Pomiary pojemności patch-clamp i obrazowanie Ca2+ na pojedynczych zakończeniach nerwowych w warstwach siatkówki
19 stycznia 2012
Tutaj opisujemy protokół przygotowania plastrów siatkówki z zatopionymi w agaracie, które są odpowiednie do elektrofizjologii i obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstęgowych w mikroukładach siatkówki za pomocą bezpośrednich zapisów patch-clamp pojedynczych presynaptycznych zakończeń nerwowych.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie wycinków siatkówki z zatopionym w agarze do badania mikroobwodów zlokalizowanych w presynaptycznych zakończeniach nerwowych komórek dwubiegunowych. Osiąga się to poprzez najpierw uzyskanie siatkówki z ciemnego, przystosowanego oka złotej rybki i wycięcie małego prostokątnego kawałka tej siatkówki. Kawałek siatkówki jest następnie zanurzany w przezroczystym roztworze agaru o niskiej temperaturze topnienia, który jest następnie zestalany w ładnym roztworze na zimno.
Następnym krokiem jest pokrojenie stałego bloku agaru zawierającego prostokątny kawałek siatkówki za pomocą wibratora. Ostatnim krokiem jest wizualizacja, identyfikacja i łatanie. Zacisnąć zakończenie nerwowe komórki dwubiegunowej.
Ostatecznie wyniki pokazują presynaptyczny prąd wapnia i synaptyczną egzocytozę fizyczną z pomiarami pojemności błony z zatomizowanych i nienaruszonych dwubiegunowych zakończeń komórek. Cześć, nazywam się Han Kim. Jestem stażystą podoktorskim w PCO w laboratorium w Burham Institute.
Dzisiaj przedstawię AGA embedded slice preparation zimnej siatkówki twarzy i zademonstruję pomiar pojemności zacisku plastra przy jednym rurociągu. Aby rozpocząć tę procedurę, obszyj każde oko złotej rybki, przecinając równomiernie wokół przedniej części oka nożyczkami sprężynowymi. Następnie umieść muszle oczne w schłodzonym roztworze plastrów bez wapnia.
W razie potrzeby zdejmij obiektyw pęsetą. Następnie usuń nabłonek pigmentowy przyczepiony do siatkówki, odklejając siatkówkę od muszli ocznej za pomocą pary cienkich kleszczyków pod kątem 45 stopni. Następnie przetnij nerw wzrokowy za pomocą cienkich kleszczy lub nożyczek sprężynowych.
Następnie zastosuj odsysanie za pomocą zmodyfikowanej pipety do makaronu lub pipety do przenoszenia z dużą końcówką. Aby usunąć siatkówkę, delikatnie usuń resztę nabłonka barwnikowego przyczepionego do siatkówki. Powierzchnia oczyszczonej i zdrowej siatkówki powinna wydawać się gładka.
Następnie należy traktować izolowaną siatkówkę o około 0,03% wyższym IDE przez 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej. Aby usunąć ciało szkliste, należy pamiętać, że zabieg należy wykonywać w słabym świetle. W następnym kroku wytnij prostokątny kawałek siatkówki o wymiarach około dwa na dwa milimetry, który zawiera całą grubość siatkówki, usuwając zakrzywione krawędzie żyletką.
Następnie przenieś kawałek siatkówki do małego pojemnika wypełnionego roztworem agaru i staraj się zminimalizować ilość roztworu wokół siatkówki, gdy jest on umieszczany w płynnym agarze . Następnie zanurz siatkówkę z agarem bezpośrednio w lodowatym roztworze plastrów w celu zestalenia agaru. Następnie pokrój stały blok agaru zawierający prostokątny kawałek siatkówki na sześcian jeden po drugim centymetr
.Przyklej blok do powierzchni płytki do krojenia w komorze na plastry preco. Następnie pokrój blok na plasterki o grubości od 200 do 250 mikronów w lodowatym roztworze plastrów. Za pomocą vibrato można uzyskać w sumie od pięciu do 10 plasterków, które są żywotne przez około pięć do sześciu godzin.
Następnie przenieś jeden z plastrów do komory nagrywania. Umieść platynową ramkę w kształcie litery U z siatką nylonowych nici na wierzchu plasterka. Perfekować plasterek w sposób ciągły z szybkością od jednego do dwóch mililitrów na minutę za pomocą roztworu rejestrującego z bąbelkami karbogenu.
Na tym etapie użyj strzykawki z końcówką filtrującą 0,2 mikrona, aby napełnić szklaną pipetę z plastrem roztworem wewnętrznym do poziomu od jednego do dwóch centymetrów od tyłu pipety. Następnie usuń pęcherzyki powietrza z końcówki. Zamocuj pipetę w uchwycie.
Zastosuj nadciśnienie do pipety i przesuń ją w kierunku docelowego terminala za pomocą mikromanipulatora, przesuwając końcówkę w dół przez plasterek. Przesuń pipetę w bocznym kierunku zamiatania, aby upewnić się, że plasterek nie jest ciągnięty razem z końcówką. Następnie przesuń końcówkę pipety po końcówce, aby oczyścić powierzchnię membrany.
Dociśnij końcówkę w dół do krawędzi terminala, aby utworzyć wgłębienie i zwolnić nadciśnienie. Jeśli uszczelka gigaomowa nie zostanie utworzona, natychmiast zastosuj lekkie podciśnienie do pipety. Po utworzeniu uszczelki giga omów przełącz wzmacniacz E PC z dziewięcioma patch clampami w tryb nagrywania onsell i zmień potencjał podtrzymania na minus 60 lub minus 70 miliwoltów.
Zastosuj szybką korekcję pojemności i poczekaj, aż uszczelka ustabilizuje się w zakresie od pięciu do 10 gigaomów. Następnie rozerwij membranę ostrym, delikatnym ssaniem. Aby ustalić konfigurację nagrywania całej komórki.
Możesz również użyć ssania do ust zamiast strzykawki. Po ustaleniu całej konfiguracji ogniwa na zatomizowanym terminalu MB, zastosuj depolaryzację w kroku 200 milisekund od minus 70 do zera miliwoltów. Pamiętaj, że dwukilohercowa fala sinusoidalna w trybie cęgów napięciowych jest stosowana przed i po tej depolaryzacji W celu pomiaru pojemności membrany, depolaryzacja umożliwia bezpośredni pomiar wewnętrznych prądów wapniowych aktywowanych przez otwarcie kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu L za pomocą roztworu wewnętrznego na bazie cezu.
Równolegle można monitorować skok pojemności spowodowany zależną od wapnia egzocytozą pęcherzyków synaptycznych, która zwiększa powierzchnię błony. Jeśli nienaruszona komórka dwubiegunowa MB zostanie załatana pipetą na końcu synaptycznym, nie będzie można zaobserwować dostrzegalnych prądów wapniowych z powodu dużych prądów upływowych spowodowanych sprzężeniem złącza szczelinowego w prawach do komórek bipolarnych MB. To, co można zaobserwować, to duży wyciek na zewnątrz, podobny do prądu.
Jednak nadal można monitorować skok pojemności za pomocą sinusoidalnego bodźca o wysokiej częstotliwości aktywowanego przed i po pokazanym kroku depolaryzacji. Oto przykłady I-R-D-I-C, obrazy dwubiegunowych końców komórek M. Nienaruszone zaciski z większym prawdopodobieństwem będą wyglądać na eliptyczne, jak pokazano na A i B, podczas gdy C pokazuje połączony zacisk, który wydaje się okrągły i okrągły.
Metoda napełniania barwnikiem może być również stosowana do klasyfikowania końców komórek. Oto przykłady obrazów fluorescencyjnych dwubiegunowych zakończeń komórek MBI z nienaruszonym aksonem w D, częściowo przeciętym aksonem w e i całkowicie usuniętym aksonem w F. Ich teria jest oznaczona niebieskimi strzałkami. Tutaj przedstawiono bezpośrednie pomiary sygnałów obrazowania wapnia, egzocytozy i hamującego sprzężenia zwrotnego.
W dwubiegunowym terminalu komórkowym MB przejściowy wzrost stężenia wapnia w telerii terminala MB został aktywowany przez depolaryzację krokową zacisku napięcia w odpowiednim obrazie fluorescencyjnym telerii MB można zobaczyć w B. Przykłady krótkotrwałej depresji synaptycznej uwalniania neuroprzekaźników pokazano w C. Podczas próby tej procedury, Ważne jest, aby pamiętać o zminimalizowaniu ilości roztworu wokół siatkówki podczas umieszczania go w agarze z zestawem. Poprawi to przyczepność zlatynizowanego z bloku agaru.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół przygotowania zatopionych w agarze skrawków siatkówki, odpowiednich do badania mikroobwodów w presynaptycznych zakończeniach nerwowych komórek dwubiegunowych. Metoda ta umożliwia bezpośrednie rejestracje patch-clamp z pojedynczych presynaptycznych zakończeń nerwowych, co ułatwia badanie synaps wstążkowych w obwodach siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Mikrouobwody siatkówki odgrywają kluczową rolę w przetwarzaniu bodźców wzrokowych.
- Zrozumienie mechanizmów synaptycznych jest niezbędne dla badań w dziedzinie neuronauk.
- Zatapianie w agarze zapewnia wsparcie strukturalne dla cienkich przekrojów.
- Techniki patch-clamp umożliwiają precyzyjne pomiary elektryczne.
Cel badania
- Przygotowanie przekrojów siatkówki do analizy elektrofizjologicznej.
- Badanie funkcji synaps wstążkowych.
- Pogłębienie wiedzy na temat dynamiki mikroobwodów siatkówki.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie siatkówki z oczu złotej rybki zaadaptowanych do ciemności.
- Zatapianie fragmentów siatkówki w agarze o niskiej temperaturze topnienia.
- Krojenie utwardzonego bloku agaru za pomocą wibrotomu.
- Wizualizacja i rejestracja metodą patch-clamp zakończeń nerwowych komórek dwubiegunowych.
Główne wyniki
- Pomyślne przygotowanie przekrojów siatkówki zatopionych w agarze.
- Wykazanie możliwości bezpośrednich rejestracji metodą patch-clamp.
- Identyfikacja synaps wstążkowych w obwodach siatkówki.
- Metoda umożliwia szczegółowe badanie funkcji synaptycznych.
Wnioski
- Protokół dostarcza wiarygodnej metody badania mikroukładów siatkówki.
- Bezpośrednie rejestracje patch-clamp mogą ujawnić dynamikę synaptyczną.
- Podejście to może przyczynić się do rozwoju badań w dziedzinie neuronauki wzroku.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie w przemyśle
Niniejszy protokół umożliwia bezpośrednią analizę elektrofizjologiczną i optyczną presynaptycznych zakończeń nerwowych w mikroobwodach siatkówki, co wspiera mechaniczną weryfikację celów synaptycznych zaangażowanych w przetwarzanie sygnałów wizualnych. Poprzez kwantyfikację zależnej od wapnia egzocytozy oraz hamującego sprzężenia zwrotnego w synapsach wstążkowych, metoda ta zapewnia wiarygodność predykcyjną w walidacji celów dla programów badawczych w dziedzinie neuronauki. Podejście to odnosi się do kluczowego punktu zwrotnego we wczesnej fazie odkryć, w której funkcjonalna walidacja mechanizmów presynaptycznych determinuje decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac nad rozwojem modulatorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar prądów wapniowych w terminalach presynaptycznych oraz zmian pojemności związanych z egzocytozą pęcherzyków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną ocenę ryzyka w zakresie funkcji synaps wstęgowych dzięki bezpośredniemu dostępowi do izolowanych zakończeń nerwowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu badawczym poprzez kwantyfikację krótkotrwałej plastyczności uwalniania neurotransmiterów pobudzających i hamujących.
Przesiewanie i opracowywanie analiz
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszego przesiewu związków poprzez stabilizację skrawków siatkówki do elektrofizjologii i obrazowania.
- Wyniki ilościowe: Generowanie powtarzalnych odczytów pojemności błonowej oraz obrazowania wapnia, umożliwiających porównanie efektów działania związków.
- Skalowalność: Możliwość ponownego wykorzystania platformy w wielu terminalach na jeden skrawek, co zwiększa przepustowość badań nad mechanizmami synaptycznymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Jest zgodne z modelami neurodegeneracyjnych chorób siatkówki, w których dysfunkcja synaptyczna poprzedza utratę komórek.
- Ciągłość translacyjna: Łączy fazę odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie natywnej architektury mikroobwodów w skrawkach zatopionych w agarze.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o skuteczności modulatorów poprzez rejestrację dynamiki wzajemnego hamowania zwrotnego komórek amacrynowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania nowych leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, zapewniając funkcjonalne odczyty aktywności presynaptycznej w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów presynaptycznych poprzez bezpośredni pomiar napływu wapnia i egzocytozy.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu przygotowaniu skrawków i stabilnemu dostępowi do zakończeń dla powtarzalnych rejestracji.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie warunków z wykorzystaniem skoków pojemności błony oraz obrazowania wapnia jako zmiennych zależnych.
- Badania translacyjne: Zachowuje ciągłość przedkliniczną poprzez utrzymanie mikroobwodów synaptycznych w skrawkach siatkówki do badań podłużnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody do badania funkcji synaptycznej w wielu sesjach eksperymentalnych z jednego preparatu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w sygnalizacji presynaptycznej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym procedurom zatapiania w agarze i przygotowywania skrawków.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie ilościowych danych na temat plastyczności synaptycznej i hamowania zwrotnego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków modulujących presynaptyczne kanały wapniowe lub mechanizmy uwalniania pęcherzyków w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii patch-clamp oraz technik obrazowania wapniowego.
- Zależy od dostępności wibrotomu oraz agaru o niskiej temperaturze topnienia w celu stabilizacji tkanki.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnej jakości skrawków i identyfikacji zakończeń.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy przenoszeniu metody do innych systemów modelowych o różnej architekturze synaptycznej.
- Ograniczone przez okno żywotności tkanki wynoszące 5–6 godzin po wykonaniu skrawków, co wymaga przeprowadzenia eksperymentu w tym samym dniu.
