Name: Funkcjonalny test krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków przy użyciu znacznika Reporter-Gene BCG lub M.Tb (BCG lux / M.Tb lux) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj funkcjonalny test krwi pełnej do pomiaru aktywności metabolicznej prątków z użyciem znacznika reporter-gene BCG lux. Ta metoda umożliwia ocenę interakcji patogen-gospodarz w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana ze stypendiów osobistych przyznanych przez Wellcome Trust dla Beate Kampmann (056608, GRO77273).

1. Przygotowanie zapasu bakterii prątkowych BCG z reporterem lux
<ol>
 <li>Hodowla BCG luks (M. bovis szczep BCG Montreal przekształcony plazmidem wahadłowym pSMT1) przy wstrząsaniu z prędkością 20 obr./min do środkowej fazy logarytmicznej w pożywce Middlebrook 7H9 zawierającej 0,2% glicerolu, 0,05% Tween 80 i 10% wzbogacenia ADC.</li>
 <li>Przygotuj 1 ml rozcieńczenia BCG w stosunku 1:10 luks hodowlę w sterylnym PBS w probówce do lumnometru (900μl PBS + 100μl BCG luks hodowlę) w dublecie.</li>
 <li>Włożyć probówkę zawierającą aldehyd N-decylowy (substrat enzymu lucyferazy) do tylnej części urządzenia i upewnić się, że pokrywa jest zabezpieczona, a probówki znajdują się na swoich miejscach.</li>
 <li>Wypełnij wtryskiwacz luminometru podłożem za pomocą programu prime, ustawiając wtrysk 100 µl x 3 do każdej z 3 pustych probówek do wypełniania umieszczonych w luminometrze.</li>
 <li>Włożyć obie probówki do luminometru i wykonać pomiary za pomocą programu ustawionego na wstrzyknięcie 10 µl substratu do każdej probówki i odczyt przez 20 s w odstępach 1 s.</li>
 <li>Gdy stężenie roztworu zapasu osiągnie 1x108 RLU/ml do 2x108 RLU/ml (wymaga to około 3-4 dni wzrostu), dodać do hodowli w probówce typu Falcon o pojemności 50 ml taką samą objętość sterylnego 30% glicerolu i delikatnie wymieszać.</li>
 <li>Przenieś alikwoty o objętości 1,5 ml do opisanych probówek typu microtube o pojemności 2 ml z nakrętką i przechowuj w temperaturze -80°C.</li>
</ol>
2. Wyznaczanie korelacji RLU/CFU dla roztworu zapasowego oraz zawartości alikwotów
<ol>
 <li>Do kolby Erlenmeyera o pojemności 20ml z wentylowaną zakrętką wlać 15ml pożywki Middlebrook 7H9 z 10% dodatkiem ADC.</li>
 <li>Dodać 15μl hygromycyny i 30μl 20% Tween.</li>
 <li>Wyjąć fiolkę z BCG lux z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej (RT) w komorze bezpieczeństwa. Zawartość fiolki przenieść do pożywki i mocno zakręcić kolbę.</li>
 <li>Inkubować z wytrząsaniem przy 200rpm w temperaturze 37°C przez 4 dni.</li>
 <li>Każdego dnia przygotować seryjne rozcieńczenia 10-krotne (1:10, 1:10, 1:10, 1:10 0 i 1:10 0) w celu oznaczenia CFU.</li>
 <li>Przygotować równolegle takie same rozcieńczenia w dwóch powtórzeniach w celu oznaczenia luminescencji (patrz część 1.2-1.6).</li>
 <li>Przygotować dwie płyty z agarem Middlebrook 7H1 z trzema przedziałami (1 l pożywki płynnej zawierającej 0,5% glicerolu, 10% dodatku OADC, 1 ml 20% Tween oraz 1 ml hygromycyny).</li>
 <li>Wysiać 10μl każdego rozcieńczenia na segment każdej płyty, używając osobnych rozprowadzaczy i rozkładając ciecz równomiernie w obrębie poszczególnych komór.</li>
 <li>Każdą płytę zabezpieczyć parafilmem, umieścić w sterylnej plastikowej torebce, zamknąć taśmą autoklawacyjną i inkubować w temperaturze 37°C przez 2 tygodnie z odwróconymi pokrywkami.</li>
 <li>Regularnie kontrolować do czasu pojawienia się CFU (2-3 tygodnie).</li>
 <li>W celu policzenia kolonii wyjąć płyty z inkubatora i umieścić je na liczniku kolonii. Obliczyć średnią dla każdego rozcieńczenia z płyt powtórzonych.</li>
 <li>Obliczyć stosunek RLU/CFU, wykorzystując odpowiadające sobie wartości RLU i CFU dla każdego rozcieńczenia. Stosunek ten powinien wynosić od 3 do 5 RLU/CFU.</li>
</ol>
3. Przygotowanie hodowli BCG lux do inokulacji do krwi pełnej
<ol>
 <li>Do kolby Erlenmeyera o pojemności 20 ml z wentylowanym korkiem należy dodać 15 ml pożywki Middlebrook 7H9 z 10% dodatkiem ADC.</li>
 <li>Dodać 15μl higromycyny i 30μl z 20% Tween.</li>
 <li>Wyjąć fiolkę BCG luks wyjąć z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa. Zawartość fiolki dodać do pożywki i mocno zakręcić nakrętką.</li>
 <li>Inkubować z wytrząsaniem przy 20 obr./min w temperaturze 37°C przez 2 do 4 dni.</li>
 <li>Przygotuj 1 ml rozcieńczenia BCG w stosunku 1:10. luks hodowlę w sterylnym PBS w probówce do luminometru (900μl PBS + 100μl BCG luks kulturę) w dwóch powtórzeniach.</li>
 <li>Nasyć luminometr podłożem (zgodnie z powyższym opisem), delikatnie wymieszaj obie probówki za pomocą vortexa, wprowadź je do luminometru i wykonaj pomiary (zgodnie z powyższym opisem).</li>
 <li>Należy wykorzystać ten odczyt do rozcieńczenia hodowli w PBS, aby uzyskać równowartość 7x106 RLU (zapewni to inokulum o wielkości około 2x105 CFU/ml krwi oraz stosunek BCG do monocytów wynoszący około 1:1, przy założeniu liczby monocytów wynoszącej około 2x105 do 4x105 monocytów na ml krwi).</li>
</ol>
4. Przygotowanie krwi pełnej
<ol>
 <li>Pobrać od 3 do 5 ml krwi żylnej do probówki zawierającej heparynę bez konserwantów.</li>
 <li>Przenieść krew do probówki Falcon 50 ml i rozcieńczyć równą objętością pożywki RPMI 1640 zawierającej glutaminę i 25 mM HEPES (bez pen/strep).</li>
 <li>Odmierzyć trzykrotnie aliquoty po 90 μl rozcieńczonej krwi do sterylnych probówek bijou dla każdego punktu czasowego (łącznie 6 probówek: 3 dla 0 h i 3 dla 96 h). W razie potrzeby przygotować dodatkowe probówki dla kolejnych punktów czasowych.</li>
 <li>Odmierzyć dwukrotnie aliquoty po 90 μl pożywki Middlebrooks 7H9 z 10% dodatkiem ADC + 50 μg/ml hygromycyny (tej samej pożywki, której użyto do hodowli BCG lux) dla kontroli wzrostu.</li>
 <li>Dodać 10 μl rozcieńczonego szczepu BCG lux do każdej probówki z krwią oraz do 2 probówek kontroli wzrostu.</li>
 <li>Dokładnie wymieszać i umieścić poziomo 3 probówki bijou dla punktu czasowego 96 h oraz 2 kontrole wzrostu w inkubatorze kołyszącym w temperaturze 37°C, przy 20 obr./min (CO2 nie jest wymagany).</li>
</ol>
5. Pomiar luminescencji (w 0. i 96. godzinie)
<ol>
 <li>Odwiruj 3 probówki bijou przy 200g przez 10 min.</li>
 <li>Ostrożnie pobierz 30μl supernatantu, nie naruszając osadu, i przelej do mikroprowetek z nakrętką o pojemności 2ml, aby zamrozić je w temperaturze -80°C do późniejszej analizy cytokin.</li>
 <li>Do każdej probówki bijou dodaj 30μl PBS, aby uzupełnić objętość pobranego supernatantu.</li>
 <li>Odessa zawartość każdej probówki bijou do odpowiedniej probówki Falcon 50ml i dodaj do każdej z nich 8ml wody destylowanej. Uruchom czasomierz na 10 min. 
 Uwaga: Jest to etap wrażliwy na czas i ta inkubacja nie może trwać dłużej niż 10 min, licząc od momentu pierwszego kontaktu komórek z wodą.</li>
 <li>Przepłucz każdą probówkę bijou 2ml wody destylowanej i wierzgaj w wirówce (vortex) przez 5 sekund przed przelaniem zawartości do odpowiedniej probówki Falcon.</li>
 <li>Po zakończeniu 10-minutowej inkubacji odwiruj probówki Falcon przy 20g przez 10 minut.</li>
 <li>Zlej supernatantu do środka dezynfekcyjnego Surfanios.</li>
 <li>Do każdego osadu dodaj kilka szklanych kulek i wierzgaj w wirówce.</li>
 <li>Do każdej probówki dodaj 1ml sterylnego PBS i wierzgaj w wirówce.</li>
 <li>W probówkach do luminometru przygotuj dwukrotne rozcieńczenia 1:10 dla każdej próbki w PBS (90μl PBS + 10μl próbki) w punkcie czasowym 96hr. Przygotuj analogiczne rozcieńczenia dla każdej z kontroli wzrostu.</li>
 <li>Delikatnie wierzgaj probówki w wirówce, wprowadź je do luminometru i wykonaj pomiary (zgodnie z opisem powyżej). 
 Uwaga: Wyniki pomiarów trzech powtórzeń tej samej próbki nie powinny różnić się od siebie o więcej niż 15%.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
W przypadku analiz lux z krwi pełnej ważne jest użycie bakterii w logarytmicznej fazie wzrostu, tj. hodowanych przez 48–72 godziny przed inokulacją próbek, ponieważ aktywność metaboliczna jest suboptymalna bezpośrednio po wyjęciu z zamrażarki lub w fazie stacjonarnej. W celu uniknięcia zmienności, czas wstępnego wzrostu dla serii eksperymentów powinien zostać ustandaryzowany na 48 lub 72 godziny. Rysunek 1 przedstawia krzywą wzrostu reprezentatywnej kultury BCG lux. Czas podwojenia wynosi około 24 godziny aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej.
<img alt="Krzywa wzrostu bakterii, wykres przedstawiający rlu/cfu/mL w funkcji czasu (dni), dynamika populacji drobnoustrojów." src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywna krzywa wzrostu BCG luks powyżej 96 godzin w podłożu 7H9 oraz korelacja RLU i CFU.
Chociaż wartości RLU są zawsze skorelowane z CFU, liczba RLU odpowiadająca pojedynczemu CFU może się różnić w zależności od partii materiału wyjściowego, dlatego dobrą praktyką jest stosowanie tego samego mrożonego stoku w całej serii doświadczeń, aby zagwarantować stałą wielokrotność infekcji (MOI).
Tabela 1 przedstawia przykład surowych danych w momencie inokulacji (T0) oraz po 96 godzinach. Współczynniki wzrostu oblicza się za pomocą wzoru T96/T0, lecz oczywiście można mierzyć również inne odstępy czasowe. Zaleca się jednak, aby nie prowadzić hodowli powyżej 96 godzin, ponieważ następuje wtedy znaczna śmierć komórek.
<img alt="Wykres analizy wzrostu komórek; wartości RLU/ml w czasie, dzień 0 vs dzień 4; zaznaczony współczynnik wzrostu." src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Przykład surowych danych w momencie inokulacji (T0) i po 96 godzinach (T96) oraz obliczone współczynniki wzrostu od 3 dorosłych dawców.
W zależności od dostępnych odpowiedzi pamięciowych specyficznych dla antygenu, a być może również od liczby neutrofili, wskaźniki wzrostu różnią się między osobnikami, co przedstawiono tutaj na Rysunku 2 w krwi dzieci zakażeniem HIV i bez niego. Średnio małe dzieci wykazują wyższe wskaźniki wzrostu niż dorośli, osoby z dodatnim wynikiem próby tuberkulinowej (TST) mają niższe wskaźniki wzrostu niż osoby z ujemnym wynikiem TST, a pacjenci z zakażeniem HIV wykazują wysokie wskaźniki wzrostu ze względu na niedobór populacji limfocytów T CD4, które są jednymi z kluczowych mediatorów komórkowych odpowiedzi immunologicznej na prątki.
<img alt="Wykres rozrzutu porównujący dane zdrowotne; różnica istotna p &lt; 0,01; grupy zdrowej i zakażonej HIV." src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zmienność między dawcami: Współczynniki wzrostu T0 w porównaniu do 96 godzin dla grupy pacjentów, w zależności od stanu zakażenia HIV.
Powtarzalność współczynników wzrostu w określonym czasie przedstawiono na rysunku 3, który podsumowuje wyniki uzyskane od 64 dawców, od których pobrano krew dwukrotnie w ciągu 12 miesięcy, oraz od pojedynczego dawcy, od którego krew pobierano wielokrotnie w celu przeprowadzenia eksperymentów kontrolnych. Potencjalnymi przyczynami zmienności mogą być zmiany w uczuleniu na prątki grzybicy lub zmienność poziomów cytokin gospodarza, co obserwowano w wielu testach biologicznych.
<img alt="Wykresy rozrzutu powtarzalności testu BCG_lux, analiza stosunku wzrostu, porównanie dawców w czasie." src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. (a) Pojedynczy dawca w 12 przypadkach w ciągu 12 miesięcy. (b) wielu (64) dawców w dwóch okazjach w ciągu 12 miesięcy.

<ol><li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li>
<li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput%2C+India%2C+and+London%2C+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li>
<li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes%3A+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li>
<li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li>
<li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li>
<li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li>
<li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.</li>
<li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Testy bakteriobójcze w kontekście badań nad szczepionkami przeciwko gruźlicy są dobrze ugruntowane w modelach zwierzęcych, gdzie stosuje się je do przesiewania potencjalnie obiecujących kandydatów na szczepionki. Redukcja ładunku bakteryjnego w różnych narządach służy jako główny wskaźnik immunogenności.
Pierwsza generacja testów bakteriobójczych u ludzi została opracowana z wykorzystaniem wyłącznie makrofagów zainfekowanych M. tuberculosis. Głównym parametrem określającym przeżywalno...

<table><tbody><tr><td>BCG &lt;em&gt;luks&lt;/em&gt;</td><td>Różne</td><td>Przykro mi, ale nie dostarczyłeś tekstu źródłowego do przetłumaczenia. Proszę o przesłanie treści, którą chcesz przełożyć na język polski.</td><td></td></tr><tr><td>agar Middlebrook 7H11</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>bulion Middlebrook 7H9 </td><td>BD Biosciences</td><td>271310 (500 g)</td><td></td></tr><tr><td>Wzbogacanie na podłożu Middlebrook ADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212352</td><td></td></tr><tr><td>suplement Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212240</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274364</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5150</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Grupa Roche</td><td>10843555001 (20 ml)</td><td></td></tr><tr><td>N-decyloaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7384-100G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (&amp;gt;99.7%) </td><td>VWR international</td><td>101077</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny PBS</td><td>Wewnętrzny</td><td>Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 z L-glutaminą i 25 mM HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda destylowana</td><td>Wewnątrzpracowniane</td><td>Tekst źródłowy nie został dostarczony. Proszę o przesłanie treści do tłumaczenia.</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr do probówek (wymagany port wstrzykiwania)</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do luminometru, 12 x 75 mm, z pyrexu, bez kołnierza</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td></td></tr><tr><td>kolby Erlenmeyera z nakrętkami z filtrem, sterylne, z poliwęglanu, 250 ml </td><td>Corning</td><td>2150329</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi BD Vacutainer (z heparyną bez konserwantów)</td><td>BD Biosciences</td><td>367676</td><td></td></tr><tr><td>probówki Falcon 50 ml, stożkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>352077</td><td></td></tr><tr><td>7 ml polipropylenowe probówki bijou Sterilin na próbki</td><td>VWR international</td><td>99445-12</td><td></td></tr><tr><td>pojemniki Sterilin Universal (30 ml)</td><td>Laboratory Analysis LTD</td><td>128C</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki szklane o średnicy 2 mm </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z143928</td><td></td></tr><tr><td>pipety 10 ml oraz kontroler pipet (pipette boy)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&amp;mu;l i 200&amp;mu;pipety i końcówki z filtrem</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dygestorium biologiczne klasy II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lodówka (4°C)&amp;#x00B0;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platforma do wytrząsania (180&lt;sup&gt;0&lt;/sup&gt;) do mieszania probówek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką orbitalną ustawiony na 37°C&amp;#x00B0;pożywka do hodowli kultur bakteryjnych</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

funkcjonalny test z wykorzystaniem krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków, z użyciem bcg lub m.tb znakowanych genem reporterowym (bcg lux/m.tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Testy funkcjonalne od dawna odgrywają kluczową rolę w pomiarze immunogenności danej szczepionki. Konwencjonalnie wyraża się to poprzez miana bakteriobójcze surowicy. Badania mian bakteriobójczych surowicy w odpowiedzi na szczepionki dziecięce pozwoliły na opracowanie i walidację poziomów odcięcia dla ochronnych odpowiedzi immunologicznych, a takie wartości progowe są obecnie stosowane w rutynowej praktyce. Żadne podobne testy nie zostały wprowadzone do rutynowej oceny szczepionek, które indukują przede wszystkim odporność komórkową w formie odpowiedzi efektorowych limfocytów T, takich jak szczepionki przeciwko gruźlicy. W modelu zwierzęcym skuteczność kandydata na szczepionkę jest rutynowo oceniana w ustandaryzowanych testach bakteriobójczych, a wszystkie obecne nowe kandydatki na szczepionki przeciwko gruLikewise gruźlicy zostały poddane temu etapowi oceny przed rozpoczęciem I fazy badań klinicznych z udziałem ludzi. Ocena immunogenności, a tym samym prawdopodobieństwa skuteczności ochronnej nowych szczepionek przeciwgruźliczych, powinna obecnie idealnie przechodzić podobną wieloetapową ewaluację w modelach ludzkich, w tym pomiary w testach bakteriobójczych.
Testy bakteriobójcze w kontekście badań nad szczepionkami przeciwko gruźlicy są już dobrze ugruntowane w modelach zwierzęcych, gdzie stosuje się je do przesiewania potencjalnie obiecujących kandydatów na szczepionki. Redukcja ładunku bakteryjnego w różnych narządach służy jako główny wskaźnik immunogenności. Jednak do tej pory żadne tego typu testy nie zostały włączone do badań klinicznych nowych szczepionek przeciwgruźliczych.
Mimo że nadal nie ma pewności co do dokładnych mechanizmów prowadzących do zabijania prątków wewnątrz ludzkich makrofagów, interakcja makrofagów i limfocytów T z prątkami jest ewidentnie niezbędna. Test opisany w niniejszej pracy reprezentuje nową generację testów bakteriobójczych, która umożliwia badanie tych kluczowych komponentów komórkowych w obecności wszystkich pozostałych czynników komórkowych i humoralnych występujących w krwi pełnej, bez konieczności przyjmowania założeń dotyczących ich względnego indywidualnego wkładu. Test opracowany przez naszą grupę wykorzystuje niewielkie objętości krwi pełnej i został już zastosowany w badaniach nad osobami dorosłymi i dziećmi w regionach endemicznych dla gruźlicy. Wykazaliśmy immunogenność szczepionki BCG, zwiększony wzrost prątków u pacjentów z dodatnim wynikiem w kierunku HIV, a także wpływ terapii antyretrowirusowej i witaminy D na przeżywalność prątków in vitro. W niniejszym opracowaniu podsumowujemy metodologię i przedstawiamy dane dotyczące powtarzalności tego stosunkowo prostego, niskokosztowego i łatwego do zastosowania w warunkach terenowych modelu.
Uwaga: Definicje/Skróty
BCG lux = M. bovis BCG, szczep Montreal, transformowany plazmidem wahadłowym pSMT1 niosącym geny luxAB z Vibrio harveyi, pod kontrolą prątkowego promotora GroEL (hsp60). 
CFU = jednostka tworząca kolonię (miara żywotności prątków).

Opisujemy alternatywne podejście do enumeracji prątków in vitro, w którym zamiast jednostek tworzących kolonie (CFU) wykorzystuje się prątki oznakowane genem reporterowym. „Przeżywalność” organizmów oraz markery odpowiedzi gospodarza są mierzone jednocześnie, co zapewnia niskokosztowy, wszechstronny i funkcjonalny system do badań interakcji gospodarz-patogen w kontekście gruźlicy.

Funkcjonalny test z wykorzystaniem krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków, z użyciem BCG lub M.Tb znakowanych genem reporterowym (BCG lux/M.Tb lux)

Testy funkcjonalne od dawna odgrywają kluczową rolę w pomiarze immunogenności danej szczepionki. Jest ona konwencjonalnie wyrażana jako bakteriobójcza aktywność surowicy...

Ten test in vitro mierzy aktywność metaboliczną prątków w krwi pełnej w celu oceny efektu oddziaływań między prątkami a komórkami odpornościowymi gospodarza. Najpierw należy dodać prątki znakowane genem reporterowym do ludzkiej krwi pełnej, aby uzyskać odczyt w czasie rzeczywistym w określonym przedziale czasowym. Należy zebrać nadsączki z próbek do pomiaru cytokin oraz osady komórkowe do analiz RNA, a następnie poddać erytrocyty lizie i za pomocą rozcieńczeń seryjnych oraz bioluminescencji zmierzyć aktywność metaboliczną prątków.Na koniec oblicza się stosunek końcowego sygnału bioluminescencji wyrażonego w względnych jednostkach światła (RLU) do sygnału bioluminescencji w momencie inokulacji. Wyniki te wskazują na zdolność gospodarza do powstrzymania namnażania się prątków. Ten raportowany test genetyczny z krwi pełnej może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie.Na przykład, czy obecność określonych efektorowych komórek odpornościowych w próbce krwi ma funkcjonalny wpływ na organizmy, w tym przypadku prątki gruźlicy? Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość uzyskania liczby prątków w czasie rzeczywistym, zamiast lic

a-functional-whole-blood-assay-to-measure-viability-mycobacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Funkcjonalne badanie całej krwi w celu zmierzenia żywotności prątków, z wykorzystaniem BCG z oznaczeniem genu reporterowego lub M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Ten film demonstruje przygotowanie i kwantyfikację inokulum Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux za pomocą testu bioluminescencyjnego i liczenia jednostek tworzących kolonie. Przygotowane inokulum można wykorzystać do badań nad infekcjami.

Przygotowanie i oznaczanie ilościowe inokulum Mycobacterium bovis BCG lux do zakażenia

Ten film prezentuje pomiar obciążenia bakteryjnego in vivo za pomocą Bacillus Calmette-Guérin, BCG, larw owadów zakażonych luksem. Proces obejmuje homogenizację larw, traktowanie substratem lucyferazy i pomiar bioluminescencji w celu określenia względnych jednostek światła, które korelują z obciążeniem bakteryjnym.

Pomiar obciążenia in vivo bakteriami eksprymującymi lucyferazy w larwie owada

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Prezentowana jest nowatorska technika szybkiego wyświetlania antygenu na powierzchni bakteryjnej, która polega na powierzchniowej biotynylacji, a następnie ekspozycji na interesujące białka podczas fuzji z monomeryczną awidyną. Ładowanie BCG wybranymi antygenami skutecznie poprawia jego immunogenność, co sugeruje, że dekoracja powierzchni może zastąpić tradycyjne podejścia genetyczne.

Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna

Galleria mellonella została niedawno uznana za powtarzalny, tani i etycznie akceptowalny model infekcji dla kompleksu Mycobacterium tuberculosis. W tym miejscu opisujemy i demonstrujemy kroki podjęte w celu ustalenia skutecznego zakażenia G. mellonella bioluminescencyjnym Mycobacterium bovis BCG lux.

Wykorzystanie bezkręgowców Galleria mellonella jako modelu infekcji do badania kompleksu Mycobacterium tuberculosis

Opisujemy test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy przeprowadzony po inaktywacji termicznej plwociny. Inaktywacja termiczna sprawia, że próbki plwociny stają się niezakaźne i eliminuje potrzebę stosowania laboratoriów o poziomie 3 hermetyczności do testów molekularnych na gruźlicę.

Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA)

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Poznaj funkcjonalny test krwi pełnej do pomiaru aktywności metabolicznej prątków z użyciem znacznika reporter-gene BCG lux. Ta metoda umożliwia ocenę interakcji patogen-gospodarz w czasie rzeczywistym.

Funkcjonalny test krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków przy użyciu znacznika Reporter-Gene BCG lub M.Tb (BCG lux / M.Tb lux) (Wideo) | JoVE Journal

Funkcjonalny test z wykorzystaniem krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków, z użyciem BCG lub M.Tb znakowanych genem reporterowym (BCG lux/M.Tb lux)

Przeglądaj więcej filmów