Name: Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Naucz się uproszczonej techniki tworzenia modelu rany niedokrwiennej u królików, szczególnie z cukrzycą. Metoda małoinwazyjna z trzema nacięciami skórnymi umożliwia badanie gojenia ran w kontrolowany sposób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było częściowo finansowane z grantów NIH 1RO1DK74566 oraz 1RO1AM52984. Autorzy chcieliby podziękować pani Jacqueline McCarty z RRC za pomoc podczas operacji, dr. Jianpu Wang i dr Harshini Sarojini za pomoc w operacjach i opiece pooperacyjnej nad niektórymi królikami, dr Rong Wan za przeprowadzenie badań histologicznych oraz pani Ming Li za wykonanie pomiarów fosforanów wysokoenergetycznych metodą HPLC.

1. Podstawy anatomiczne
Ucho królika jest preferowanym materiałem badawczym w dziedzinie pielęgnacji ran od początku 20th wieku. Ucho jest zaopatrywane przez trzy pęczki naczyniowe (centralny, czaszkowy i ogonowy); pęczek centralny jest największy, natomiast naczynia w pęczkach czaszkowym i ogonowym różnią się wielkością. Sporadycznie tętnica ogonowa może być nieobecna.1 Wszystkie te naczynia są łatwo identyfikowalne po stronie grzbietowej po ogoleniu ucha (Ryc. 1). Po stronie brzusznej dystalna część skóry nie otrzymuje dopływu krwi z naczyń proksymalnych. Trzy pęczki naczyń na grzbietowej stronie ucha posiadają liczne odgałęzienia, które przenikają przez chrząstkę, aby zapewnić ukrwienie dystalnej skóry brzusznej (Ryc. 2). U niektórych królików po stronie brzusznej występuje również bardzo małe naczynie podskórne, które zaopatruje krwią nie więcej niż 1/3 skóry brzusznej. W przypadku otwartego okrężnego nacięcia skóry, z nacięcia po stronie brzusznej w zasadzie nie występuje krwawienie.
2. Procedura chirurgiczna
<ol>
	<li>Królika waży się i ogala uszy oraz kark.</li>
	<li>Na godzinę przed operacją podaje się premedykację z Buprenorfiną (0.01 mg/kg) domięśniowo (IM).</li>
	<li>Znieczulenie wywołuje się mieszanką ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg) podaną IM.</li>
	<li>Podczas operacji królik jest chroniony podkładką grzewczą, oczy są zabezpieczone maścią, a parametry życiowe są monitorowane.</li>
	<li>Pole operacyjne przygotowuje się aseptycznie za pomocą szorowania chirurgicznego i obkłada sterylnymi prześcieradłami tak, aby odsłonić oba uszy.</li>
	<li>Jedno ucho zostaje poddane niedokrwieniu, natomiast drugie służy jako sparowana kontrola niedokrwienna.</li>
	<li>Trzy szypuły naczyniowe identyfikuje się na podstawie tętnic i żył.</li>
	<li>Za pomocą ostrza nr 15 wykonuje się trzy małe nacięcia pionowe (1-1.5 cm) na szypułach naczyniowych, około 1-2 cm od nasady ucha.</li>
	<li>Żyłę środkową izoluje się od otaczających tkanek i za pomocą szwu okala się ją w celu retrakcji. Tętnicę środkową podwiązuje się szwami 4-0 i przecina.</li>
	<li>Przecina się również towarzyszący nerw środkowy.</li>
	<li>Całą szypułę czaszkową podwiązuje się i przecina.</li>
	<li>Szypuła ogonowa zostaje zachowana.</li>
	<li>Przez 3 nacięcia tworzy się tunel podskórny. Osiąga się to poprzez rozdzielanie tępym kleszczykiem oraz rozdzielanie ostrym nożem i nożyczkami. Wszystkie tkanki podskórne, mięśnie, nerwy i małe odgałęzienia naczyniowe zostają przerwane. Małe naczynia pod skórą właściwą są całkowicie przecinane. Wszystkie tkanki podskórne wycina się ostrzem do poziomu chrząstki.</li>
	<li>Dalsze rozdzielanie ostre i tępe jest stosowane w celu oczyszczenia nasady, pozostawiając odsłoniętą chrząstkę o szerokości około 5-10 mm.</li>
	<li>Procedura ta przerywa wszystkie podskórne odgałęzienia naczyniowe, aby zapobiec szybkiemu tworzeniu się krążenia obocznego.</li>
	<li>Krwawienie jest minimalne. Jeśli wystąpi, jest ono łatwo opanowywane poprzez ucisk gazą, bez konieczności stosowania elektrokoagulacji.</li>
	<li>Skóra wewnątrz ucha nie jest silnie unaczyniona, dlatego nie wykonuje się w niej nacięć.</li>
	<li>Trzy nacięcia skóry zamyka się szwami 4-0 lub 5-0 i przykrywa sterylną gazą.</li>
	<li>Procedura kończy się powstaniem 3 małych nacięć skóry i wiąże się z znacznie mniejszym uszkodzeniem tkanki niż w przypadku otwartej operacji.</li>
	<li>Na stronie brzusznej każdego ucha tworzy się cztery okrągłe rany skóry o pełnej grubości za pomocą 6-mm wycinaka ze stali nierdzewnej. Odległość między ranami wynosi co najmniej 20-30 mm. Skórę w obrębie rany po wycinaku usuwa się z chrząstki. Usuwa się również okostnową, wraz ze skórą lub oddzielnie. Podłożem, na którym zachodzi ziarninowanie i epitelializacja, jest chrząstka, jednak chrząstka nie zostaje przebita (Fig. 3).</li>
	<li>Po zakończeniu tworzenia ran na obu uszach, lek badany nanosi się na jedną stronę dwóch ran, podczas gdy lek kontrolny nanosi się na rany po drugiej stronie. Do przykrycia miejsca rany stosuje się opatrunek okluzyjny (TegaDerm, 3M). Zapobiega to wysychaniu ran.</li>
	<li>Rany w dolnej części ucha zazwyczaj goją się szybciej niż rany w górnej części ucha. W badaniach porównawczych gojenia ran zaleca się porównywanie dwóch ran po jednej stronie z dwiema ranami po drugiej stronie lub osobne porównywanie ran górnych i dolnych.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Na skórę pleców nakleja się plaster Duragesic w celu uwalniania Fentanylu (25 μg/godzinę) przez 2-3 dni, aby zredukować ewentualny ból.</li>
	<li>Króliczki mają swobodny dostęp do jedzenia i picia.</li>
	<li>Wymiana opatrunków odbywa się codziennie. Stare opatrunki są usuwane, a rany oczyszczane sterylnymi gazikami bawełnianymi. Wykonuje się zdjęcia cyfrowe do porównania. Nakłada się nowe opatrunki, a rany ponownie przykrywa folią TegaDerm. Podczas wymiany opatrunków znieczulenie nie jest wymagane.</li>
	<li>Temperaturę skóry mierzy się codziennie na każdym uchu w celu porównania.</li>
	<li>Dodatkowo ukrwienie uszu można zmierzyć za pomocą przezskórnego miernika napięcia tlenu lub laserowego florymetru Dopplera.</li>
	<li>Szwy można usunąć po jednym tygodniu.</li>
	<li>W przypadku zwierząt niediabetycznych większość ran ucha zazwyczaj goi się w ciągu 2-3 tygodni.</li>
</ol>
4. Potencjalne powikłania i sposoby ich unikania
Ta małoinwazyjna operacja jest bezpieczna, a powikłania występują rzadko. Poza przejściowym, łagodnym obrzękiem ucha w okresie pooperacyjnym, u żadnego z naszych królików nie wystąpiły poważne powikłania chirurgiczne. Niemniej jednak, w przypadku tej procedury istnieje kilka potencjalnych powikłań:
<ol>
	<li>Krwawienie. Krwawienie może wystąpić w miejscach nacięć, jeśli hemostaza jest niepełna lub jeśli uszkodzone zostanie większe naczynie krwionośne (np. jedno z głównych naczyń szypuły). Można tego łatwo uniknąć dzięki uważnej dyssekcji. Oprócz trzech głównych wiązek naczyniowych istnieje wiele mniejszych podskórnych odgałęzień naczyniowych. Podczas tworzenia tunelu podskórnego naczynia te zostają przecięte, jednak podwiązywanie nie jest konieczne. Hemostazę można uzyskać poprzez proste uciskowe tamowanie gazą. Wykonuje się to, wprowadzając róg gazy do tunelu na kilka minut. Przed zamknięciem nacięcia należy upewnić się, że nie występuje aktywne krwawienie.</li>
	<li>Zakażenie nacięcia i rozstąpienie się rany: Powikłania te mogą wystąpić, jeśli nacięcia zostaną zanieczyszczone. Można ich uniknąć poprzez stosowanie rygorystycznej techniki aseptyki; antybiotyki nie są wymagane. Jednak w przypadku wystąpienia zakażenia konieczny jest odpowiedni drenaż oraz wymiana opatrunków.</li>
	<li>Obrzęk ucha: Ze względu na podwiązania naczyniowe i zaburzenie krążenia limfy może przez kilka dni występować łagodny obrzęk ucha. Ustępuje on jednak samoistnie i nie wymaga leczenia.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Od 2007 roku zastosowaliśmy tę procedurę u ponad 70 królików, w tym u 23 zwierząt z cukrzycą. W grupie z cukrzycą zabieg przeprowadzono w różnym czasie trwania choroby: siedem królików chorowało od dwóch tygodni, cztery od dwóch miesięcy, dziesięć od 12 miesięcy, a dwa od 24 miesięcy.
Bezpośrednio po operacji niedokrwione ucho było chłodne i sinicze, z lekkim obrzękiem. Najważniejsza tętnica ucha — tętnica środkowa — wykazywała silne tętno w uchu zdrowym, natomiast tętno to nie występowało w uchu niedokrwionym. Ruchomość ucha była ograniczona, ale nie zanikła całkowicie. Na skórze widoczne były wyraźne wgłębienia nad tunelem, jednak u żadnego z zwierząt nie stwierdzono niedokrwienia ani martwicy (Rys. 4).
Temperaturę skóry uszu prawidłowych i niedokrwionych mierzono termometrem cyfrowym (Omron firmy Omron Healthcare, Bannockburn, IL, lub podczerwiennym termometrem punktowym typu K firmy Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Różnice temperatur między uchem niedokrwionym a nie-niedokrwionym wynosiły od 1 do 10 °C, przy czym u większości królików mieściły się one w przedziale 2-6 °C. Ryc. 5 przedstawia średnie różnice temperatur u 30 królików. Różnica temperatur była wyższa w pierwszych dniach po operacji, stopniowo malała po 15. dniu, ale wciąż utrzymywała się pod koniec miesiąca.
Zawartość fosforanów wysokoenergetycznych w tkankach została zmierzona u wybranych zwierząt po ich uśmierceniu. Z każdego ucha pobrano sześć próbek tkanki, a zawartość fosforanów wysokoenergetycznych zmierzono metodą HPLC. Zarówno stężenia ATP, jak i całkowita energia były wyższe w uszach prawidłowych niż w uszach niedokrwionych. Rys. 6 przedstawia przykład królika uśmierconego 23 dni po zabiegu. Średnia zawartość ATP w tkankach wynosiła 0.349±0.047 μMol/g (średnia±SD) w uchu prawidłowym w porównaniu do 0.237±0.059 μMol/g w uchu niedokrwionym (p&lt;0.005). Średnia całkowita energia (ATP+ADP+AMP) wynosiła 0.882±0.137 μMol/g w uchu prawidłowym w porównaniu do 0.556±0.115 μMol/g w uchu niedokrwionym (p&lt;0.001).
Czas gojenia ran był zawsze dłuższy w przypadku ucha niedokrwionego niż ucha niedokrwionego we wszystkich grupach (u królików niediabetycznych lub cukrzycowych). Rys. 7 przedstawia porównanie gojenia 26 par ran na uszach niedokrwionych i niedokrwionych. Czas gojenia wynosił od 13 do 18 dni (średnio 14,9±1,6 dni) w uszach prawidłowych w porównaniu do 17–27 dni (średnio 20,5±3,4 dni) w uszach niedokrwionych (p=0,001). Czas gojenia ran u królików starszych i cukrzycowych był znacznie dłuższy, szczególnie gdy czas trwania cukrzycy przekraczał 12 miesięcy.
U wszystkich tych królików wszystkie nacięcia zagoiły się prawidłowo i bez powikłań, w tym u królików z 24-miesięcznym okresem trwania cukrzycy. Rycina 8 przedstawia próbkę histologiczną ukazującą zagojony tunel podskórny, w którym brakuje mięśni, a ich miejsce zastąpiła tkanka włóknista. Skóra pozostaje jednak nienaruszona.
<img alt="Schemat chirurgiczny nacięć i tunelowania ucha w procedurze weterynaryjnej." src="/files/ftp_upload/3341/3341fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ucho królika jest ukrwione przez trzy pęczki naczyniowe. Pęczek centralny jest największy, przedni (cranial) jest mniejszy, a pęczek tylny (caudal) jest najmniejszy. Naczynia te są łatwo widoczne na powierzchni po ogoleniu ucha.
<img alt="Schemat histopatologiczny; obraz mikroskopowy przedstawiający strukturę tkanki; analiza badań medycznych." src="/files/ftp_upload/3341/3341fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Trzy pęczki naczyniowe na grzbiecie małżowiny usznej doprowadzają krew nie tylko do skóry grzbietowej, ale również do skóry brzusznej poprzez naczynia penetrujące. Strzałka wskazuje naczynia penetrujące przechodzące przez chrząstkę. Wstawka przedstawia przekrój poprzeczny tych naczyń.
<img alt="Schemat procedury chirurgicznej przedstawiający rany ucha i nacięcia skóry w badaniu na zwierzętach." src="/files/ftp_upload/3341/3341fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Na brzusznej stronie ucha wykonano cztery rany o wielkości 6 mm, a następnie usunięto okrzonkę. Podłożem, na którym zachodzi granulacja i epitelializacja, jest chrząstka, która nie została jednak przebita. Trzy niewielkie nacięcia skóry zamknięto przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.
<img alt="Nacięcie chirurgiczne na szyi zwierzęcia ze szwami; gojenie pooperacyjne, procedura weterynaryjna." src="/files/ftp_upload/3341/3341fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Po zamknięciu nacięć skóry wyraźnie widoczne jest wgłębienie nad tunelem podskórnym.
<img alt="Wykres rozrzutu różnicy temperatur w funkcji dni po operacji; regresja liniowa y=-0,1019x+4,2553." src="/files/ftp_upload/3341/3341fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Średnia różnica temperatury skóry między uchem zdrowym a niedokrwionym u 30 królików. Wczesna różnica po operacji wynosi od 7 °C do 10 °C. Różnica ta stopniowo maleje, lecz utrzymuje się do końca pierwszego miesiąca.
<img alt="Wykres słupkowy poziomów energii, ATP w stosunku do energii całkowitej, porównanie tkanki nieischemicznej i ischemicznej." src="/files/ftp_upload/3341/3341fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Zawartość fosforanów wysokoenergetycznych w tkance ucha jest obniżona w uchu z niedokrwieniem w porównaniu z uchem bez niedokrwienia 23 dni po operacji (p&lt;0,001).
<img alt="Porównanie czasu gojenia ran; wykres słupkowy; wyniki dla uszu nieizchemicznych, izchemicznych; niecukrzycowych, cukrzycowych." src="/files/ftp_upload/3341/3341fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Czas gojenia ran jest dłuższy w uszach izchemicznych niż w uszach nieizchemicznych (po 26 ran w każdej grupie). Gojenie definiuje się jako przywrócenie ciągłości uszkodzonej tkanki, t.j. całkowitą reepitelializację miejsc zranienia.
<img alt="Przedmiotowy preparat histologiczny, tkanka nabłonkowa, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej, warstwa tkanki." src="/files/ftp_upload/3341/3341fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Próbka histologiczna przedstawiająca część ucha zawierającą tunel podskórny. Wygojona tkanka jest cieńsza niż w normalnym uchu, pierwotny mięsień szkieletowy jest nieobecny i został zastąpiony przez tkanki włókniste. Jednakże skóra pozostaje nienaruszona.

<ol><li>Ninomiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+bed+in+the+rabbit+ear%3A+microangiography+and+scanning+electron+microscopy+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Histol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">The vascular bed in the rabbit ear: microangiography and scanning electron microscopy of vascular corrosion casts.</a> Anat. Histol. Embryol. 29, 301-305 (2000).</li>
<li>American Diabetes Association: Diabetes statistics. , American Diabetes Association. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.org/diabetes-basics/diabetes-statistics">http://www.diabetes.org/diabetes-basics/diabetes-statistics</a> (2011).</li>
<li>Sen, C. K., Gordillo, G. M., Roy, S., Kirsner, R., Lambert, L., Hunt, T. K., Gottrup, F., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair. 17, 763-771 (2009).</li>
<li>Boulton, A. J., Vileikyte, L., Ragnarson-Tennvall, G., Apelqvist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+diabetic+foot+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The global burden of diabetic foot disease.</a> Lancet. 366, 1719-1724 (2005).</li>
<li>Edwards, J., Stapley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debridement+of+diabetic+foot+ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+Syst.+Rev%22%5BJournal%5D)">Debridement of diabetic foot ulcers.</a> Cochrane Database Syst. Rev. 1, 1-40 (2010).</li>
<li>Werdin, F., Tennenhaus, M., Schaller, H. E., Rennekampff, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+Management+Strategies+for+Treatment+of+Chronic+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Eplasty%22%5BJournal%5D)">Evidence-based Management Strategies for Treatment of Chronic Wounds.</a> Eplasty. 9, 169-179 (2009).</li>
<li>Wu, Y., Chen, L., Scott, P. G., Tredget, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+enhance+wound+healing+through+differentiation+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis.</a> Stem Cells. 25, 2648-2659 (2007).</li>
<li>Bennett, J. P., Matthews, R., Faulk, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+chronic+ulceration+of+the+legs+with+human+amnion%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Treatment of chronic ulceration of the legs with human amnion.</a> Lancet. 1, 1153-1156 (1980).</li>
<li>Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+use+in+wound+healing+research%3A+a+survey+focusing+on+in+vitro+and+in+vivo+adult+soft+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue.</a> Wound Repair. 8, 83-96 (2000).</li>
<li>Lindblad, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+wound+healing+research%3A+do+we+need+more%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Animal models in wound healing research: do we need more.</a> Wound Repair. 8, 81-82 (2000).</li>
<li>LoGerfo, F. W., Gibbons, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+disease+of+the+lower+extremities+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol.+Metab.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Vascular disease of the lower extremities in diabetes mellitus.</a> Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 25, 439-445 (1996).</li>
<li>Gottrup, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen%2C+wound+healing+and+the+development+of+infection.+Present+status%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Oxygen, wound healing and the development of infection. Present status.</a> Eur. J. Surg. 168, 260-263 (2002).</li>
<li>Niinikoski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+blood+and+oxygen+supply+on+the+biochemistry+of+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The effect of blood and oxygen supply on the biochemistry of repair.</a> , 56-71 (2002).</li>
<li>Schaffer, M., Witte, M., Becker, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+to+study+ischemia+in+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Low+Extrem.+Wounds%22%5BJournal%5D)">Models to study ischemia in chronic wounds.</a> Int. J. Low Extrem. Wounds. 1, 104-111 (2002).</li>
<li>Niinikoski, J., Gottrup, F., Hunt, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxygen+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The role of oxygen in wound repair.</a> , 165-174 (1991).</li>
<li>Harding, K. G., Morris, H. L., Patel, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science%2C+medicine+and+the+future%3A+healing+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Science, medicine and the future: healing chronic wounds.</a> BMJ. 324, 160-163 (2002).</li>
<li>Lindblad, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+How+should+one+study+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Editorial: How should one study wound healing.</a> Wound Repair. 14, 515-515 (2007).</li>
<li>Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+rabbit+ear+model+created+by+minimally+invasive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Ischemic rabbit ear model created by minimally invasive surgery.</a> Wound Repair Regen. 15, 928-935 (2007).</li>
<li>Joseph, J., Townsend, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+of+defects+in+immobile+skin+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">The healing of defects in immobile skin in rabbits.</a> Br. J. Surg. 48, 557-564 (1961).</li>
<li>James, G. A., Swogger, E., Wolcott, R., Pulcini, E., Secor, P., Sestrich, J., Costerton, J. W., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+in+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Biofilms in chronic wounds.</a> Wound Repair Regen. 16, 37-44 (2008).</li>
<li>Niitsuma, J., Yano, H., Togawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+of+decubitus+ulcer+formation+in+the+rabbit+ear+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rehabil.+Res.+Dev%22%5BJournal%5D)">Experimental study of decubitus ulcer formation in the rabbit ear lobe.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 40, (2003).</li>
<li>Salcido, R., Popescu, A., Ahn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+pressure+ulcer+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Spinal+Cord+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models in pressure ulcer research.</a> J. Spinal Cord Med. 30, 107-116 (2007).</li>
</ol>

W niniejszym badaniu nie wystąpił konflikt interesów finansowych.

Cukrzyca dotyka 23,6 miliona osób w USA,2,3 a u 15-20% tych pacjentów w ciągu życia rozwijają się owrzodzenia stóp,4,5 co generuje roczne koszty leczenia przekraczające 25 miliardów dolarów.3,6 Jednakże nawet najlepsze dostępne metody leczenia osiągają jedynie 50-procentowy wskaźnik gojenia, a efekt ten jest często tymczasowy,7 przy współczynniku nawrotów sięgającym 66% u osób z cukrzycą.3,6 W przypadku wystąpienia owrzodzeń u pacjentów z cukrzycą gwałtownie rośnie r...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Do monitorowania podczas operacji&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Mata grzewcza do utrzymania prawidłowej temperatury. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Monitor przezskórnego stężenia tlenu. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Monitor temperatury. &lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Do operacji&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Skalpel nr 3 z ostrzem nr 15. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Dwie pary pincet (jedna do skóry i druga do pozostałych tkanek miękkich). &lt;/li&gt; &lt;li&gt; 2-3 pary małych kleszczyków. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Jedna lub dwie pary mikro-nożyczek (do cięcia tkanek). &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Jedna para małych nożyczek (do przecinania szwów). &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Igłotrzymacz. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Kilka wykonanych ze stali nierdzewnej wycinaków (do tworzenia ran). &lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

Główną przeszkodą w aktualnych badaniach nad ranami cukrzycowymi jest brak modelu rany niedokrwiennej, który mógłby być bezpiecznie stosowany u zwierząt z cukrzycą. Leki, które wykazują skuteczność w ranach niedokrwiennych, mogą nie działać w przypadku ludzkich ran cukrzycowych, ponieważ waskulopatia jest jednym z kluczowych czynników hamujących gojenie tych zmian. W 2007 roku opublikowaliśmy artykuł opisujący model rany niedokrwiennej ucha królika, stworzony za pomocą małoinwazyjnej techniki chirurgicznej. Od tego czasu dodatkowo uprościliśmy tę procedurę, aby ułatwić jej wykonanie. Na jednym uchu, w odległości 1-2 cm od podstawy, wykonano trzy niewielkie nacięcia skóry na stopkach naczyniowych. Tętnicę centralną podwiązano i przecięto wraz z nerwem. Cały pęczek kranialny został przecięty i podwiązany, pozostawiając nienaruszoną jedynie gałąź caudalną. Przez nacięcia wykonano okrężny tunel podskórny w celu przecięcia tkanek podskórnych, mięśni, nerwów i małych naczyń. Drugie ucho służyło jako kontrola niedokrwienna. Na stronie brzusznej każdego ucha wykonano cztery rany. Technika ta pozwala na uzyskanie 4 ran niedokrwiennych i 4 ran niedokrwiennych u jednego zwierzęcia w celu przeprowadzenia porównań sparowanych. Po zabiegu ucho niedokrwienne było chłodne i sinicze, wykazując ograniczoną ruchomość oraz brak tętna w tętnicy usznej. Temperatura skóry ucha niedokrwiennego była o 1-10 °C niższa niż w uchu prawidłowym, a różnica ta utrzymywała się przez ponad miesiąc. Zawartość fosforanów wysokoenergetycznych w tkance ucha była niższa w uchu niedokrwiennym niż w uchu kontrolnym. Czas gojenia ran był dłuższy w uchu niedokrwiennym niż w uchu niedokrwiennym przy zastosowaniu tej samej terapii. Technikę tę zastosowano już u ponad 80 królików, z czego 23 było chorych na cukrzycę (czas trwania choroby od 2 tygodni do 2 lat). U żadnego królika nie wystąpiły powikłania chirurgiczne, takie jak krwawienie, infekcja czy rozejście się nacięć skóry. Model ten posiada wiele zalet w porównaniu z innymi modelami, m.in. niewielki stopień naruszenia skóry, dłuższy czas niedokrwienia oraz wyższą skuteczność. Może być on bezpiecznie stosowany u zwierząt o obniżonej odporności i może być modyfikowany w celu spełnienia różnych wymagań badawczych.

Opracowaliśmy małoinwazyjną technikę tworzenia modelu niedokrwiennej rany ucha u królika poprzez przerwanie tętnicy centralnej, nerwu oraz czaszkowego pęczka naczyniowo-nerwowego. Następnie wykonuje się tunel podskórny, przecinając wszystkie tkanki podskórne. Procedura ta powoduje minimalne uszkodzenie skóry i może być bezpiecznie stosowana u zwierząt z cukrzycą.

Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

Główną przeszkodą w aktualnych badaniach nad ranami cukrzycowymi jest brak modelu rany niedokrwiennej, który można bezpiecznie zastosować u zwierząt z cukrzycą. Leki, które działają...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest umożliwienie tworzenia ran niedokrwiennych nie tylko u zdrowych królików, ale także u królików o obniżonej odporności, takich jak zwierzęta w starszym wieku lub z cukrzycą. Wszystkie obecnie stosowane techniki tworzenia ran niedokrwiennych są wysoce inwazyjne i do tej pory żadna z nich nie mogła być zastosowana u zwierząt z cukrzycą. Niniejsza procedura wykorzystuje małoinwazyjną operację, która rozpoczyna się od wykonania trzech niewielkich nacięć skóry nad trzema pęczkami naczyniowymi.Kolejnym krokiem jest wyizolowanie i zabezpieczenie żyły centralnej oraz wiązki naczyniowej grzebieniowej, tak aby krążenie krwi w małżowinie usznej zostało ograniczone, ale nie całkowicie przerwane. Na koniec pozostałe naczynia, nerwy i tkanki podskórne zostają przerwane lub podwiązane poprzez nacięcia skórne. Niedokrwienie ucha potwierdza się poprzez brak tętna tętniczego, wygląd ucha, różnicę temperatur oraz nasycenie tlenem tkanki podskórnej.Ta małoinwazyjna operacja może wydawać się trudna do wykonania, ale w rzeczywistości jest bardzo prosta. Główną zaletą tej techniki jest minimalny stopień naruszenia skóry. Od czasu pierwszej publikacji tej metody w 2007 roku otrzymaliśmy wiele pytań.Od tego czasu dodatkowo uprościliśmy tę procedurę. Aby jeszcze bardziej ułatwić jej wykonanie bez użycia mikroskopu, należy rozpocząć od zważenia wybranego królika, a następnie znieczulić zwierzę, stosując mieszaninę ketaminy i ksylazyny. Monitorując oznaki życiowe królika, na stronie grzbietowej można zidentyfikować trzy pęczki naczyniowe zaopatrujące ucho.Jest to pęczek centralny, który jest największy i posiada odgałęzienia łączące się z innymi naczyniami, pęczek boczny, w którym tętnica jest zazwyczaj bardzo mała lub nieobecna, oraz pęczek czaszkowy. Po stronie brzusznej dystalna część skóry nie jest ukrwiona przez naczynia proksymalne.Zamiast tego, pęczki naczyń na grzbietowej stronie ucha mają liczne gałęzie penetrujące chrząstkę, aby zapewnić dopływ krwi do dystalnej skóry brzusznej. U niektórych królików na stronie brzusznej występuje również bardzo małe naczynie podskórne, które dostarcza krew do nie więcej niż jednej trzeciej skóry brzusznej. W przypadku otwartego okrężnego nacięcia skóry, z nacięcia brzusznego praktycznie nie występuje krwawienie.Przed przystąpieniem do procedury należy upewnić się, że królik nie reaguje na bodźce bólowe, sprawdzając odruch uciśnięcia palca oraz odruch oka, a następnie zabezpieczyć oczy zwierzęcia, nakładając maść ziarna sztucznych łez. Podczas operacji należy utrzymywać ciepłotę ciała królika za pomocą podkładki grzewczej. Następnie obie małżowiny uszne oraz skórę wokół nich należy oczyścić Betadyną i alkoholem, a następnie założyć pole operacyjne tak, aby odsłonięte pozostały jedynie oba uszy.Jedno ucho zostanie poddane niedokrwieniu, podczas gdy drugie będzie służyć jako kontrola. Instrumenty użyte podczas operacji to skalpel z ostrzem nr 15, dwie pary pęset – jedna do skóry, a druga do pozostałych tkanek miękkich. Trzy kleszczyki naczyniowe (mosquite), jedna lub dwie pary zakrzywionych mikronoareczek, jedna para małych nożyczek do przecinania szwów i twardych tkanek, igłotrzymacz oraz zestaw sterylizowanych wycinaków ze stali nierdzewnej.Operację rozpocznij od zidentyfikowania trzech szypuł naczyniowych na podstawie przebiegu tętnic i żył. Używając ostrza nr 15, wykonaj ostrożnie jedno pionowe nacięcie skóry na środkowej szypule naczyniowej.Wyizoluj żyłę główną z otaczających ją tkanek i zabezpiecz ją. Ten etap obejmuje otoczenie żyły głównej w celu jej odsunięcia.Uwolnij poprzez dysekcję nerw centralny. Zazwyczaj znajduje się on po stronie przyśrodkowej żyły. Nerw należy przeciąć nożyczkami.Wypreparuj tętnicę centralną. Zazwyczaj znajduje się ona po stronie kranialnej i głębiej niż żyła; podwiąż tętnicę, a następnie ją przetnij. Oczyść tkanki wokół żyły centralnej nad chrząstką małżowiny usznej.Drugie cięcie skóry wykonuje się nad wiązką naczyniowo-nerwową jajowodu. Aby zachować tę wiązkę, naczynia zostają wypreparowane i opatrzone pętlą w celu ich ochrony.Jest to szczególnie przydatne, gdy żyła jest duża, jak w przypadku tego królika. Wykonaj tunel pomiędzy tym miejscem a pierwszym nacięciem. Przetnij tkanki podskórne nad chrząstką.Trzecie nacięcie skóry wykonuje się nad pęczkiem czaszkowym. Cały pęczek zostaje podwiązany i oddzielony. Skóra nad trzecim pęczkiem zostaje przecięta.Żyła ta znajduje się bardzo blisko skóry, dlatego nie należy naciąć tkanek zbyt głęboko. Następnie cały pęczek naczyniowy zostaje wypreparowany, podwiązany i oddzielony. Za pomocą noża i nożyczek należy wykonać tunel podskórny.Trzy nacięcia przecinają wszystkie tkanki podskórne, mięśnie, nerwy i małe odgałęzienia naczyniowe. Należy zastosować dodatkowe rozcięcia ostre i tępe, aby oczyścić podstawę, pozostawiając odsłoniętą chrząstkę o szerokości około 5 do 10 milimetrów. Krwawienie można opanować poprzez ucisk gazikiem.Elektrokoagulacja nie jest konieczna. Skóra wewnątrz ucha nie jest nacinana, ponieważ nie jest silnie ukrwiona. Kluczowym aspektem tej procedury jest zapewnienie odpowiedniej preparacji tunelu podskórnego przy jednoczesnej ochronie naczyń krwionośnych.Procedura ta nie powinna być trudna. Po uzyskaniu hemostazy trzy nacięcia skóry zamyka się za pomocą szwów o rozmiarze 4-0 lub 5-0, a następnie ponownie sprawdza, czy nacięcia są prawidłowo zamknięte i czy nie występuje krwawienie. W celu przeprowadzenia testów leków na rany, na brzusznej stronie każdego ucha można wykonać cztery okrągłe rany pełnej grubości skóry za pomocą 6 mm stalowego biopsjera.Odległość między ranami wynosi co najmniej 20 do 30 milimetrów. Skórę oraz rozprzestrzeń chrząstki w obrębie otworu potrepanacyjnego usuwa się, dbając o to, aby nie uszkodzić chrząstki. Po wykonaniu ran w obu uszach należy tymczasowo przykryć je gazą i przenieść królika do pomieszczenia zabiegowego w celu aplikacji leku.Po oczyszczeniu ran z wszelkich skrzepów krwi, należy podać leki testowe oraz kontrolne. Rany pokrywa się opatrunkiem okluzyjnym, aby zapobiec wysychaniu. Przy porównywaniu dwóch leków, każdy z nich należy zastosować zarówno w ranie proksymalnej, jak i dystalnej.Pozwala to kontrolować różnice w tempie gojenia się ran w dystalnej i proksymalnej części ucha po operacji. Niedokrwione ucho zazwyczaj staje się chłodne i sinieje, z jednoczesnym zmniejszeniem czucia dystalnie od miejsca nacięcia. Przez kilka dni może wystąpić lekki obrzęk, który jednak ustępuje samoistnie i nie wymaga leczenia.Tętno w tętnicy głównej jest nieobecne. Ruchy małżowiny usznej są ograniczone, ale nie całkowicie zniesione, ponieważ niektóre mięśnie nadal są przytwierdzone do podstawy ucha. Jeśli tunel został wykonany prawidłowo, między nacięciami widoczne jest wyraźne wgłębienie.Plaster z fentanylem zostaje przyklejony do skóry pleców w celu uśmierzenia ewentualnego bólu pooperacyjnego. Temperatura skóry jest mierzona codziennie w każdym uchu za pomocą termometru. Krążenie krwi w uchu jest mierzone przy użyciu transkutaneousnego miernika napięcia tlenu lub laserowego dopplerowskiego miernika przepływu.Po tygodniu można usunąć szwy z nacięć skóry z 2007 roku. Procedura ta została zastosowana u ponad 70 królików. Obejmuje to 23 króliki z cukrzycą oraz cztery króliki w wieku podeszłym.Różnice temperatur pomiędzy uchem nie niedokrwionym a niedokrwionym mieściły się w przedziale od 1 do 10 °C, przy czym u większości królików wynosiły one od 2 do 6 °C. Różnica temperatur była wyższa w pierwszych dniach po operacji i stopniowo malała po 15. dniu, jednak była nadal utrzymywana po upływie jednego miesiąca. Z każdego ucha pobrano sześć próbek tkanek, a zawartość fosforanów wysokenergetycznych, zarówno TP, jak i energię całkowitą, zmierzono za pomocą metody HPLC.Stężenia były wyższe w uszach prawidłowych niż w uszach niedokrwionych. Czas gojenia ran był zawsze dłuższy w uchu niedokrwionym niż w uchu niedokrwionym u zwierząt niediabetycznych i diabetycznych w grupie 15 królików niediabetycznych. Średni czas gojenia wynosił 17,8 dnia w uchu niedokrwionym w porównaniu do 21,8 dnia w uchu niedokrwionym.U zwierząt z cukrzycą trwającą od 10 do 12 miesięcy średni czas gojenia wynosił 18,3 dnia w przypadku ucha nieischemicznego w porównaniu do 29,1 dnia w przypadku ucha ischemicznego. U wszystkich zwierząt, w tym u królików z cukrzycą, nacięcia skóry goiły się prawidłowo, bez żadnych powikłań. W przypadku cukrzycy trwającej 24 miesiące rany brzuszne wykazują większą tendencję do infekcji.Ta cecha sprawia, że model jest bardziej zbliżony do ludzkich ran cukrzycowych. Próbka histologiczna wykazuje gojenie tunelu podskórnego, w którym brakuje mięśnia, a jego miejsce zajmują tkanki włókniste. Jednakże skóra pozostaje nienaruszona.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o humanitarnym traktowaniu zwierząt. Po opanowaniu tej techniki zabieg można przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina. Zastosowaliśmy tę technikę u ponad 70 królików, w tym u 23 królików z cukrzycą, bez żadnych powikłań, takich jak krwawienie czy infekcja.Jest to bardzo bezpieczna procedura, jeśli postępuje się zgodnie z tym opisem. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania badawcze dotyczące np. wrzodów naczyniowych, odleżyn oraz neuropatii cukrzycowej, można zastosować inne metody, takie jak dodatkowe niedokrwienie, uszkodzenie nerwów i inokulacja bakteryjna.

a-simplified-technique-for-producing-an-ischemic-wound-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Uraz chirurgiczny wywołuje odpowiedź zapalną. Wiadomo, że cytokiny i ligandy endogenne modulują wielkość zawału mięśnia sercowego po niedokrwieniu i reperfuzji. Przedstawiamy zmodyfikowany model niedokrwienia i reperfuzji u myszy z zamkniętą klatką piersiową, wykorzystujący obciążniki wiszące w celu zminimalizowania efektów torakotomii.

Mysi model zamkniętoklatkowy niedokrwienia i reperfuzji mięśnia sercowego

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Przedstawione okno mysiej komory grzbietowego fałdu skórnego wizualizuje strefę ostrego, uporczywego niedokrwienia płata mięśniowo-skórnego. Przyżyciowa mikroskopia epifluorescencyjna pozwala na bezpośrednią i powtarzalną ocenę mikrokrążenia i ilościowe określenie hemodynamiki. Wyniki morfologiczne i hemodynamiczne można dodatkowo skorelować z analizami histologicznymi i molekularnymi.

Niedokrwienne uszkodzenie tkanki w grzbietowej komorze fałdu skórnego myszy: model płata skóry do badania ostrego uporczywego niedokrwienia

Podczas rozwoju ssaków, rany skóry na wczesnym etapie ciąży goją się bez blizny. Tutaj szczegółowo opisujemy wiarygodny i powtarzalny model gojenia się ran bez blizn płodu w grzbietu skóry zarodków myszy E16.5 (bez blizn) i E18.5 (bliznowaciejących).

Model skóry płodu myszy z gojeniem ran bez blizn

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Szczur, ze względu na swoje rozmiary, dostępność i raczej łagodne zachowanie, był wykorzystywany jako model badawczy przez wiele lat. Celem tego protokołu jest wykorzystanie szczura jako niedokrwiennego modelu gojenia się ran skóry, aby zapewnić cenny wgląd w patofizjologię ran przewlekłych.

Demonstracja modelu rany na skórze z niedokrwieniem skóry u szczura

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Ten protokół opisuje, jak generować obustronne rany wycinające o pełnej grubości u myszy oraz jak następnie monitorować, zbierać i przygotowywać rany do analizy morfometrycznej. Dołączono szczegółowy opis sposobu wykorzystania seryjnych odcinków histologicznych do definiowania, precyzyjnego określania ilościowego i wykrywania wad morfometrycznych.

Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

Ten artykuł demonstruje skuteczne podejście chirurgiczne do ustalenia ostrego niedokrwienia u myszy z małym nacięciem. Takie podejście może być stosowane przez większość grup badawczych bez konieczności modernizacji laboratoriów.

Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia

Przedstawiono uproszczony protokół do tworzenia modelu gojenia ran oparzeniowych u myszy za pomocą cyfrowego urządzenia grzewczego. Przypominające szachownicę miejsca eksperymentalne utworzone na skórze ułatwiają dalszą analizę funkcjonalną w teście gojenia się ran.

Szachownica gojącego rany po oparzeniach model myszy oparty na cyfrowym urządzeniu grzewczym

Opisano zostało szczurze modele rany skóry, które umożliwiają ocenę różnych środków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych lub patologicznych na różnych etapach procesu gojenia. Ponadto szczegółowo opisano protokół do wykonywania manualnej planimetrji w celu monitorowania szybkości kurczenia się rany w trakcie naprawy tkanki.

Model szczurzych ran chirurgicznych: podejście do badań nad gojeniem się ran i oceną biomateriałów

Naucz się uproszczonej techniki tworzenia modelu rany niedokrwiennej u królików, szczególnie z cukrzycą. Metoda małoinwazyjna z trzema nacięciami skórnymi umożliwia badanie gojenia ran w kontrolowany sposób.

Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

Przeglądaj więcej filmów