawione pod kątem około 45 stopni do osi wiązki laserowej przed wyrównaniem wiązki laserowej z wiązką światła przechodzącego mikroskopu.
Wyjmij lub otwórz wszystkie filtry ND i otwory w module pośrednim. Teraz rozpoczynamy najbardziej krytyczny krok, aby zapewnić precyzyjne cięcie aksonów bez nadmiernych uszkodzeń ubocznych. Ustawimy laser dokładnie w osiach x, y i z przy najniższej mocy lasera, aby uzyskać najmniejszą plamkę ablacji.
Laser i przechodzące wiązki światła mogą być widoczne jednocześnie na papierze. Umieść papier w pobliżu portu mikroskopu, aby rozpocząć. Teraz rozpocznij wyrównywanie lasera, korzystając z regulacji kursu na lustrze na górze peryskopu i lustrze na końcu szyny.
Umieść papier między wyrównaną soczewką kondensatora a otwartą wieżyczką obiektywu. Kontynuuj korzystanie z precyzyjnych regulacji lustra szynowego, aby wyrównać wiązkę laserową do środka większej wiązki światła przepuszczanego. Teraz zamocuj mikroskop na miejscu za pomocą zacisków.
Dodatkowe kroki dotyczące oceny wyrównania lasera można znaleźć w pisemnym manuskrypcie. Należy zainstalować podwójne ekspandery wiązki Galileusza, aby 33-krotnie rozszerzyć wiązkę laserową o grubości 300 mikronów, aby wypełnić tylny otwór obiektywu o średnicy 10 milimetrów. Zacznij od zamontowania czterech soczewek na nośnikach.
Następnie przymocuj soczewki do szyny tak, aby wszystkie znajdowały się na tej samej osi optycznej i dokładnie prostopadłe do wiązki laserowej. Włącz laser i ustaw go na minimalną moc i na tryb ciągły. Z grubsza dostosuj wyrównanie wiązki przez każdą soczewkę.
Użyj papieru, aby zobaczyć wiązkę. Teraz wyłącz laser. Zastosuj migawkę bezpieczeństwa do lasera i usuń mikroskop z toru wiązki laserowej.
Włącz ponownie laser i wyobraź go sobie na tle pobliskiej ściany. Użyj precyzyjnej regulacji soczewek, aby rozszerzyć wiązkę. Następnie wyreguluj dwa ostatnie kinematycznie zamontowane lustra, aby wyrównać wiązkę w okrąg o jednolitej jasności w szacowanym położeniu tylnej apertury obiektywu.
Wyświetlanie rozmiaru i jednorodności wiązki względem papieru. Następnie dostosuj zbieżność wiązki do zera, zwracając uwagę na to, jak zmienia się rozmiar wiązki wraz z oddalaniem papieru od soczewki. Wyłącz laser i włącz migawkę mechaniczną.
Wsuń mikroskop z powrotem na ścieżkę wiązki laserowej za pomocą stałych zacisków, aby określić prawidłowe ustawienie. Wymień clamps po wolnej stronie mikroskopu, ale nie dokręcaj ich. Teraz włącz laser.
Zdejmij migawkę bezpieczeństwa i obróć wieżyczkę obiektywu do pozycji otwartej za pomocą papieru na stoliku, a rozszerzona i jednolita wiązka laserowa wyśrodkowana na wiązce światła przepuszczanego z kondensatora powinna być widoczna. Jeśli nie jest wyśrodkowany, wyśrodkuj wiązki, poluzowując zaciski mikroskopu i ostrożnie popychając mikroskop. Teraz włącz migawkę bezpieczeństwa i ustaw laser w trybie wyzwalania.
Obróć obiektyw 60 razy w miejscu. Teraz obraz powierzchni rysuje się na prowadnicy docelowej. Zdejmij migawkę bezpieczeństwa, uruchom laser ablacyjny i dostosuj moc lasera do minimalnego miejsca ablacji.
Plamka powinna być okrągła i znajdować się w odległości od pięciu do 10 mikronów od środka obrazu, środka, plamki ablacyjnej. Korzystając z precyzyjnych regulacji kinematycznie zamontowanego lustra szynowego, aby utrzymać punkt wyśrodkowany i jednolity profil wiązki, konieczne będzie iteracyjne dostosowanie lustra montowanego na szynie i górnego lustra peryskopowego. Oceń ognisko Z lasera, systematycznie przesuwając ognisko w górę i w dół w krokach co jeden mikron, uruchamiaj laser ablacyjny na każdym kroku.
Jeśli wiązka jest prawidłowo rozciągnięta i wyrównana oraz z prawidłowo wyregulowaną zbieżnością, to powinna maksymalnie wykonać ablację przy ostrości obrazu i słaba lub wcale, jeden mikron powyżej lub poniżej ogniskowej. Jeśli maksymalna plamka ablacji znajduje się powyżej lub poniżej ostrości obrazu, dokonaj ostatecznych korekt ogniska Z rozszerzonej wiązki, przesuwając soczewkę L 3 teleskopu Galileusza, aż ablacja laserowa będzie zgodna z ostrością obrazu. Nicienie zamontowano na dostosowanym do potrzeb szkiełku, a aksony poddano ablacji za pomocą skonstruowanego systemu: laserowa egzosomia i obrazowanie poklatkowe regeneracji aksonów były bardzo solidne.
Korzystając ze zmotoryzowanego stolika, możliwe było rutynowe i precyzyjne wycinanie i obrazowanie pięciu aksonów u pięciu różnych zwierząt. Na jednym slajdzie. Czynnikiem ograniczającym był czas obrazowania aksonów.
Około 10% eksperymentów pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości filmów poklatkowych. Pozostałe eksperymenty dostarczyły dobrych danych, ale były estetycznie mniej atrakcyjne z powodu niewielkich ruchów drgań robaka, które zwykle rozpoczynały się po pięciu do ośmiu godzinach unieruchomienia. Podczas wykonywania tej procedury zawsze ważne jest, aby dokładnie ocenić ustawienie lasera w osiach x, y i z.
Najczęstszym problemem, z jakim borykają się ludzie próbujący przeciąć akson, jest uszkodzenie uboczne lub całkowita niemożność przecięcia aksonów, a prawie zawsze jest to spowodowane niewspółosiowością lasera. Ten system ablacji laserowej i technika wizualizacji regeneracji aksonów w c Agains pozwoli Ci rutynowo ocenić wpływ dowolnej mutacji genetycznej na regenerację aksonów. NCL przeciwko.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę montażu i kalibracji systemu ablacji laserowej służącego do badania regeneracji aksonów u C. elegans. Technika ta umożliwia precyzyjne przecinanie aksonów przy minimalnych uszkodzeniach pobocznych, co czyni ją wartościowym narzędziem dla badaczy w dziedzinie neuronauki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biologia komórki
Wstęp
- Regeneracja aksonów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów naprawy neuronów.
- Tradycyjne metody przecinania aksonów mogą powodować znaczne uszkodzenia poboczne.
- Ablacja laserowa stanowi precyzyjną alternatywę do badania regeneracji.
- C. elegans służy jako organizm modelowy do badania tych procesów.
Cel badania
- W celu zademonstrowania montażu i kalibracji systemu ablacji laserowej.
- W celu przedstawienia protokołu badania regeneracji aksonów u C. elegans.
- W celu wskazania zalet tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami.
Zastosowane metody
- Montaż komponentów laserowych na płycie optycznej.
- Ustawienie wiązki lasera w osi optycznej mikroskopu.
- Zastosowanie lasera klasy 3B do precyzyjnego przecinania aksonów.
- Obrazowanie time-lapse w celu monitorowania regeneracji aksonów przez 15 godzin.
Główne wyniki
- System ablacji laserowej umożliwia przecinanie aksonów przy minimalnych uszkodzeniach.
- Precyzyjne ustawienie jest kluczowe dla osiągnięcia optymalnych wyników.
- Metodę tę można dostosować do zastosowania w różnych organizmach modelowych.
- Obrazowanie time-lapse skutecznie rejestruje proces regeneracji.
Wnioski
- Ta technika ablacji laserowej jest ekonomicznym narzędziem w badaniach z zakresu neuronauki.
- Pozwala ona na lepsze zrozumienie mechanizmów regeneracji aksonów.
- Adaptacyjność tej metody sprawia, że jest ona odpowiednia dla szerokiego spektrum systemów biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niskokosztowe systemy laserowej aksonotomii umożliwiają skalowalną, ilościową analizę mechanizmów regeneracji aksonów w przezroczystych organizmach modelowych. Podejście to wspiera wczesną walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w ramach portfeli badań nad neuroregeneracją, zapewniając precyzyjne i powtarzalne modele uszkodzeń. Przystępność cenowa i adaptacyjność systemu ułatwiają jego szersze zastosowanie w zespołach badawczych, przyspieszając badania nad naprawą neuronów oparte na stawianiu hipotez.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia kontrolowane uszkodzenie aksonów w celu funkcjonalnej walidacji szlaków regeneracyjnych.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez minimalizację ubocznych efektów tkankowych podczas aksonotomii.
- Ułatwia szybką weryfikację hipotez dotyczących interwencji genetycznych lub farmakologicznych w procesie naprawy neuronów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny test do ilościowego określania fenotypów regeneracji aksonów.
- Umożliwia wysokoprecyzyjną ablację przy minimalnej zmienności, co wspiera niezawodne procesy przesiewowe.
- Pozwala na integrację z obrazowaniem time-lapse, umożliwiając dynamiczną ocenę odpowiedzi regeneracyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Oferuje platformę możliwą do adaptacji w wielu systemach modelowych, zapewniając ciągłość translacyjną.
- Umożliwia prowadzenie badań porównawczych między gatunkami w celu przedklinijnej walidacji celów neuroregeneracyjnych.
- Wspiera dostosowanie wyników fenotypowych do modeli uszkodzeń neuronów istotnych dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten system laserowej aksonotomii wpisuje się w kontinuum od wczesnej fazy odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając iteracyjną walidację celu i badania mechanistyczne przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych oraz badanie szlaków w regeneracji neuronów.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki odczytu odrostu aksonów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Analityka: Umożliwia precyzyjny pomiar efektów regeneracyjnych oraz statystyczne porównanie interwencji.
- Badania translacyjne: Ułatwia adaptację do różnych organizmów modelowych w celu walidacji międzygatunkowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia modułową, kosztowo efektywną platformę do wielokrotnego zastosowania w programach B&R w zakresie neurobiologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie celów naprawy neuronalnej poprzez umożliwienie precyzyjnych, ilościowych modeli urazów.
- Wartość operacyjna: Redukuje bariery techniczne i finansowe w badaniach nad regeneracją aksonów o wysokiej przepustowości.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dzięki standaryzacji oceny fenotypu regeneracyjnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów neuroregeneracyjnych skorygowaną o ryzyko poprzez rygorystyczną wczesną walidację.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresieyustawiania optyki oraz protokołów bezpieczeństwa pracy z laserami.
- Wymaga dostępu do podstawowej mikroskopii i infrastruktury do montażu na płytach optycznych.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności warunków powodzenia urazu i obrazowania.
- Metoda jest dostosowalna do różnych przezroczystych systemów modelowych w zakresie 30–50 µm od powierzchni tkanki.
- Precyzja zależy od starannego ustawienia i regularnej kalibracji w celu uniknięcia uszkodzeń pobocznych.
