Name: Test sferoidalny do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę sferoidową do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β w żelowym kolagenie 3D przy użyciu linii komórkowych MCF10A. Technika ta pozwala ilościowo ocenić wpływ regulatorów na inwazję nowotworową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Kenowi Iwacie (OSI Pharmaceuticals, Nowy Jork, USA) za dostarczenie odczynników oraz Fredowi Millerowi (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, USA) za udostępnienie linii komórkowych.

1. Przygotowanie roztworu methocelu (500 mL)
<ol>
	<li>Autoklawować 6 g metylocelulozy w butelce o pojemności 500 ml zawierającej mieszadło magnetyczne.</li>
	<li>Rozpuścić metylocelulozę w 250 ml uprzednio podgrzanego DMEM/F12 bez surowicy (60°C) przez 20 min.</li>
	<li>Dodać 250 ml DMEM/F12 (RT) zawierającego 10% surowicy konia. Mieszać przez noc (4°C).</li>
	<li>Klarować roztwór poprzez wirowanie (5000g, 2h, 4°C).</li>
	<li>Przenieść klarowny, wysokolepki roztwór do nowej probówki (około 90-95% roztworu zapasu).</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Hodowla sferoidów
<ol>
	<li>Przygotować 20% roztwór methocel (10 ml methocel i 40 ml pożywki wzrostowej).</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS, dodać 0,1% trypsyny i inkubować komórki w temperaturze 37 °C</li>
	<li>Resuspendować komórki w pożywce wzrostowej i policzyć komórki.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę o stężeniu 10 000 komórek na ml w 20% methocel.</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórek do 96-dołkowych płytek do zawiesin z okrągłym dnem (100 μl na dołek).</li>
	<li>Następnego dnia sprawdzić formowanie się sferoidów w płytkach do zawiesin. Sferoidy będą gotowe do użycia po 1-3 dniach.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kolagenu
<ol>
	<li>Przygotować w lodzie roztwór składający się z 8 ml kolagenu, 1 ml 10x PBS, 1 ml 0,1 N NaOH oraz 3 kropli 0,1 N HCl. Sprawdzić za pomocą pasków wskaźnikowych, czy pH wynosi 7,4. W razie potrzeby skorygować wartość pH.</li>
	<li>Do dołków płytki 96-dołkowej dodać po 50 μl zneutralizowanego roztworu kolagenu.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37°C do momentu stężenia kolagenu (90 min).</li>
	<li>Przygotować w lodzie roztwory metocel-kolagen-ligand: dla każdego ligandu odpipetować 1 część roztworu kolagenu. Dodać TGF-β w ilości 20 ng na ml kolagenu. Po rozcieńczeniu metocelem i dyfuzji przez poszczególne warstwy, końcowe stężenie TGF-β wyniesie 5 ng/ml. Wymieszać za pomocą wortexa. Dodać 1 część roztworu metocelu. Wymieszać za pomocą wortexa.</li>
</ol>
4. Osadzanie sferoidów
<ol>
	<li>Na pipetę 200 μl nałóż końcówkę 200 μl, w której odcięto około 5 mm wierzchołka. Za pomocą pipety pobierz jeden sferoid i ostrożnie odlej medium do pustej płytki. Sprawdź, czy sferoid pozostał wewnątrz końcówki. Sferoid jest widoczny jako biała kropka. Bez zwalniania tłoka pobierz 100 μl mieszaniny kolagenu i metocelu, a następnie przenieś sferoid wraz z mieszaniną kolagenową do studzienki płytki 96-dołkowej powlekonej kolagenem. Powtórz tę czynność dla 12 sferoidów dla każdego wariantu doświadczalnego.</li>
	<li>Pozostaw kolagen do zastygnięcia na co najmniej 30 minut w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki 200 μl.</li>
	<li>Dodaj 50 μl medium z 1,6 % surowicy oraz inhibitorami rozpuszczonymi w DMSO. W przypadku SB-431542 dodaj 4 μl roztworu zapasu (10 mM) do 1 ml medium. Po dyfuzji końcowe stężenie inhibitora wyniesie 10 μM. TGF-β oraz inhibitory będą obecne przez cały czas trwania eksperymentu. Wykonaj zdjęcia sferoidów pod mikroskopem przy powiększeniu 40X.</li>
	<li>Po 48h stymulacji TGF-β i/lub inhibitorami wykonaj zdjęcia sferoidów pod mikroskopem przy powiększeniu 40X.</li>
	<li>Zmierz pole powierzchni naciekających sferoidów po 2 dniach i odejmij powierzchnię początkową. Pomiar powierzchni sferoidu: Otwórz zdjęcie sferoidu w programie Adobe Photoshop Extended (rycina 2A) i wybierz narzędzie Szybki wybór (Quick Selection tool) (rycina 2B). Wskaźnik myszy zmieni się w okrąg ze znakiem „plus” (+) (rycina 2C). Podczas przesuwania kursora nad sferoidem, program Photoshop rozpozna jego granice. Jeśli zaznaczony zostanie obszar poza sferoidem, można go wykluczyć z zaznaczenia, naciskając klawisz Alt lub używając narzędzia do negatywnego zaznaczania, oznaczonego znakiem (-) na pasku narzędzi. Kursor zmieni się w okrąg ze znakiem „minus” (-) i poprzez przesunięcie go nad błędnie zaznaczonym obszarem, obszar ten zostanie usunięty z zaznaczenia (rycina 2D). W razie potrzeby można zaznaczyć wiele obszarów, naciskając przycisk Shift. Aby pracować dokładniej, można dostosować rozmiar wskaźnika myszy, zmieniając średnicę pędzla na pasku narzędzi (rycina 2E). Po zaznaczeniu całego sferoidu, powierzchnia zaznaczenia jest obliczana poprzez menu ANALIZA-POMIAR (ANALYSIS-MEASURE) lub po naciśnięciu Ctrl + Shift + M (rycina 2F). Pojawi się okno zapisu pomiarów, wyświetlające nazwę pliku i powierzchnię zaznaczenia w pikselach, a także inne dane (rycina 2G). W przypadku pomiaru wielu zaznaczeń, pierwsza linia pokazuje sumę wszystkich powierzchni. Pomiary poszczególnych zaznaczeń są przedstawione w liniach poniżej. Dane ze wszystkich pomiarów można wyeksportować do pliku tekstowego i otworzyć w programie Excel.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Przykład testu sferoidów z zastosowaniem normalnych komórek nabłonka piersi MCF10A1 (M1), komórek MCF10AneoT (M2) przekształconych przez H-RAS oraz pochodnych od M2 komórek MCF10CA1a (M4) przedstawiono na rysunku 3. Komórki M1 wykazywały jedynie słabą inwazję bez stymulacji, natomiast po stymulacji TGF-β inwazja była znacznie silniejsza. W przeciwieństwie do nich, przekształcona przez RAS pochodna M1, czyli komórki M2, inwadowały już efektywnie bez dodawania bodźców, a efekt ten wzrósł dodatkowo 4-5 krotnie po zastosowaniu TGF-β. Komórki M4 wykazały najsilniejszą inwazję, zarówno z dodatkiem, jak i bez dodatku TGF-β.
Następnie zbadaliśmy, czy możemy zakłócić indukowaną przez TGF-β inwazję w tym modelu sferoidów przy użyciu inhibitorów chemicznych. W tym celu zastosowaliśmy SB-431542, analog ATP i selektywny inhibitor aktywności kinazy TβRI, a także receptora aktywiny typu IB (ActRIB) oraz kinazy podobnej do receptora aktywiny (ALK)712. Zgodnie z oczekiwaniami, SB-431542 silnie hamował indukowaną przez TGF-β inwazję komórek M1, M2 i M4 (Ryc. 4), co wskazuje, że inwazja indukowana przez TGF-β jest zależna od kinazy TβRI. Ponadto silnie zahamowano również podstawową inwazję sferoidów, co sugeruje, że inwazja podstawowa jest również zależna od TGF-β.
<img alt="Schemat procesu hodowli sferoidów; wysiew komórek, tworzenie sferoidów, zatopienie w kolagenie, inwazja." src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat blokowy testu sferoidów 3D. W pierwszej kolejności komórki są wysiewane w warunkach nieprzylegających w płytkach zawiesinowych o dnie w kształcie litery U. Komórki agregują w wielokomórkowe sferoidy, które mogą zostać zatopione w matrycy kolagenowej. W tej matrycy kolagenowej sferoidy mogą prowadzić inwazję.
<img alt="Proces edycji obrazu; wybór narzędzi i pomiar cech; schemat szczegółowo przedstawiający etapy analizy cyfrowej." src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Ilościowe określenie powierzchni sferoidów przy użyciu programu Adobe Photoshop Extended. (A) Otwarcie zdjęcia sferoidu w programie Adobe Photoshop Extended (B) Wybór narzędzia Szybkie zaznaczanie (C) Przeciąganie kursora nad sferoidem w celu zaznaczenia jego powierzchni (D) Usunięcie błędnie włączonego obszaru za pomocą narzędzia Szybkie zaznaczanie w trybie odejmowania (E) Dostosowanie rozmiaru pędzla narzędzia Szybkie zaznaczanie w celu dokładniejszego zaznaczenia obszaru (F) Wybór polecenia pomiaru w celu rejestracji danych (G) Przykład zapisu pomiaru.
<img alt="Wyniki testu inwazji komórek; obrazy mikroskopowe, porównania po traktowaniu TGF-β, analiza na wykresie słupkowym." src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Inwazja sferoidów spontanicznie unieśmiertelnionych komórek MCF10A1 (M1) (A), przetransformowanych przez RAS komórek MCF10AneoT (M2) (B) oraz ich przerzutowej pochodnej MCF10CA1a (M4) (C) indukowana przez TGF-β. Sferoidy M1, M2 i M4 zatopione w kolagenie traktowano 5ng/ml TGF-β przez 48h zgodnie z oznaczeniem. A-C Reprezentatywne zdjęcia wykonane w dniu zatopienia oraz dwa dni później. D Względną inwazję określono jako różnicę powierzchni w dniu 2. minus dniu 0. Wyniki przedstawiono jako średnia ± s.d. Adaptowano z13.
<img alt="Test migracji komórek, analiza metaloproteinaz macierzy; morfologia komórkowa, efekt TGF-β, M1 M2 M4." src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4a"> 
<img alt="Wykres słupkowy porównujący względną inwazję komórek M1, M2, M4 w odniesieniu do kontroli i traktowania SB-431542." src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4b"> 
Rycina 4. Inwazja sferoidów bazalna i indukowana TGF-β jest hamowana przez SB-431542. Sferoidy M1, M2 i M4 osadzono w kolagenie i traktowano 5ng/ml TGF-β oraz/lub 10 μM SB-431542 zgodnie z oznaczeniem. Reprezentatywne zdjęcia wykonane po 2 dniach (A). Względną inwazję określono jako różnicę pól powierzchni w dniu 2. minus dniu 0 (B). Wyniki przedstawiono jako średnia ± s.d. Zaadaptowano z13.

<ol><li>Akhurst, R. J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+cancer--a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword.</a> Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-β in Cancer.</a> Cell. 134, 215-215 (2008).</li>
<li>Ghellal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+TGF-%CE%B21+and+TGF-%CE%B2+in+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma.</a> Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).</li>
<li>Sheen-Chen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Surg%22%5BJournal%5D)">Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer.</a> Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).</li>
<li>ten Dijke, P., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+TGF-%CE%B2-Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">New insights into TGF-β-Smad signaling.</a> Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).</li>
<li>Moustakas, A., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Smad+TGF-%CE%B2+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-Smad TGF-β signals.</a> J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).</li>
<li>Soule, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+human+breast+epithelial+cell+line%2C+MCF-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10.</a> Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).</li>
<li>Strickland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+premalignant+MCF10AT+generates+heterogeneous+malignant+variants+with+characteristic+histologic+types+and+immunohistochemical+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers.</a> Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).</li>
<li>Santner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+multicellular-mediated+resistance+to+alkylating+agents+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).</li>
<li>Inman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-b+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+%28ALK%29+receptors+ALK4%2C+ALK5%2C+and+ALK7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).</li>
<li>Wiercinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSmad+pathway+induces+breast+cancer+cell+invasion+through+the+up-regulation+of+matrix+metalloproteinase+2+and+9+in+a+spheroid+invasion+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system.</a> Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).</li>
<li>Tang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC. Med. 6, 11-11 (2008).</li>
<li>Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).</li>
<li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).</li>
<li>Lee, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).</li>
<li>Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> 30, 256-256 (2011).</li>
<li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21-Activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> 10, 314-314 (2011).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).</li>
</ol>

Brak konfliktów interesów.

Opracowaliśmy model sferoidowy, w którym komórki MCF10A1 oraz ich złośliwe pochodne naciekają macierz kolagenową w sposób zależny od TGF-β. Najpierw sferoidy są formowane w 96-dołkowych płytkach zawiesinowych z okrągłym dnem w obecności metylocelulozy. Oczywiście w tym celu można również zastosować płytki w kształcie litery U powlekane poly-HEMA. Metyloceluloza jest w tym kroku absolutnie niezbędna, ponieważ w jej nieobecności komórki giną. TGF-β dodaje się bezpośrednio do mieszaniny kolagenowo-metocelowej, ponieważ stwi...

<table><tbody><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>PureCol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Paski wskaźnikowe pH</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>9533</td><td></td></tr><tr><td>Płytki zawiesinowe 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>Płytki adhezyjne TC 96-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655 180</td><td></td></tr></tbody></table>

test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez tgf-β

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-β pełni przeciwstawne role w progresji raka piersi, działając jako supresor nowotworowy w fazie początkowej, ale stymulując inwazję i przerzutowanie w późniejszym stadium1,2. Co więcej, TGF-β jest często nadmiernie ekspresowany w raku piersi, a jego ekspresja koreluje ze złym rokowaniem i przerzutami 3,4. Mechanizmy, poprzez które TGF-β indukuje inwazję, nie są dobrze poznane.
TGF-β wywołuje odpowiedzi komórkowe za pośrednictwem receptorów TGF-β typu II (TβRII) i typu I (TβRI). Po indukowanym przez TGF-β utworzeniu kompleksu heteromerycznego, TβRII fosforyluje TβRI. Aktywowany TβRI inicjuje wewnątrzkomórkowy kanoniczny szlak sygnałowy poprzez fosforylację Smad receptorowych (R-Smads), tj. Smad2 i Smad3. Te aktywowane R-Smads tworzą kompleksy heteromeryczne z Smad4, które gromadzą się w jądrze i regulują transkrypcję genów docelowych5. Oprócz wcześniej opisanego szlaku Smad, aktywacja receptorów prowadzi do aktywacji kilku innych niesmadowych szlaków sygnałowych, na przykład szlaków kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK)6.
Aby zbadać rolę TGF-β w różnych stadiach raka piersi, wykorzystaliśmy system komórkowy MCF10A. System ten składa się ze spontanicznie unieśmielnionych komórek nabłonkowych piersi MCF10A1 (M1)7, pochodnej M1 przekształconej przez H-RAS — MCF10AneoT (M2), która wywołuje zmiany przednowotworowe u myszy8, oraz pochodnej M2 — MCF10CA1a (M4), która została opracowana z ksenoprzeszczepów M2 i tworzy raki wysokiego stopnia zdolne do przerzutów do płuc9. Seria MCF10A umożliwia badanie odpowiedzi komórek o różnym stopniu złośliwości, bez wpływu zróżnicowanego tła genetycznego.
W celu analizy inwazji indukowanej przez TGF-β wygenerowano homotypowe hodowle sferoidów komórkowych MCF10A osadzone w 3D macierzy kolagenowej in vitro (Rys. 1). Modele te ściśle przypominają ludzkie guzy in vivo poprzez tworzenie gradientu tlenu i składników odżywczych, co skutkuje obecnością komórek aktywnych i inwazyjnych na zewnątrz oraz komórek spoczywających lub nawet nekrotycznych wewnątrz sferoidu10. Wykazano również, że testy oparte na sferoidach lepiej odzwierciedlają oporność na leki niż hodowle monolayerowe11. Ten system modelowy 3D MCF10 pozwolił nam zbadać wpływ sygnalizacji TGF-β na właściwości inwazyjne komórek piersi na różnych etapach złośliwości.

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

TGF-&beta; pełni przeciwstawne role w progresji raka piersi, działając jako supresor nowotworowy w fazie początkowej, lecz stymulując inwazję i przerzuty...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zmierzenie wpływu potencjalnych regulatorów inwazji indukowanej przez TGF beta w środowisku trójwymiarowym. Osiąga się to poprzez uprzednie wytworzenie sferoidów komórkowych. Następnie PHE są osadzane w kolagenie, który zapewnia środowisko 3D.Następniea kwantyfikuje się obszar inwazji. Aby określić wpływ leczenia na indukowaną przez TGF beta inwazję, wyniki wykazują, że modulatory szlaku TGF-beta wpływają na właściwości inwazyjne steroidów w trójwymiarowej macierzy kolagenowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy gojenia ran (scratch assay), jest lepsze odwzorowanie środowiska 3D.Ta metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad TGF-β, takich jak identyfikacja nowych genów zaangażowanych w indukowaną przez TGF-beta inwazję. Aby przygotować roztwór metylocelulozy do testu inwazji indukowanej przez TGF-beta, należy rozpocząć od autoklawowania 6 g metylocelulozy w butelce o pojemności 500 ml z magnetycznym mieszadłem. Rozpuścić metylocelulozę w 250 ml podgrzanego DMEM/F12 bez surowicy przez 20 minut, dodać 250 ml DMEM/F12 o temperaturze pokojowej zawierającego 10% surowicy konia i mieszać przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia oczyścić roztwór poprzez wirowanie przy 5 000 ×g przez dwie godziny w temperaturze 4 °C.Przenieś klarowny, wysokolepki roztwór do nowej probówki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsiusjuszy do momentu hodowli phe. Przygotuj 20% roztwór methyl cell, używając 10 mililitrów przygotowanego zapasu methyl cell i 40 mililitrów pożywki wzrostowej. Przemyj komórki MCF 10 A dwukrotnie za pomocą PBS.Dodaj 0,1% trypsyny i inkubuj komórki w temperaturze 37°C aż do całkowitego odklejenia wszystkich komórek. Resuspenduj komórki w 10 ml pożywki wzrostowej i policz je za pomocą licznika komórek. Przygotuj zawiesinę o stężeniu 10 000 komórek na ml w 20% methyl cell.Dla każdego wariantu doświadczalnego dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej do 12 studzienek 96-dołkowej płytki do zawiesin o okrągłym dnie. Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia sprawdź, czy utworzyły się sferoidy.Sferoidy będą gotowe do użycia w ciągu od jednego do trzech dni. Przygotować w lodzie roztwór składający się z ośmiu mililitrów kolagenu, jednego mililitra 10 XPBS, jednego mililitra 0,1 normalnego wodorotlenku sodu oraz trzech kropli 0,1 normalnego kwasu solnego. Sprawdzić, czy pH roztworu wynosi 7,4, nanosząc go na paski wskaźnika pH.Skoryguj pH, jeśli znajduje się ono poza zakresem. Do dołków płytki 96-dołkowej dodaj 50 µL zneutralizowanego roztworu kolagenu i inkubuj w temperaturze 37 °C przez około 90 minut lub do czasu stężenia kolagenu. Dla każdego badanego ligandu przygotuj na lodzie roztwór ligandu kolagenu komórek metylowych.Zacznij od jednego mililitra roztworu kolagenu na jedną próbę, a następnie dodaj 20 nanogramów TGF beta, aby uzyskać końcowe stężenie pięciu nanogramów na mililitr, mieszając za pomocą wortexa. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu metylocelulozy, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów, i wymieszaj w vortexie. Aby osadzić steroid, użyj końcówki do pipety 200 µL, w której odcięto 5 mm lub więcej z wierzchołka, zamocowanej na pipecie 200 µL.Następnie pobierz jeden sferoid za pomocą pipety. Ostrożnie odlej pożywkę do pustej płytki, dbając o to, aby sferoid S pozostał wewnątrz końcówki. Nie zwalniaj tłoka.Pobierz 100 µL mieszaniny komórek z kolagenem metylowym i dozuj mieszaninę kolagenową sferoidów do studzienki powlekanej kolagenem na płytce 96-dołkowej. Wypełnij 12 studzienek dla każdego wariantu. Pozostaw kolagen do stężenia przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C i usuń pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki 200 µL.Przygotuj 40 µM roztwór inhibitora TGF beta SB 4 31 542, dodając 4 µL roztworu stokowego SB 4 31 542 do 1 mL pożywki D-M-E-M-F 12 zawierającej 1,6% surowicy konia. Po dyfuzji dodaj 50 µL pożywki z inhibitorem do każdej studni. Końcowe stężenie inhibitora wyniesie 10 µM.Wykonaj zdjęcia sferoidu pod mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu, a następnie inkubuj w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla. Po dwudniowej inkubacji ponownie wykonaj zdjęcia i zmierz obszar naciekającego sferoidu, otwierając zdjęcie sferoidu w programie Adobe Photoshop. Wybierz narzędzie szybkiego zaznaczania.Podczas przeciągania kursora nad sferoidem wskaźnik myszy zmieni się w okrąg z Twoim znakiem plus. Oprogramowanie rozpozna granice sferoidu. Jeśli zostanie zaznaczony obszar poza sferoidem, należy go wykluczyć, naciskając klawisz alt lub korzystając z narzędzia odwracania zaznaczenia, które w pasku narzędzi jest oznaczone znakiem minus.Przesuń kursor nad błędnie zaznaczony obszar, a oprogramowanie usunie go z zaznaczenia. Jeśli obszar w obrębie sferoidu zostanie odznaczony, można go ponownie dołączyć, przeciągając kursor przy jednoczesnym naciśnięciu klawisza Shift. Aby pracować dokładniej, dostosuj rozmiar wskaźnika myszy, zmieniając średnicę pędzla na pasku narzędzi.Aby obliczyć pole powierzchni wszystkich aktywnych zaznaczeń, wybierz pomiar analizy w pasku menu. Pojawi się okno zapisu pomiarów, w którym wyświetlona zostanie nazwa pliku oraz pole powierzchni zaznaczenia w pikselach. Jeśli w obrębie jednego sferoidu zmierzono wiele zaznaczeń, pierwsza linia pokaże sumę wszystkich pól, a poniższe linie szczegóły poszczególnych pomiarów.Lista ta będzie zawierać wartości dla poszczególnych wyborów. Wyeksportuj dane do pliku tekstowego, a następnie otwórz go w programie Excel. Tutaj przedstawiono przykład testu sferoid S z użyciem komórek MCF 10 A one (normalne komórki nabłonka piersi), przekształconych komórek MCF 10 A neo T oraz komórek MCF 10 CA one A pochodnych M two.Komórki M1 wykazywały jedynie słabą inwazję bez stymulacji, natomiast po stymulacji TGF beta inwazja była znacznie silniejsza. W przeciwieństwie do nich, pochodne M1 przekształcone przez RA, M dwa, inwadowały efektywnie bez dodania stymulacji, a efekt ten wzrósł dodatkowo czterokrotnie do pięciokrotnie. Po traktowaniu TGF beta komórki M cztery wykazały najsilniejszą inwazję zarówno bez, jak i z dodatkiem TGF beta.Graficzne przedstawienie wyników tego eksperymentu zostało przygotowane przy użyciu programu Photoshop i jest pokazane tutaj; SB 4 31 5 42, analog ATP i selektywny inhibitor aktywności kinazy receptora TGF-beta typu 1, aktywny również wobec receptora typu 1B oraz kinazy podobnej do receptora 7, został dodany do kultur komórkowych. SB 4 31 5 42 silnie hamował indukowaną przez TGF-beta inwazję komórek M1, M2 i M4, co wskazuje, że inwazja indukowana przez TGF-beta jest zależna od kinazy receptora TGF-beta typu 1. Ponadto silnie zahamowano podstawową inwazję PHE. Graficzne przedstawienie wyników tego eksperymentu zostało ponownie stworzone przy użyciu programu Photoshop i jest pokazane tutaj.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak izolacja RNA lub izolacja białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o to, które geny są ekspresjonowane lub które białka są ekspresjonowane. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wyszukiwać nowe modulatory inwazji indukowanej przez tavita.

spheroid-assay-to-measure-tgf-induced-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test sferyczny do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Inwazja komórek raka jajnika w błonie międzybłonkowej otrzewnej jest procesem dynamicznym w czasie. Wykorzystując analizator w czasie rzeczywistym, zdolność inwazyjną komórek raka jajnika w modelu kohodowli komórek sferoidalnych i międzybłonka można określić ilościowo w dłuższych okresach czasu, zapewniając wgląd w czynniki regulujące proces przerzutowy.

Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Poznaj metodę sferoidową do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β w żelowym kolagenie 3D przy użyciu linii komórkowych MCF10A. Technika ta pozwala ilościowo ocenić wpływ regulatorów na inwazję nowotworową.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Przeglądaj więcej filmów