Name: Pomiary pojemności patch-clamp i obrazowanie Ca2+ na pojedynczych zakończeniach nerwowych w warstwach siatkówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę patch-clamp na pojedynczych zakończeniach nerwowych w siatkówce złotej rybki. Technika agarowych plasterków umożliwia badanie synaps wstążkowych i mikroobwodów siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Fredowi Rieke za uprzejme wyjaśnienia dotyczące przygotowania przekrojów siatkówki zatopionych w agarozie, gdy zaczęliśmy stosować ten protokół w naszym laboratorium. Dziękujemy również Lori Vaskalis za ilustrację schematu ogólnego oraz dr. Veeramuthu Balakrishnanowi i dr Soyoun Cho za pomocne uwagi do tekstu i filmu. Praca ta była finansowana z grantu NEI-NIH RO1, a także częściowo wspierana przez grant Korea Research Foundation finansowany przez rząd Korei [KRF-2008-357-E00032].

<ol><li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levodopa+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li>
<li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li>
<li>WHO. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Active+ageing%3A+a+policy+framework%22">Active ageing: a policy framework</a>. , (2002).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+disorders%3A+advances+in+cause+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).</li>
<li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson%27s+disease%3A+problems+with+the+current+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).</li>
<li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li>
<li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li>
<li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).</li>
<li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+molecular+snapshots+of+biochemical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li>
<li>Ljungdahl, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li>
<li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+directly+from+tissue%3A+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li>
<li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides%3A+3D+volume+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li>
<li>Deininger, S. -O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeininger%2C+S-O+%22Imaging+Mass+Spectrometry%22">Imaging Mass Spectrometry</a>. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).</li>
<li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li>
<li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+and+Graphical+Statistics%22%5BJournal%5D)">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li>
<li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+H+%22Mass+Spectrometry+Binning+Software+GAB%22">Mass Spectrometry Binning Software GAB</a>. , (2012).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Krytycznym i trudnym etapem naszego protokołu jest przeniesienie fragmentu siatkówki do roztworu agaru (protokół 3.4). Konieczne jest staranne usunięcie ciała szklistego oraz pozostałości roztworu do plastrów z fragmentu siatkówki i przeniesienie go bez deformacji lub zagięć. Aby to osiągnąć, używamy małej szpatułki (21-401-25B, Fisherbrand) z końcówką zagiętą pod kątem 90°, a także pęsety z zakrzywioną końcówką (11251-35, Fine Science Tools), aby pozycjonować fragment siatkówki w roztworze do plastrów p...

<table><tbody><tr><td>Agar o niskiej temperaturze żelowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td>Agaroza typu VII-A</td></tr><tr><td>Pipeta do patch-clamp</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150F-4</td><td>Grubościenne szkło borokrzemowe (średnica zewnętrzna 1,5 mm)</td></tr><tr><td>Pionowa wyciągarka</td><td>Narishige International</td><td>PP830</td><td></td></tr><tr><td>Wosk dentystyczny</td><td>Cavex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta z cienkim czubkiem pod kątem 45&amp;#x00B0;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Personna Medical Care</td><td></td><td>Dwustronna, oczyszczona 70% etanolem i H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Probówka cylindryczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338-1B</td><td>Polietylenowe fiolki na próbki 2,5 ml</td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Wibratom</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S lub VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw imersyjny wodny 60x</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUMPlanFl</td><td>NA 0,90</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Sony Corporation</td><td>XC-75</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler kamery</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>Monitor</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td>Monitor czarno-biały 13&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>0,2 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz lock-in</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td>Wzmacniacze EPC-9/10 posiadają emulację programową</td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop laserowy z dyskiem wirującym</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>Obrazowanie żywych komórek po rejestracji whole-cell metodą patch-clamp</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Slidebook</td><td>Intelligent Imaging Instruments (3i)</td><td></td><td>Pozyskiwanie i analiza danych obrazowania</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforu fosforanowego</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>Lasteczka Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Szkło przedmiotowe</td></tr><tr><td>Odczynniki przeciwwyblakaniowe</td><td>Biomeda corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td>Obrazowanie utrwalonej tkanki</td></tr><tr><td>Spatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25B</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny przecinacz pionowy</td><td>Narishige International</td><td>ST-20</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1</td><td>Invitrogen</td><td>O-6806</td><td>Fluorescencyjny barwnik czuły na Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hydrazyd Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-20501MP</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td></tr></tbody></table>

pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Bodźce wzrokowe są wykrywane i przekazywane w szerokim zakresie dynamicznym natężeń światła i zmian częstotliwości przez wyspecjalizowane neurony w siatkówce kręgowców. Dwie klasy neuronów siatkówki, fotoreceptory i komórki bipolarne, realizują to zadanie za pomocą aktywnych stref typu wstążkowego, które umożliwiają trwałe i wysokowydajne uwalnianie neuroprzekaźników przez długie okresy czasu. Zakończenia zmieszanych komórek bipolarnych typu ON (Mb) w siatkówce złotej rybki, które depolaryzują w odpowiedzi na bodźce świetlne i otrzymują sygnały od fotoreceptorów pręcikowych i czopkowych, są odpowiednie do badania synaps typu wstążkowego zarówno ze względu na swój duży rozmiar (~10-12 μm średnicy), jak i liczne boczne oraz wzajemne połączenia synaptyczne z dendrytami komórek amakrynowych. Bezpośredni dostęp do zakończeń komórek bipolarnych Mb w skrawkach siatkówki złotej rybki z wykorzystaniem techniki patch-clamp umożliwia pomiar presynaptycznych prądów Ca2+, zmian pojemności błony oraz wzajemnego hamowania synaptycznego zapśredniczonego przez receptory GABAA i GABAC ekspresjonowane na zakończeniach. Pomiary pojemności błony presynaptycznej podczas egzocytozy pozwalają na badanie krótkotrwałej plastyczności uwalniania pobudzających neuroprzekaźników 14,15. Ponadto, badając wzajemne hamowanie zwrotne docierające do zakończenia Mb, można badać krótkotrwałą i długotrwałą plastyczność uwalniania hamujących neuroprzekaźników z komórek amakrynowych 21. W krótkich odstępach czasu (np. ~10 s) GABA-ergiczne wzajemne hamowanie zwrotne z komórek amakrynowych ulega depresji parowej w wyniku wyczerpania puli pęcherzyków GABA 11. W ten sposób można bezpośrednio badać dynamikę synaptyczną mikroukładów siatkówki w wewnętrznej warstwie splotowej siatkówki.
Technika plastrów mózgu została wprowadzona ponad 40 lat temu, lecz nadal jest bardzo przydatna do badania właściwości elektrycznych neuronów, zarówno na poziomie pojedynczej somy komórkowej, pojedynczej dendryty lub aksonu, jak i na poziomie synaptycznym mikroobwodów 19. Tkanki zbyt małe, aby można je było przykleić bezpośrednio do komory do krojenia, są często najpierw zatapiane w agarze (lub umieszczane na papierze filtracyjnym), a następnie krojone 20, 23, 18, 9. W tym filmie stosujemy technikę wstępnego zatapiania w agarze z wykorzystaniem siatkówki złotej rybki. Niektóre zakończenia olbrzymich komórek bipolarnych w naszych plastrach siatkówki złotej rybki zostają aksotomizowane (przecięte w obrębie aksonu) podczas procedury krojenia. Pozwala nam to wyizolować wejścia pojedynczych presynaptycznych zakończeń nerwowych, ponieważ rejestracja z aksotomizowanych zakończeń wyklucza sygnały z przedziału somatyczno-dendrytycznego. Alternatywnie można również rejestrować sygnały z nienaruszonych komórek bipolarnych Mb, dokonując pomiarów z zakończeń przyłączonych do aksonów, które nie zostały przecięte podczas procedury krojenia. Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie tego protokołu eksperymentalnego pomoże w badaniach fizjologii synaptycznej siatkówki, funkcjonalnej analizie mikroobwodów oraz przekazywania synaptycznego w synapsach wstążkowych.

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Bodźce wizualne są wykrywane i przekazywane w szerokim zakresie dynamicznym natężeń światła oraz zmian częstotliwości przez wyspecjalizowane neurony u kręgowców...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie zatopionych w agarze przekrojów siatkówki do badania mikroukładów znajdujących się w zakończeniach presynaptycznych komórek dwubiegunowych. Osiąga się to poprzez pobranie siatkówki z oka złotej rybki zaadaptowanego do ciemności i wycięcie z niej niewielkiego prostokątnego fragmentu. Fragment siatkówki jest następnie zanurzany w przezroczystym roztworze agaru o niskiej temperaturze topnienia, który następnie utwardza się w odpowiednio schłodzonym roztworze do przygotowania przekrojów.Kolejnym krokiem jest pocięcie stałego bloku agaru zawierającego prostokątny fragment siatkówki przy użyciu wibrotomu. Ostatnim etapem jest wizualizacja, identyfikacja i uszczelnienie (patch-clamp). Przymocuj zakończenie nerwowe komórki bipolarnej.Ostatecznie wyniki przedstawiają presynaptyczny prąd wapniowy oraz synaptyczną egzocytozę fizyczną z pomiarami pojemności błony z atomizowanych i nienaruszonych zakończeń komórek dwubiegunowych. Cześć, nazywam się Han Kim. Jestem postdokiem w laboratorium PCO w Instytucie Burham.Dzisiaj przedstawię metodę przygotowania plastrów siatkówki przedniej części oka w systemie AGA oraz zademonstruję pomiar pojemności metodą patch clamp w pojedynczym kanale. Aby rozpocząć tę procedurę, należy podzielić każde oko złotej rybki na pół, wykonując równomierne cięcie wokół przedniej części oka za pomocą nożyczek sprężynowych. Następnie oczka należy umieścić w schłodzonym roztworze do wycinania plastrów, pozbawionym wapnia.W razie potrzeby usunąć soczewkę za pomocą pęsety. Następnie usunąć nabłonek barwnikowy przytwierdzony do siatkówki, oddzielając siatkówkę od kielicha oka za pomocą pęsety precyzyjnej z końcówką pod kątem 45 stopni. Po tym etapie przeciąć nerw wzrokowy, używając pęsety precyzyjnej lub nożyczek sprężynowych.Następnie zastosuj ssanie za pomocą zmodyfikowanej pipety Pasteura lub dużej pipety transferowej. Aby usunąć siatkówkę, delikatnie usuń pozostałą część nabłonka pigmentowego przytwierdzonego do siatkówki. Powierzchnia oczyszczonej i zdrowej siatkówki powinna być gładka.Następnie wyizolowaną siatkówkę inkubuje się w roztworze IDE o stężeniu około 0,03% przez 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że procedura usuwania ciała szklistego powinna być przeprowadzona przy słabym oświetleniu. W kolejnym kroku, za pomocą żyletki, wycina się prostokątny fragment siatkówki o wymiarach około dwóch na dwa milimetry, usuwając zakrzywione krawędzie tak, aby zachować pełną grubość siatkówki.Następnie przenieś fragment siatkówki do małego pojemnika wypełnionego roztworem agaru, starając się zminimalizować ilość roztworu wokół siatkówki podczas jej umieszczania w płynnym agarze. Następnie zanurz siatkówkę z agarem bezpośrednio w lodowatym roztworze do skrawkowania, aby agar stężał. W kolejnym kroku wytnij z litego bloku agaru zawierającego prostokątny fragment siatkówki sześcian o wymiarach jeden na jeden na jeden centymetr.Przyklej blok do powierzchni płytki tnącej w komorze do cięcia wstępnego. Następnie potnij blok na plastry o grubości od 200 do 250 mikronów w lodowatym roztworze do cięcia. Przy użyciu wibrotomu można uzyskać łącznie od pięciu do 10 plastrów, które pozostają żywotne przez około pięć do sześciu godzin.Następnie przenieś jeden z przekrojów do komory rejestracyjnej. Umieść na wierzchu przekroju platynową ramkę w kształcie litery U z siatką nylonowych nici. Płucz przekrój w sposób ciągły z szybkością od 1 do 2 ml/min roztworem rejestracyjnym napowietrzanym karbogenem.Na tym etapie należy użyć strzykawki z końcówką z filtrem 0,2 µm, aby napełnić szklaną pipetę do patch-clampu roztworem wewnętrznym do poziomu jednego lub dwóch centymetrów od tylnej części pipety. Następnie należy usunąć pęcherzyki powietrza z końcówki. Pipetę należy przymocować w uchwycie.Wywieraj dodatnie ciśnienie w pipecie i przesuń ją w stronę docelowego zakończenia za pomocą mikromanipulatora, przesuwając końcówkę w dół przez skibkę. Przesuwaj pipetę w kierunku bocznym, wykonując ruch zamiatania, aby upewnić się, że skibka nie jest przeciągana wraz z końcówką. Następnie przesuwaj końcówkę pipety wokół zakończenia, aby oczyścić powierzchnię błony.Przesunąć końcówkę w dół, dociskając ją do krawędzi terminala, aby utworzyć wgłębienie, a następnie zwolnić ciśnienie dodatnie. Jeśli uszczelnienie gigaohmowe nie powstanie natychmiast, zastosować w pipecie lekkie ciśnienie ujemne. Po uzyskaniu uszczelnienia gigaohmowego przełączyć wzmacniacz patch-clamp EPC-9 w tryb zapisu onsell i zmienić potencjał podtrzymujący na -60 lub -70 mV.Zastosuj szybką korekcję pojemności i poczekaj, aż rezystancja uszczelnienia ustabilizuje się w przedziale od 5 do 10 GΩ. Następnie przerwij błonę za pomocą krótkiego, delikatnego ssania, aby ustanowić konfigurację rejestracji z całej komórki.Można również zastosować ssanie ustne zamiast strzykawki. Po ustanowieniu konfiguracji całokomórkowej na atomizowanym terminalu MB, należy zastosować 200 milisekundowy skok depolaryzacji od minus 70 do zera miliwoltów. Należy pamiętać, że przed i po tej depolaryzacji w trybie clampera napięciowego stosowana jest fala sinusoidalna o częstotliwości dwóch kilohertzów. W celu pomiaru pojemności błonowej depolaryzacja umożliwia bezpośredni pomiar wewnątrzkomórkowych prądów wapniowych aktywowanych przez otwarcie napięciowo zależnych kanałów wapniowych typu L przy użyciu wewnętrznego roztworu opartego na cezie.Równolegle można monitorować skok pojemności spowodowany zależną od wapnia egzocytozą pęcherzyków synaptycznych, co zwiększa powierzchnię błony. Jeśli w nienaruszonej komórce bipolarnej MB zastosuje się metodę patch-clamp z pipetą na terminalu synaptycznym, nie zaobserwuje się wyraźnych prądów wapniowych ze względu na duże prądy upływu wynikające z sprzężenia poprzez połączenia szczelinowe w obrębie komórek bipolarnych MB. To, co się obserwuje, to duży prąd zewnętrzny o charakterze prądu upływu.Można jednak nadal monitorować skok pojemności za pomocą wysokoczęstotliwościowego bodźca sinusoidalnego aktywowanego przed i po pokazanym kroku depolaryzacyjnym. Oto przykłady I-R-D-I-C, obrazy zakończeń komórek bipolarnych M. Nienaruszone zakończenia częściej mają kształt eliptyczny, jak pokazano w A i B, podczas gdy C przedstawia zakończenie zmodyfikowane, które ma kształt okrągły.Metoda wypełniania barwnikiem może być również wykorzystana do klasyfikacji zakończeń komórkowych. Przedstawiono tutaj przykłady obrazów fluorescencyjnych zakończeń komórek bipolarnych MBI z nienaruszonym aksonem w D, częściowo przeciętym aksonem w e oraz całkowicie usuniętym aksonem w F. Ich teria są wskazane niebieskimi strzałkami. Przedstawiono tutaj bezpośrednie pomiary sygnałów obrazowania wapnia podczas egzocytozy i sprzężenia zwrotnego hamującego.W terminalu komórki bipolarnej MB, przejściowy wzrost stężenia wapnia w telerii terminala MB został aktywowany przez skokową depolaryzację metodą voltage clamp; odpowiadający jej obraz fluorescencyjny telerii MB widoczny jest w B. Przykłady krótkotrwałej depresji synaptycznej uwalniania neuroprzekaźnika przedstawiono w C. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zminimalizować ilość roztworu wokół siatkówki podczas jej umieszczania w agarze zestawu. Poprawi to przyleganie preparatu do bloku agarowego.

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pomiary pojemności metodą patch-clamp i obrazowanie Ca2+ na pojedynczych zakończeniach nerwowych w krohach siatkówki

Prezentujemy podstawowe techniki rejestracji metodą patch clamp z błony presynaptycznej w kielichu Held (calyx of Held), który jest zakończeniem nerwowym w centralnym układzie nerwowym ssaków.

Metody pomiarów pojemności metodą patch-clamp w kaliksie

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Ten film demonstruje technikę całokomórkowego patch-clamp do elektrofizjologicznego zapisu z płaskiej siatkówki myszy. Cienka szklana pipeta z elektrodą służy do zbliżania się do gwiazdotwórczych komórek amakrynowych (SAC) w siatkówce. Po uformowaniu uszczelki stosuje się ssanie w celu pęknięcia membrany i utworzenia konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. Na koniec mierzy się przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC za pomocą konfiguracji.

Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Ten film demonstruje procedurę mapowania połączeń synaptycznych poprzez zabezpieczenie wycinka mózgu, ustawienie pipet w celu uzyskania konfiguracji całych komórek i stymulowanie neuronów presynaptycznych do rejestrowania odpowiedzi postsynaptycznych, wyjaśniając w ten sposób łączność neuronalną.

Zapis sparowanych połączeń neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Po usunięciu z organizmu, tkanka neuronalna jest bardzo podatna na wpływ warunków środowiskowych, co prowadzi do ostatecznej degradacji tkanki po 6 - 8 godzinach. Dzięki unikalnej metodzie inkubacji, która ściśle monitoruje i reguluje zewnątrzkomórkowe środowisko tkanki, żywotność tkanek może być znacznie przedłużona przez &gt;24 godziny.

Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu zawierających jądro kolankowate boczne oraz badania elektrofizjologicznego funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych. Protokół ten zapewnia skuteczny sposób badania synaps z wysokim i niskim prawdopodobieństwem uwalniania w tych samych ostrych wycinkach mózgu.

Badania elektrofizjologiczne funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

Poznaj metodę patch-clamp na pojedynczych zakończeniach nerwowych w siatkówce złotej rybki. Technika agarowych plasterków umożliwia badanie synaps wstążkowych i mikroobwodów siatkówki.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca²⁺ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Przeglądaj więcej filmów